Вход в личный кабинет | Регистрация
Избранное (0) Список сравнения (0)
Ваши покупки:
0 товаров на 0 Р
Итого: 0 Р Купить

Аргинин аминокислота свойства: L-аргинин с точки зрения доказательной медицины

Содержание

Что нужно знать об аминокислоте L-аргинин: полезные свойства, рекомендации по использованию

L-аргинин – аминокислота, с которой знакомы многие спортсмены. Она является донатором азота, важна для многих процессов, происходящих в организме. Повышает выносливость и улучшает результаты тренировок. А чем ещё полезна добавка и в каких случаях её нужно принимать, расскажем дальше. 

Полезные свойства аргинина

Аминокислота L-аргинин обладает следующими полезными свойствами:
  • Стимулирует кровообращение. Она преобразуется в оксид азота и способствует расширению сосудов, улучшает работу сердца.
  • Помогает развивать мышечную массу. При этом аминокислота препятствует накоплению жировых отложений.
  • Активизирует процесс заживления переломов и ран.
  • Приводит в норму артериальное давление за счет расслабления сосудистых стенок.
  • Является антиоксидантом. Успешно борется со свободными радикалами.
  • Повышает иммунитет. Улучшает работу иммунной системы и обеспечивает высокую сопротивляемость организма.
  • Благоприятно влияет на нервную деятельность. Ускоряет передачу нервных импульсов в головном мозге, стимулирует умственную деятельность.
  • Снимает тревожность. Участвует в продукции серотонина, который регулирует настроение.
  • Устраняет эректильную дисфункцию у мужчин. Улучшает кровоток в мужских половых органах и усиливает эрекцию.
  • Разжижает кровь, уменьшает ее вязкость.
  • Эта добавка оказывает полезное действие на организм спортсменов и людей с различными заболеваниями.

    Варианты использования

    L-аргинин можно принимать с разной целью. Аргинин для похудения Добавка стимулирует жировой обмен и способствует снижению веса. Если соблюдать правила приема, можно сбросить вес за короткий срок. Лишний жир будет сжигаться, но при этом будет стимулироваться набор мышечной массы. Аргинин для роста мышц Аминокислота стимулирует рост мышц у человека, а также ускоряет метаболизм. Именно поэтому она полезна для бодибилдеров и обязательно должна быть включена в питание для набора мышечной массы. Рост мышц обеспечивается несколькими факторами:

  • Наличием аминокислот в миоплазме, которые являются материалом для строительства белковой ткани.
  • Наличием глюкозы – источника энергии для наращивания мышц.
  • Обеспечением доступа к ядру анаболических гормонов.
  • Все эти вещества присутствуют в крови. Их недостаточное поступление в межклеточную жидкость сдерживает рост мышц. Если улучшить кровоток к целевой мышце, то повысится и доступ к ней аминокислот. Для улучшения кровотока требуется расширение сосудов. В этом как раз и помогает аргинин. Аргинин для сердца При попадании в организм он превращается в оксид азота (сильнейший нейротрансмиттер). Улучшает кровообращение и расслабляет кровеносные сосуды.  Поэтому аргинин способствует нормальному кровотоку в сердечных артериях, предотвращает их закупорку. Его длительное употребление способно снизить холестерин и улучшить функционирование сердца. Также добавка уменьшает симптомы стенокардии, ишемической болезни сердца, снижает кровяное давление. Однако её использование после сердечного приступа может только усугубить ситуацию. Аргинин при беременности Показан при беременности лишь в особых обстоятельствах. Лечащий врач должен самостоятельно установить дозу препарата. Наиболее часто добавка выписывается при наличии риска ограничения роста внутри утробы и преэклампсии. В исследованиях сказано, что добавка может оказать положительное воздействие на течение беременности. Она благотворно влияет на развитие плода. Это объясняется тем, что в процессе беременности материнский организм намного больше нуждается в аминокислоте. Полностью удовлетворить потребность можно, только употребляя большое количество белковой пищи, в т.ч. специальные добавки.  Аргинин облегчает состояние при токсикозе. Но не забывайте, что любые препараты беременной женщине должен назначать только врач.

    Аргинин для мужчин

    Аргинин при бесплодии Л-аргинин важен для нормальной работы женского организма. У молодого и здорового человека он продуцируется в нормальном объеме. Но из-за различных болезней и с возрастом его синтез может уменьшаться. Также полезен для женщин, имеющих тонкий эндометрий. Если толщина эндометрия небольшая, эмбрион не сможет к нему присоединиться, и беременности не случится. Аминокислота помогает в этой ситуации за счет улучшения кровотока в малом тазу. Аргинин полезен и женщинам, имеющим нарушения в работе половой системы из-за невысокой двигательной активности. Л-аргинин улучшает тонус сосудов, нормализует кровоток, уменьшает застойные явления в тазовых органах. Аргинин не только в целом положительно влияет на здоровье мужчины, но и выполняет две важные функции: стимулирует рост мышечной массы и улучшает потенцию. Поэтому с возрастом аргинин требуется мужскому организму все больше. Аргинин нормализует работу предстательной железы, улучшает выработку тестостерона, стимулирует кровообращение в половых органах. Также он уменьшает тревожность и повышает либидо. Часто аргинин используют для лечения мужского бесплодия.

    Аргинин для женщин

    Помимо нормализации работы женской репродуктивной системы, добавка помогает сохранить естественную красоту, бороться с депрессией. Она стимулирует синтез коллагена, положительно сказывается на внешнем виде кожи и волос, способствует заживлению тканей, способствует выведению токсинов и омоложению организма.

    Аргинин для спортсменов

    Добавка рекомендована при интенсивных занятиях спортом. Она повышает выносливость и ускоряет восстановление после серьезных нагрузок. Питание для набора мышечной массы обязательно должно включать в себя эту аминокислоту. Аргинин дает следующие преимущества спортсменам:

  • Позволяет улучшить качество тренировок.
  • Улучшает выносливость.
  • Обеспечивает лучшие результаты во время сушки.
  • Способствует наращиванию мышечной массы.
  • Повышает иммунитет и нормализует работу сердца.
  • Ускоряет синтез гормона роста, тестостерона.
  • Улучшает производство гормонов, приводящих организм в тонус.
  • Уменьшает стресс и предотвращает перетренированность.
  • Как принимать аргинин

    В сутки взрослому человеку требуется не больше 3 грамм добавки. Аргинин в виде капсул и таблеток принимают 2 или 3 раза в день в зависимости от рекомендуемой дозы. Порошок следует разводить в воде, пить полученную смесь рекомендуется по 5 мл 3 раза в день. Принимается за 1 ч до или после еды. Если в рационе имеются блюда с высокой жирностью, принимать добавку следует спустя 3-5 ч после приема пищи. Ведь аминокислота плохо совместима с жирными продуктами. Спортсмены пьют аргинин за 30 минут до тренировки. Также для улучшения выработки гормона роста его следует принимать вечером. Длительность курса составляет от 2 недель до 1 месяца.

    Лучший аргинин: рейтинг 2021

    Ниже мы предоставили обзор лучшего аргинина. Любую из перечисленных добавок вы можете приобрести в нашем интернет-магазине BBR. Now Foods L-аргинин Американская компания Now Foods утверждает, что аргинин, который она производит, имеет фармацевтический уровень чистоты. Среди преимуществ добавки двойная концентрация аминокислоты и снижение утомляемости после тренировок. BioTech USA L-Arginine Добавка изготовлена на основе безопасных и тщательно отобранных ингредиентов. Выпускается в капсулах и в порошке. В одной порции содержится высокая дозировка аргинина.  Препарат имеет высокую биологическую ценность и отличается комплексным действием. В составе отсутствуют бесполезные компоненты. ALLMAX Nutrition Arginine HCI Это ультра-чистый порошок, имеющий медицинский уровень чистоты. Он обладает высокой степенью усвояемости. В составе отсутствует глютен.  При создании добавки производитель использует гидрохлорид — форму аргинина, имеющую максимальную стабильность и повышенную растворимость.  Arginine 1000 OstroVit Препарат изготовлен на основе высококачественного L-аргинина. Начинает действовать спустя 15 минут после приема. Подходит для спортсменов-бодибилдеров любого уровня подготовки.  Progress Nutrition L-Arginine  Добавка создана на основе аминокислоты премиального качества. Выпускается в виде капсул в оболочке на основе растительного желатина. Не имеет вкуса и запаха. Прекрасно усваивается организмом и не вызывает раздражения ЖКТ.

    Все о аргинине и его свойствах

    Аргинин улучшает состояние кожи и волос, способствует похудению, повышает выносливость. Узнайте, как и в каких дозировках его правильно принимать. 

    В наши дни прием пищевых добавок стал обычным делом. 

    Рост информированности при одновременном увеличении рабочих часов не оставляет современному поколению иного выбора, кроме как принимать растительные препараты и пищевые добавки для поддержания здоровья на оптимальном уровне. Таблетки есть для всего — для сердца и сосудов, для развития головного мозга, для чего угодно. Но что, если я скажу, что существуют и волшебные таблетки для похудения? 

    Заинтересованы? Читайте дальше, и вы узнаете больше о волшебных таблетках, которые называются L-аргинин! 

    Аргинин: общая информация

    Полезные свойства аргинина для кожи, волос и здоровья!

    Аргинин, также известный как L-аргинин, является заменимой аминокислотой. Это значит, что значительное количество аргинина синтезируется в человеческом организме, и получать его исключительно из пищи нет необходимости. 

    Тогда зачем нужны пищевые добавки с L-аргинином? 

    Хотя аргинин относится к заменимым аминокислотам, в определенных ситуациях организм не может производить его в необходимом количестве, например, во время болезни. Кроме того, синтез аргинина сильно зависит от возраста, пола, образа жизни, вредных привычек (курение, прием алкоголя), наличия очагов хронического воспаления, общего состояния организма и сердечно-сосудистой системы, диеты и генетических особенностей. Маленькие дети и младенцы не в состоянии вырабатывать эту аминокислоту. С возрастом ее синтез также замедляется. Вот почему прием аргинина в виде пищевых добавок часто рекомендуют пожилым людям. 

    Аргинин очень важен для поддержания здоровья печени и укрепления иммунной системы. Он усиливает синтез коллагена в организме, что ускоряет процесс заживления ран. Аргинин необходим для обмена веществ в мышцах, и он форсирует снижение массы тела за счет уменьшения процента жировой ткани. Также его используют при лечении бесплодия у мужчин. 

    И это не все. 

    При многих проблемах с кожей, волосами и здоровьем в целом L-аргинин доказал свою супер эффективность. Поговорим обо всем этом подробнее. 

    Полезные свойства L-аргинина:

    Польза для кожи:
    • 1. Замедляет процессы старения
    • 2. Ускоряет процесс заживления ран
    • 3. Стимулирует обновление и омоложение кожи
    Польза для волос:
    • 1. Уменьшает выпадение волос. 
    • 2. Предупреждает повреждение волосяного стержня. 
    Польза для здоровья:
    • 1. Укрепляет сердце и сосуды. 
    • 2. Помогает контролировать артериальное давление. 
    • 3. Усиливает половое влечение. 
    • 4. Уменьшает воспаление в органах мочеполовой системы. 
    • 5. Способствует снижению массы тела. 
    • 6. Укрепляет иммунную систему. 
    • 7. Ускоряет выведение токсинов. 
    • 8. Повышает физическую работоспособность на тренировках. 
    • 9. Препятствует развитию онкологической патологии. 
    • 10. Снимает симптомы мигрени.
    Польза аргинина для кожи:

    L-аргинин подобен эликсиру молодости для нашей кожи. Вот его основные полезные свойства: 

    1. Замедление процессов старения

    Польза аргинина для кожи! 

    Как известно, самый большой орган нашего организма, кожа, с возрастом становится менее упругой и эластичной. Поступление этой аминокислоты с продуктами питания или в виде пищевых добавок помогает поддерживать красоту и жизненную силу кожных покровов. 

    Но как? 

    Аргинин усиливает секрецию гормона роста. Он стимулирует организм выбрасывать в кровоток омолаживающий гормон роста, что помогает замедлить процессы старения. 

    2. Ускорение заживления ран

    Аргинин сокращает время заживления ран. 

    Протеин критически важен для процессов заживления ран. Аргинин помогает синтезировать молекулы протеина и тем самым ускоряет процесс заживления. Аргинин участвует в образовании L-пролина, без которого невозможен синтез коллагена, благодаря чему ускоряет восстановление целостности кожных покровов. Кроме того, он уменьшает боль и отек, что объясняется улучшением центрального и периферического кровообращения. 

    3. Обновление и омоложение кожи

    Некоторые продукты для ухода за кожей помимо аргинина содержат антибактериальные компоненты. Эти компоненты, наряду с антиоксидантами, устраняют любое повреждение кожных покровов, вызванное внешними факторами или инволюционными процессами, и тем самым помогают восстановить присущий молодости внешний вид кожи. 

    Польза аргинина для волос!

    Аргинин оказывает на волосы комплексное благотворное влияние. Вот некоторые примеры. 

    4. Уменьшение выпадения волос

    Эта аминокислота, синтезируемая нашим организмом, расширяет кровеносные сосуды и улучшает приток крови к коже волосистой части головы и основанию волосяных фолликулов. 

    Продукты для ухода за волосами с аргинином в составе нивелируют действие факторов, которые ухудшают развитие и функцию волосяных фолликулов или ослабляют волосяной стержень, и благодаря этому способствуют росту и укреплению волос. 

    5. Защита волос от повреждения

    Хорошие новости для тех, кому нравится часто красить волосы! Аргинин помогает защищать волосы от агрессивных химических соединений и действия высоких температур. Это одна из причин, почему аргинин входит в состав практически всех красок для волос. 

    Польза аргинина для здоровья 

    Аргинин влияет на общее состояние здоровья следующим образом: 

    6. Здоровое сердце

    В организме аргинин превращается в оксид азота (NO). Оксид азота действует как нейромедиатор, который расслабляет и расширяет сосуды, улучшая циркуляцию крови. Получается, что эта заменимая аминокислота усиливает приток крови к сердцу, что в свою очередь уменьшает боли в груди, расширяет закупоренные артерии и улучшает состояние при различных сердечно-сосудистых заболеваниях. 

    Аргинин эффективен при лечении ангинозной боли при стенокардии, которая сигнализирует о том, что сердце не получает достаточно крови. Приступ стенокардии может случиться на фоне эмоциональной или физической нагрузки, например, во время тренировки. Доктора рекомендуют высокие дозы аргинина, от двух до трех грамм в день, в качестве вспомогательного средства лечения стенокардии и ИБС. 

    7. Контроль артериального давления

    Аргинин играет важную роль в регулировании кровяного давления, благодаря чему уменьшает пагубное действие артериальной гипертензии. 

    Повышение артериального давления может стать причиной судорог и спазмов в ногах, усталости, спутанности сознания, головной боли и резкого увеличения частоты сердечных сокращений (тахикардии). 

    8. Усиление полового влечения

    Одно из наиболее очевидных полезных свойств L-аргинина связано с усилением полового влечения у мужчин и женщин. 

    Эта заменимая аминокислота жизненно необходима для сексуального здоровья мужчин. Прием добавок с аргинином мужчинами, страдающими от олигоспермии и уменьшения подвижности сперматозоидов, способствуют улучшению фертильности. Расширяя кровеносные сосуды, аргинин усиливает приток крови к половым органам. Все эти факторы способствуют лечению эректильной дисфункции. 

    9. Уменьшение воспаления в органах мочеполовой системы

    Аргинин может уменьшать воспаление мочевого пузыря. Данная аминокислота также снимает судороги в икроножных мышцах и улучшает функцию почек у пациентов после трансплантации. 

    10. Помощь при похудении

    Теперь о самой волнующей области применения аргинина. При похудении! Прием пищевых добавок с аргинином уменьшает процент жира в организме и увеличивает массу скелетной мускулатуры. Многочисленные исследования показали, что прием L-аргинина повышает уровень инсулина в плазме крови, что ведет к наращиванию мышечной массы даже во время отдыха. Изменения на гормональном уровне помогают усиливать метаболизм, важнейшую составляющую процесса похудения. Что может быть лучше? Режим снижения массы тела без утомительных тренировок! Хотя лично я считаю, что тренировки необходимы. 

    11. Укрепление иммунной системы

    Аргинин очень эффективен при борьбе с заболеваниями, сопровождающимися воспалительными реакциями, и защищает организм от проникновения патогенных микроорганизмов. 

    Эта заменимая аминокислота обладает выраженными противовоспалительными и антиоксидантными свойствами и помогает очищать организм от свободных радикалов. При использовании в комбинации с витамином C и омега-3 жирами, аргинин эффективен при профилактике множества хронических заболеваний. 

    Аргинин положительно влияет на центральную нервную систему, поскольку оксид азота действует в головном мозге как нейромедиатор и помогает обеспечивать защиту нашего организма от внешних угроз. 

    12. Выведение токсинов

    Скажите «привет» натуральному детоксиканту! 

    Аргинин способствует уменьшению концентрации аммиака в крови, что напрямую связано с процессом выведения токсичных продуктов обмена. Вот почему эту добавку часто назначают при лечении различных нарушений обмена веществ. Аммиак — побочный продукт распада белка в организме, который вызывает разрушение клеток. 

    13. Повышение физической работоспособности 

    Доверьте аргинину увеличение своей выносливости. Серьезно! 

    Ранее мы говорили о том, что эта аминокислота усиливает циркуляцию крови в организме, обеспечивая каждую мышечную клетку незаменимыми питательными веществами и кислородом. Это до некоторой степени может повысить вашу силу и выносливость без каких-либо болевых ощущений. 

    Также доказано, что аргинин эффективен при лечении перемежающейся хромоты, состояния, при котором жировые отложения вызывают сужение кровеносных сосудов в нижних конечностях и стопах. Включение в схемы лечения добавок с аргинином улучшает толерантность к нагрузкам и уменьшает мышечные боли у пациентов с этим заболеванием. 

    14. Профилактика онкологической патологии 

    Дефицит аргинина характерен для лиц, которые борются со злокачественными заболеваниями. 

    Исследования показали, что клетки-супрессоры иммунной системы являются главными виновниками этого дефицита. И это важно, потому что наша иммунная система сильно зависит от аргинина, который участвует в образовании и функции лимфоцитов и Т-клеток. 

    Это главная причина назначения препаратов с аргинином пациентам, которые проходят курс химиотерапии. 

    15. Уменьшение симптомов мигрени 

    Мигрень — серьезная проблема. Головная боль при мигрени никогда не приходит одна, ей всегда сопутствуют такие симптомы, как тошнота и повышение чувствительности к свету и шуму. 

    Не переживайте, прием аргинина поможет справиться с этим состоянием! Комбинация L-аргинина с ибупрофеном помогает даже при самых сильных приступах мигрени. Но не забудьте проконсультироваться с врачом, если состояние ухудшается. 

    L-аргинин в продуктах питания 

    Хорошие новости для тех, кто не любит принимать пищевые добавки! 

    Эта заменимая аминокислота встречается во многих продуктах питания, например, в орехах и рыбе. Источник полноценного белка определенно станет лучшим выбором, чем один лишь аргинин, тем более что эти продукты богаты другими аминокислотами и питательными веществами, необходимыми для нормальной работы мышц и внутренних органов. 

    L-аргинин в продуктах питания 

    К лучшим источникам этой аминокислоты относятся: 

    • Яйца 
    • Молочные продукты — йогурт, кефир, сыр 
    • Говядина 
    • Индейка 
    • Курица 
    • Говяжья и куриная печень 
    • Промысловая рыба — она также обеспечит вас незаменимыми жирными кислотами омега-3, которые очень полезны для сердца и сосудов 
    • Кокос 
    • Тыквенные семечки 
    • Кунжут 
    • Семена подсолнечника 
    • Морские водоросли 
    • Морские овощи 
    • Грецкие орехи 
    • Миндаль 
    Рекомендованные дозы L-аргинина:

    Как и в случае с другими добавками и питательными веществами, дозировка L-аргинина сильно зависит от возраста, пола и общего состояния здоровья человека. Ниже приведены рекомендованные дозы для некоторых случаев: 

    Сердечно-сосудистая патология: от 3 до 6 грамм, разделенных на два приема — утром и вечером. 

    Эректильная дисфункция: от 3 до 6 грамм, разделенных на два приема — утром и вечером. 

    Повышение выносливости и физической работоспособности: от 5 до 9 грамм один раз в день. 

    Воспалительные процессы: 1000 мг в день. 

    Предостережения:

    Прием аминокислоты аргинин в дозировках, превышающих рекомендованные, может привести к нестабильному артериальному давлению, развитию диабета, дисбалансу в биохимии крови или повышению риска кровотечения у беременных женщин. 

    Прием L-аргинина вместе с пероральными противозачаточными средствами, обезболивающими и некоторыми медикаментами для лечения артериальной гипертензии, ишемической болезни сердца или диабета, может приводить к определенным побочным эффектам, в частности, к тошноте, диарее, одышке, коликам в животе. 

    Аргинин нельзя принимать беременным женщинам, а также молодым мамам, которые кормят грудью. Противопоказан аргинин детям до двух лет. 

    Некоторые краткосрочные побочные эффекты наблюдаются у здоровых людей, которые принимают аргинин в дневной дозе 1 грамм. К таким побочным эффектам относятся метеоризм, боли в животе, аллергические реакции, одышка, снижение артериального давления. 

    Проконсультироваться с врачом — лучшее решение в любой из подобных ситуаций. Не играйте в доктора! 

    L-аргинин помогает при мигрени, нормализует артериальное давление, ускоряет заживление ран, сокращает период реабилитации после операций, решает проблемы с фертильностью. Так чего же вы ждете, поговорите со своим семейным врачом и начните принимать аргинин уже сегодня! Поделитесь своим опытом в комментариях. 

    Оставайтесь в прекрасной физической форме и будьте здоровы!

    Автор: Таня Чудхари

    Что такое аминокислоты и как они работают – CeraVe.ru

    Аминокислоты

    Важную роль в организме человека играют белки, которые в свою очередь состоят из аминокислот.

    Что такое аминоксилоты?

    Аминокислоты – это органические соединения, из которых состоят белки. Для кожи аминокислоты являются одним из важных структурных элементов, также они принимают участие во множестве биохимических реакций.

    Аминокислоты бывают заменимые (их организм человека синтезирует самостоятельно) и незаменимые (их необходимо получать извне). В косметике используется множество аминокислот – в том числе, в состав косметических средств входят глицин, треонин, аргинин, серин, валин, пролин, изолейцин, аланин, фенилаланин, гистидин.

    Как работают аминокислоты?

    Аминокислоты, входящие в состав косметики, — это эффективные молекулы, которые способны активно действовать в верхних слоях эпидермиса. Аминокислоты могут быть важным компонентом увлажняющих и укрепляющих средств, кремов от морщин и других бьюти-средств по уходу за кожей.

    Какие «способности» аминокислот полезны для кожи?

    Полезные свойства аминокислот используются для увлажнения кожи лица, поддержания ее тонуса, упругости и эластичности.

    Аминокислоты известны также следующими свойствами:

    • участвуют в синтезе коллагена, эластина и кератина;
    • помогают регулировать увлажненность кожи;
    • способствуют укреплению защитного барьера кожи;
    • поддерживают антиоксидантную защиту.

    Кому подходят средства с аминокислотами?

    Даже если косметика содержит аминокислоты, универсального рецепта для ее применения, к сожалению, нет. Важно смотреть, для какого типа кожи предназначен конечный продукт и подбирать косметику по потребностям кожи. Использовать средства с аминокислотами можно в любое время года.

    Средства с аминокислотами:

    Для нормальной и сухой кожи

    Эффективно удаляет макияж, очищает и увлажняет кожу, не нарушая ее естественный защитный барьер

    Аминокислота L-аргинин для птиц | МЕГАМИКС

    Кормовая компания Мегамикс Контакты:

    Адрес: ул. Б.Грузинская, д. 61, стр.2 123056 г. Москва Телефон: (495) 123-34-45 Электронная почта: [email protected] 55.772386,37.584479

    Адрес: п. Первомайский, промышленная зона 040706 Республика Казахстан, Алматинская обл. Телефон: +7 (727) 299-39-99 Электронная почта: [email protected] 44.800584,78.1726

    Адрес: ул.Городецкая 38А, офис 16 220125 Республика Беларусь, г. Минск Телефон: +7 (017) 361-60-61, 361-60-62 Электронная почта: [email protected] 53.78897,27.977427

    Адрес: Гипрозем 16 734067 Республика Таджикистан, г.Душанбе Телефон: +9 (22) 372-31-08-63 Электронная почта: [email protected] 41.285265,69.309687

    Адрес: ул. Фаргона йули, 23 100005 Республика Узбекистан, г.Ташкент Телефон: +998 (71) 291-62-49 Электронная почта: [email protected] 41.285265,69.309687

    Адрес: ул.Добролюбова, 53/4 офис35 г. Ставрополь Телефон: +7(8652)99-70-17 Электронная почта: [email protected] 45.037088,41.990607

    Адрес: пер. Почтовый, д. 9 460000 г. Оренбург Телефон: +7 (8442) 97-97-97 доб. 181 Электронная почта: [email protected] 51.760596,55.108337

    Адрес: ул.Нальчикское шоссе,13 Ставропольский край, Пятигорск Телефон: +7-926-029-79-00 Электронная почта: [email protected] 44.00935,43.104312

    Адрес: Ракитянский р-он, ул. Пролетарская, д. 2А. 309310 Белгородская обл., п. Ракитное Телефон: +7 (8442) 97- 97- 97 доб. 496 Электронная почта: [email protected] 50.834087,35.834156

    Адрес: ул. Куйбышева, 1 Челябинская область, г.Коркино Телефон: +7 (8442) 97-97-97 доб. 491 Электронная почта: [email protected] 54.900808,61.396526

    Адрес: ул. Дорожная, 5г 399540 Липецкая область, с. Тербуны Телефон: +7 (8442) 97-97-97 доб.432 Электронная почта: [email protected] 52.123517,38.273675

    Адрес: пос. Новофедоровское, д.Кузнецово, а/д «Украина», 60 км 108805 г. Москва Телефон: +7 (495)122-23-70 Электронная почта: [email protected] 55.454195,36.949652

    Адрес: пл. А.Невского, д. 2, БЦ Москва, оф. 1108 191167 г. Санкт-Петербург Телефон: +7 (8442) 97-97-97 доб. 172 Электронная почта: [email protected] 59.924697,30.386157

    Адрес: ул. Хрустальная, д. 107, оф.1 400123 г. Волгоград Телефон: (8442) 97-97-97 Электронная почта: [email protected] 48.793832,44.534699

    ОПРЕДЕЛЕНИЕ АРГИНИНА В СМЕШАННЫХ РАСТВОРАХ МОНОАМИНОКАРБОНОВЫХ α-АМИНОКИСЛОТ Текст научной статьи по специальности «Химические науки»

    ХИМИЯ

    УДК 543. 25

    ОПРЕДЕЛЕНИЕ АРГИНИНА В СМЕШАННЫХ РАСТВОРАХ МОНОАМИНОКАРБОНОВЫХ ./-АМИНОКИСЛОТ

    О. В. Варыгина, Р. К. Чернова, М. В. Петрович

    Саратовский национальный исследовательский государственный университет имени Н. П Чернышевского E-mail: [email protected]

    Рассмотрено состояние аргинина и моноаминокарбоновых а-аминокислот в водных средах. Построены диаграммы распределения ионизированных форм аргинина и вали-на при варьировании рН. Показана возможность экспрессного избирательного рН-тит-риметрического определения аргинина в смешанных растворах моноаминокарбоновых а-аминокислот. Интервал определяемых концентраций 46,3-217,8 мг. Погрешность не превышает 5,5%.

    Ключевые слова: аргинин, протолитические свойства, моноаминокарбоновые а-ами-нокислоты, рН-метрическое титрование.

    Definition of Arginine in the Mixed Solutions Monoaminooksidasy a-aminoacids O. V. Virigina, R. K. Chernova, M. V. Petrovich

    The state of monoaminooksidasy arginine and а-amino acids in aqueous media. Built chart the

    distribution of ionized forms of arginine and valine at varying pH. Pakistan the possibility of Express

    electoral pH titrations of arginine in mixed solutions monoaminooksidasy а-amino acids. The interval

    defined concentrations of 46,3-217,8 mg . Error does not exceed 5.5%.

    Key words: arginine, protolytic properties, monoaminooksidasy а-amino acids, pH-metric

    titratio.

    DOI: 10.18500/1816-9775-2016-16-2-125-130

    Аргинин (2-амино-5-гуанидинпентановая кислота) — условно-незаменимая а-аминокислота, является одним из ключевых метаболитов в процессах азотистого обмена (орнитиновый цикл млекопитающих и рыб).

    L-аргинин входит в состав пептидов и белков, особенно высоко его содержание (до 85%) в основных белках — гистонах и протаминах. Высокая основность аргинина и соответственно способность образовывать ионные связи с фосфатными группами ДНК обусловливают образование нуклеопротеидов-комплексов: гистон — ДНК — хроматина и протамин — ДНК — гетерохроматина сперматозоидов.

    Аргинин является составной частью рецептур гепатопротекто-ров, иммуномодуляторов, кардиологических препаратов, препаратов для лечения ожоговых и ВИЧ-инфицированных больных, входит в рецептуры средств для парэнтерального питания в послеоперационный период. Лекарства с аргинином стали применяться в геронтологии и онкологии.

    © Варыгина О. В., Чернова Р. К, Петрович М. В., 2016

    Изв. Сарат. ун-та. Нов. сер. Сер. Химия. Биология. Экология. 2016. Т. 16, вып. 2

    У взрослого и здорового человека аргинин вырабатывается организмом в достаточном количестве, у детей, пожилых и больных людей уровень синтеза аргинина часто недостаточен, поэтому аргинин массово применяется в различных пищевых добавках. Содержание аргинина в препаратах нормируется.

    В связи с этим аргинин (в составе других аминокислот) определяют в основном методами ВЭЖХ, капиллярного электрофореза. Однако эти методы мало пригодны для скринингового обследования лечебных препаратов, экономически и технически не выполнимы в рядовых клинических лабораториях при эпизодическом и единичном определении аргинина в сложных матрицах, в частности, в смесях а-аминокислот.

    В связи с изложенным разработка простых способов идентификации и количественного определения аргинина является актуальной задачей.

    В настоящей работе рассмотрена возможность экспрессного избирательного рН-титри-метрического определения аргинина в смешанных растворах моноаминокарбоновых а-аминокислот. Предложенный подход основан на разном состоянии в водных средах аргинина и моноаминокар-боновых а-аминокислот, что приводит к специфическому изменению рН водных растворов аргинина (рН=10,76). Это обусловлено появлением его ионной формы R++- , отсутствующей в водных растворах моноаминокарбоновых а-аминокислот.

    Реагенты и оборудование

    Приготовление растворов аргинина

    Исходный раствор: навеску аргинина 0,8710 г растворяли в дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью 100 мл.

    Для получения 0,0025М раствора навеску аргинина 0,0436 г растворяли в дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью 100 мл.

    Для титрования аликвоту 5 мл исходного раствора помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводили до метки дистиллированной водой. Полученный 0,1 М раствор аргинина оттитровывали 0,1М раствором HCl.

    Для построения градуировочного графика 1 аликвоты исходного раствора (5 мл; 10 мл; 15 мл; 20 мл; 25 мл) помещали в мерные колбы вместимостью 25 мл, разбавляли дистиллированной водой. Полученные растворы оттитровывали 0,1М раствором HCl.

    Для построения градуировочного графика 2 аликвоты 0,0025 М раствора аргинина (0,25 мл; 0,5 мл; 1 мл) помещали в мерные колбы вместимостью 25 мл, разбавляли дистиллированной водой, оттитровывали 0,002 М раствором HCl.

    Методики приготовления смесей

    Для приготовления смеси I аминокислот в мерную колбу вместимостью 100 мл вводили навески: 0,4455 г Ala; 0,5858 г Val; 0,3755 г Gly; 0,6558 г Ley (концентрация каждой аминокислоты составляла 0,05М). В эту смесь добавляли 0,8710 г аргинина. Дистиллированной водой доводили объем до 100 мл.

    Для приготовления смеси II аминокислот в мерную колбу вместимостью 100 мл вводили навески: 0,6558 г Ile; 0,8260 г Phe (концентрация каждой аминокислоты составляла 0,05М). В эту смесь добавляли 0,8710 г аргинина. Дистиллированной водой доводили объем до 100 мл.

    Для приготовления смеси III аминокислот в мерную колбу вместимостью 100 мл вводили навески: 0,4455 г Ala; 0,5858 г Val; 0,3755 г Gly; 0,6558 г Ley; 0,6558 г Ile; 0,8260 г Phe (концентрация каждой аминокислоты составляла 0,05М). В эту смесь добавляли 0,8710 г аргинина. Дистиллированной водой доводили объем до 100 мл.

    Для приготовления смеси IV аминокислот в мерную колбу вместимостью 100 мл вводили навески: 0,0446 г Ala; 0,0586 г Val; 0,0376 г Gly; 0,0656 г Ley; 0,0656 г Ile; 0,0826 г Phe (концентрация каждой аминокислоты составляла 0,005М). В эту смесь добавляли 0,8710 г аргинина. Дистиллированной водой доводили объем до 100 мл.

    Из каждой полученной смеси аминокислот брали аликвоты по 5 мл, разбавляли дистиллированной водой до 25 мл и оттитровывали 0,1 М HCl.

    рН-метрическое определение проводили на иономере марки «рх-150МП» с хлоридсеребрян-ным электродом сравнения.

    Экспериментальная часть

    Предварительно нами проводились титрования водных растворов аргинина раствором HCl с последующим построением градуировочного графика. На рис. 1 а, б приведены соответственно кривая титрования водного раствора аргинина и градуировочный график.

    На кривых чётко выражен скачок титрования, который характеризует переход от формы R+- к форме R++- аргинина (рис. 2). При дальнейшем прибавлении кислоты рН соответственно медленно понижается.

    На титрование 43,55 мг аргинина в водном растворе расходуется 2,25 мл титранта (CARG=0,01M). Как следует из рис. 1, б, линейная зависимость наблюдается в интервале концентраций 43,6-217,8 мг аргинина. Возможно титрование более низких концентраций аргинина (0,1-0,4 мг) в варианте микротитрования.

    126

    Научный отдел

    у= 0,0544* -ОДЭ

    55

    зи

    VHCl, мл

    б

    mrMf

    Рис. 1. Кривая рН-метрического титрования (а) 0,01М (1), 0,02М (2), 0,03М (3) растворов аргинина 0,1М раствором HCl; б — градуировочный график для определения аргинина в водном растворе

    С, % 100 30 60 40 20

    0 2 4 6 В 10 12 14

    РН

    Рис. 2. Диаграмма распределения ионизированных форм аргинина при разных значениях рН

    Далее проводились избирательные титри-метрические определения аргинина в приготовленных смесях ¡-IV моноаминокарбоновых а-аминокислот (рис. 3). Как видно из рис. 3, присутствие других аминокислот, а также смеси всех указанных в табл. 1 аминокислот не изменяет объем титранта в точке эквивалентности.

    Результаты и их обсуждение

    Известно, что протолитические свойства а — аминокислот определяют их многие физико-химические характеристики. К настоящему времени значения констант ионизации а-аминокислот обобщены и критически оценены в материалах ИЮПАК [1-5]. В табл. 1 обобщены данные о кислотно-основных свойствах аргинина и а-моноаминокарбоновых кислот, их растворимости и величинах р1.

    pH

    VHCl, мл

    Рис. (Я) 1,82 8,99 12,48 11,15 15

    Моноаминокарбоновые кислоты

    2 Глицин СН2(1чГН2)СООН 01у (О) 2,35 9,78 5,97 25

    3 Алании СН3СН(1чГН2)СООН А1а (А) 2,35 9,78 6,00 16,6

    4 Валин (СН3)2СНСН(1чГН2)СООН Уа1 (V) 229 9,74 5,96 8,8

    5 Лейцин (СН3 )2СНСН2СН(1чГН2 )С ООН Ьеи(Ь) 2,33 9,74 5,98 2,2

    6 Изолейцин СН3СН2СН(СН3)СН(1чГН2)СООН Пе(1) 2,32 9,76 5,94 4,1

    7 Фенилаланин С 6ЩСН2СН(1чГН2 )С ООН РИе(Р) 2,20 9,31 5,48 3,0

    Для моноаминокарбоновых а-аминокислот первая константа ионизации соответствует диссоциации а-СООН-группы, вторая -депротони-рованию атома азота а — КЫ3 + — группы.

    Типичное распределение ионизированных форм, характерное для моноаминокарбоновых а-аминокислот в зависимости от рН, показано на примере валина (рис. 4).

    ж

    0 2 4 6 а 10 12 14

    рН

    Рис. 4. Диаграмма распределения ионизированных форм валина при разных

    значениях рН

    Аргинин — алифатическая а-аминокислота, несущая два основных центра: аминогруппу в а-положении и гуанидиновую группу в о-положении.

    Водные растворы аргинина имеют щелочную реакцию (рН = 10,76). Согласно протолитической

    теории Бренстеда — Лоури это свидетельствует о переносе протона от растворителя к протолиту, при этом протонируется гуанидиновая группа, которая благодаря резонансной делокализации заряда при протонировании является сильно основной (рКа = 12,48):

    НОН

    Н„М N Н

    СОО

    ОН

    Последовательность образования ионизированных форм аргинина и диаграмма их рас-

    пределения в зависимости от рН приведены на рис. 2.

    Изв. Сарат. ун-та. Нов. сер. Сер. Химия. Биология. Экология. 2016. Т. 16, вып. 2

    Как следует из вышеприведенных данных, при добавлении аргинина в водные растворы моноаминокарбоновых а — аминокислот, протонированных только по а-аминогруппе, имеющих рН = 6,64, наблюдается увеличение щелочности среды до рН=10,76. Следовательно, возможно титриметрически, по количеству оттитрованных ОН- ионов, определить содержание аргинина на фоне моноаминокарбоновых а-аминокислот. Эта цель и была реализована в данной работе. При этом достигается переход формы R+- в форму R++- аргинина на фоне не протонируемых в этих условиях форм R+- моноаминокарбоновых а-аминокислот (см. рис. 2, 4).

    Для оценки правильности определения аргинина в смеси с Ala, Val, Gly, Ley был применен метод «введено-найдено». Для этого в смесь аминокислот вводилось разное коли -чество аргинина (табл. 2). Проведенные рН-потенциометрические определения показали, что в интервале концентраций, указанных на градуировочных графиках, возможно определение аргинина с относительной погрешностью, варьирующей от 3,0 до 5,5%.

    Таблица 2

    Пример определения аргинина в смешанном растворе (I) методом «введено-найдено»

    Введено Arg, мг Найдено Arg, мг Sr ô,%

    65,33 61,71±2,64 0,017 5,5

    108,88 103,99±3,49 0,014 4,5

    195,98 190,07±2,28 0,005 3,0

    Проведенные исследования показали, что в интервале концентраций 43,6-217,8 мг возможно прямое избирательное рН-потенциометрическое определение аргинина в различных смешанных растворах моноаминокарбоновых а-аминокислот с погрешностью, не превышающей 5,5%.

    Работа выполнена в рамках Госзадания Минобрнауки РФ в сфере научной деятельности (базовая часть) по Заданию № 2014/203, код проекта 1255, шифр « ПАВ» Метрология создания и анализа новых практически ценных многокомпонентных систем и материалов.

    Список литературы

    1. Kiss T., Sôvâgô I., Gergely A. Critical survey of the stability constants of complexes of glycine // Pure and Appl. Chem. 1991. Vol. 63, № 4. P. 597-638.

    2. Berthon G. The stability constants of metal complexes of amino acids winh polar side chains // Pure and Appl. Chem. 1995. Vol. 67, № 7. P. 1117-1240.

    3. Sôvâgô J., Kiss T., Gergely A. Critical survey of the stability constants of complexes of aliphatic amino acids // Pure and Appl. Chem. 1993. Vol. 65, № 5. P. 1029-1080.

    4. Pettit L. D. Critical survey of formation constants of complexes of histidine, phenylalanine, tysosine, L-Dopa and tryptophan // Pure and Appl. Chem. 2009. Vol. 56, № 2. P. 247-292.

    5. Yamauchi O., Odani A. Stability constants of metal complexes of amino acids wint charged side chains-Part I: Positively charged side chains // Pure and Appl. Chem. 1996. Vol. 68, № 2. P. 469-496.

    6. Химическая энциклопедия : в 5 т. Т. 1. М. : Сов. эн-цикл., 1988.

    УДК 543:615.33

    ИССЛЕДОВАНИЕ СОСТОЯНИЯ НЕКОТОРЫХ ЦЕФАЛОСПОРИНОВЫХ АНТИБИОТИКОВ В ВОДНЫХ СРЕДАХ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ

    О. И. Кулапина1, В. А. Каренко2, Е. Г. Кулапина2

    1Саратовский государственный медицинский университет имени В. И. Разумовского 2Саратовский национальный исследовательский государственный университет имени Н. П. Чернышевского E-mail: [email protected]

    Разработаны экспрессные спектрофотометрические методики оценки подлинности некоторых цефалоспориновых антибиотиков II и III поколений. Показана идентичность препаратов цефотаксима (Россия) и клафорана (Франция), цефу-роксима (Россия) и цефуроксим аксетила (Англия). Ключевые слова: цефотаксим, клафоран, цефуроксим, цефуроксим аксетил, лекарственные препараты, водная среда.

    Research of a State of Some the Cephalosporin Antibiotics in Water Environments by Spectrophotometry

    O. I. Kulapina, V. A. Karenko, E. G. Kulapina

    An express authenticity estimation of some cephalosporin antibiotics of II and III generations are developed by spectrophotometry. An

    © Кулапина О. И, Каренко В. А., Кулапина Е. Г., ZQ16

    Аргинин

    Аргинин (L-arginine) – для взрослых белковообразующая заменимая аминокислота, а для детей является незаменимой. Входит в состав белков, особенно прогаминов (до 85%) и гистонов. Аргинин способствует ускорению синтеза гормона роста и других гормонов.

    Ежедневные дозы от б до 17 г снижают уровень ЛНП-холестерина («плохого»), не уменьшая ЛВП-холестерина («хорошего»). Аргинин способствует здоровой коронарной микроциркуляции, препятствуя образованию сгустков крови, которые могут вызывать инфаркты и инсульты. Кроме того, эта аминокислота обеспечивает приток крови к конечностям. 

    Аргинин повышает функцию Т-клеточного звена иммунитета, может увеличивать вес тимуса, ответственного за большую часть иммунных функций (при дозировке до 1,5 г в сутки). Совместное назначение лизина и аргинина (1-2 г в сутки) повышает иммунный ответ организма, в частности, количество и активность нейтрофилов.

    Особенно богаты аргинином белки семенной жидкости (до 80%), поэтому из-за его дефицита может развиться бесплодие. Аргинин активно участвует в деятельности половых органов, то есть косвенно стимулирует выделение тестостерона у мужчин. Кроме того, окись азота играет решающую роль в способности достижения и поддержания эрекции, поэтому аргинин может назначаться при импотенции (до 2,5 г в сутки).

    Аргинин играет важную роль в мышечном обмене: способствует снижению веса, так как ускоряет рост мышечной массы и сокращает жировой объем. В высоких концентрациях он встречается в коже и соединительных тканях, что позволяет использовать его в лечении и восстановлении поврежденных тканей.
    Кроме участия в синтезе белков, эта аминокислота является одним из основных компонентов цикла мочевины (орнитиновый цикл Кребса) – основного пути обезвреживания аммиака в организме.

    Аргинин – это аминокислота, которая преобразуется в организме в вещество под названием спермин; оно обнаруживается в сперме, крови и клетках мозга. Низкий уровень спермина связывают со старостью и потерей памяти. Образование спермина из аргинина представляет собой весьма сложный процесс и включает участие нескольких кофакторов (коферментов). Вот как это происходит.

    Фермент, активизируемый марганцем, вступает в реакцию с аргинином и образует аминокислоту орнитин, которая в свою очередь вступает в реакцию с витамином B6, образуя путресцин. Одновременно магний вступает в реакцию с метионином, еще одной аминокислотой, образуя активированный метионин, который превращает путресцин в спермидин и затем в спермин. Этот сложный процесс можно ускорить, если принимать пищевые добавки на основе участвующих в нем различных аминокислот и коферментов.

    Полезные свойства:

    •  Аргинин действует как предшественник оксида азота, расширяющий сосуды и усиливающий их кровенаполнение.
    •  Снижает кровяное давление, улучшает реологию крови, способствует снижению уровня холестерина в крови и препятствует тромбообразованию.
    •  Стимулирует синтез гормона роста и интенсифицирует рост у детей и подростков.
    •  Увеличивает массу мышечной и уменьшает массу жировой ткани, способствует нормализации состояния соединительной ткани.
    •  Повышает иммунитет и замедляет рост опухолей.
    •  Аргинин способствует повышению потенции и стимулирует сперматогенез.


    особенности применения для профилактики и лечения различных заболеваний

    Аргинин — аминокислота, синтезирующаяся в организме. Пероральный аргинин использовался при различных состояниях, таких как гипертония, стенокардия, атеросклероз, мигрень и эректильная дисфункция. Считается, что его сосудорасширяющие свойства ответственны за положительный эффект. Аргинин также используется для улучшения заживления ран, улучшения иммунной функции и улучшения спортивных результатов. Некоторые исследования подтверждают использование аргинина при заболеваниях коронарных и периферических артерий (10) (11) (12) (13), но при длительном приеме добавок ухудшилось. ПОДКЛАДКА (14). Кроме того, пероральный прием добавок у пациентов с острым инфарктом миокарда не улучшил фракцию выброса или жесткость сосудов и может быть связан с более высокой смертностью (38). Мета-анализ добавок аргинина по маркерам сердечно-сосудистых заболеваний, ожирения или диабета также не дал положительных результатов, за исключением, возможно, избранной группы пациентов (39).

    Менее масштабные исследования показывают, что добавление аргинина, глутамина и HMB может улучшить функцию эндотелия сосудов у пожилых людей (33), но добавление аргинина само по себе не улучшило кровоток или работоспособность мышц у пожилых женщин (34).

    Наряду с витаминами-антиоксидантами аргинин снижал частоту преэклампсии у женщин с высоким риском (28), но добавки аргинина не улучшали артериальное давление или функцию почек у женщин с преэклампсией (15). Предварительные данные свидетельствуют о потенциальной пользе добавок аргинина при эректильной дисфункции (16) (40). Аргинин в сочетании с ибупрофеном может усилить обезболивание у пациентов с мигренью (17). Энтеральный аргинин снижает шок у пациентов с тяжелыми ожогами (4) и может быть полезен в качестве дополнительной терапии у пациентов с активным туберкулезом (29). У онкологических больных предварительные результаты смешаны для периоперационных энтеральных смесей, обогащенных аргинином для улучшения заживления ран (1) ( 41) и иммунной функции (27) (35) (42), но другие исследования показывают, что такие формулы могут уменьшить осложнения и сократить продолжительность пребывания в больнице (30) (36). Некоторые данные предполагают, что профилактическая добавка, содержащая аргинин, может снизить частоту синдрома кистей и стоп у пациентов с гепатоцеллюлярной карциномой, принимающих сорафениб (43).

    Интересно, что лечение, основанное на депривации аргинина, также рассматривается как потенциальное лечение онкологических заболеваний (31) (32) (37).

    Хотя метаанализ не выявил значительного влияния добавок аргинина на воспалительные биомаркеры, анализ подгрупп предполагает, что он может увеличить циркулирующий С-реактивный белок у онкологических больных, у пациентов старше 60 лет или с более высокими исходными уровнями СРБ, или при использовании энтеральных формул. (44). Необходимы дополнительные исследования, чтобы определить обстоятельства, при которых добавление аргинина может быть безопасным и эффективным.

    Взаимодействие с боковыми цепями аргинина и роль аргинина в качестве носителя заряда в чувствительных к напряжению ионных каналах

  • Harms, M. J. et al. Скрытый лизин, который титруется нормальным pK (a): роль конформационной гибкости на границе раздела белок-вода как детерминанта значений pK (a). Protein Sci. 17, 833–845 (2008).

    CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • Fitch, C. A., Platzer, G., Окон, М., Гарсия-Морено, Б. и Макинтош, Л. П. Аргинин: пересмотр его значения pK (a). Protein Sci. 24. С. 752–761 (2015).

    CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • Хармс, М. Дж., Шлессман, Дж. Л., Сью, Г. Р. и Гарсия-Морено, Б. Остатки аргинина во внутренних положениях в белке всегда заряжены. Proc. Natl. Акад. Sci. USA 108, 18954–18959 (2011).

    ADS CAS PubMed Google Scholar

  • Li, L.Б., Воробьев И. и Аллен Т. В. Различные взаимодействия боковых цепей лизина и аргинина с липидными мембранами. J. Phys. Chem. В 117, 11906–11920 (2013).

    CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • Catterall, W. A. ​​Датчики напряжения с ионным каналом: структура, функции и патофизиология. Нейрон 67, 915–928 (2010).

    CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • Тао, Х., Ли, А., Лимапичат, В., Догерти, Д. А., Маккиннон, Р. Стробирующий центр передачи заряда в датчиках напряжения. Science 328, 67–73 (2010).

    ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • Кампос, Ф. В., Чанда, Б., Ру, Б. и Безанилья, Ф. Два атомных ограничения однозначно позиционируют сегмент S4 относительно сегментов S1 и S2 в закрытом состоянии канала Shaker K. Proc. Natl. Акад. Sci. USA 104, 7904–7909 (2007).

    ADS CAS PubMed Google Scholar

  • Li, Q. F. et al. Структурный механизм зависящего от напряжения стробирования в изолированной области измерения напряжения. Nat. Struct. Мол. Биол. 21. С. 244–252 (2014).

    CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • Аггарвал, С. К. и Маккиннон, Р. Вклад сегмента S4 в стробирующий заряд в канале Shaker K +.Нейрон 16, 1169–1177 (1996).

    CAS PubMed Google Scholar

  • Ахерн, К. А. и Хорн, Р. Сфокусированное электрическое поле на датчике напряжения калиевых каналов. Нейрон 48, 25–29 (2005).

    CAS PubMed Google Scholar

  • Pless, S.A. et al. Асимметричный функциональный вклад кислотных и ароматических боковых цепей в доменах датчиков напряжения натриевых каналов.J. Gen. Physiol. 143. С. 645–656 (2014).

    CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • Коленсо, К. К., Цао, Ю., Сешнс, Р. Б., Хэнкокс, Дж. К. и Демпси, К. Э. Перенос стробирующего заряда датчика напряжения в модели калиевого канала hERG. Биофиз. J. 107, L25 – L28 (2014).

    CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • Мейсон, П.Э., Нейлсон, Г. В., Демпси, К. Э., Барнс, А. С. и Крукшенк, Дж. М. Гидратная структура гуанидиния и тиоцианат-ионов: влияние на стабильность белка в водном растворе. Proc. Natl. Акад. Sci. USA 100, 4557–4561 (2003).

    ADS CAS PubMed Google Scholar

  • Schwaiger, C. S., Bjelkmar, P., Hess, B. & Lindahl, E. Конформация 3 (10) -Helix облегчает переход сегмента датчика напряжения S4 в неактивное состояние.Биофиз. J. 100, 1446–1454 (2011).

    ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • Jensen, M.O. et al. Механизм стробирования напряжения в калиевых каналах. Science 336. С. 229–233 (2012).

    ADS CAS PubMed Google Scholar

  • Делмотт, Л., Тарек, М., Кляйн, М. Л., Амарал, К. и Трептов, В. Промежуточные состояния Kv1.2 датчика напряжения из моделирования атомистической молекулярной динамики. Proc. Natl. Акад. Sci. USA 108, 6109–6114 (2011).

    ADS CAS PubMed Google Scholar

  • Фрейтес, Дж. А., Шоу, Э. В., Уайт, С. Х. и Тобиас, Д. Дж. Микроскопическое происхождение колебаний стробирующего тока в датчике напряжения калиевого канала. Биофиз. J. 102, A44 – A46 (2012).

    Google Scholar

  • Танки, Н., Торнтон, Дж. М. и Гудфеллоу, Дж. М. Распределение воды вокруг аминокислотных остатков в белках. J. Mol. Биол. 202, 637–657 (1988).

    CAS PubMed Google Scholar

  • Галливан, Дж. П. и Догерти, Д. А. Катион-пи-взаимодействия в структурной биологии. Proc. Natl. Акад. Sci. USA 96, 9459–9464 (1999).

    ADS CAS PubMed Google Scholar

  • Сингх, Дж.И Торнтон, Дж. М. Атлас взаимодействий белковых боковых цепей (IRL Press, Oxford, 1992).

  • Флокко, М. и Моубрей, С. Л. Взаимодействия аргинина и ароматических боковых цепей в белках при плоском укладывании. J. Mol. Биол. 235, 709–717 (1994).

    CAS PubMed Google Scholar

  • Дональд, Дж. Э., Кулп, Д. В. и ДеГрадо, В. Ф. Солевые мосты: геометрически определенные, моделируемые взаимодействия. Proteins 79, 898–915 (2011).

    CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • Такешита К. и др. Рентгеновская кристаллическая структура потенциалозависимого протонного канала. Nat. Struct. Мол. Биол. 21, 352 – U170 (2014).

    CAS PubMed Google Scholar

  • Имаи, Ю. Н., Иноуэ, Ю. и Ямамото, Ю. Склонности полярных и ароматических аминокислот в неканонических взаимодействиях: анализ несвязанных контактов комплексов белок-лиганд в кристаллических структурах.J. Med. Chem. 50, 1189–1196 (2007).

    CAS PubMed Google Scholar

  • Мейсон П. Э., Демпси К. Э., Нейлсон Г. У., Клайн С. Р. и Брэди Дж. У. Предпочтительные взаимодействия ионов гуанидина с ароматическими группами по сравнению с алифатическими группами. Варенье. Chem. Soc. 131, 16689–16696 (2009).

    CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • Чакрабарти, П.И Бхаттачарья, Р. Геометрия несвязанных взаимодействий с участием плоских групп в белках. Прог. Биофиз. Мол. Биол. 2007. Т. 95. С. 83–137.

    CAS PubMed Google Scholar

  • Демпси, К. Э., Пиггот, Т. Дж. И Мейсон, П. Е. Диссекция вкладов в денатурантную чувствительность белков. Биохимия 44, 775–781 (2005).

    CAS PubMed Google Scholar

  • Лим, W.K., Rosgen, J. & Englander, S. W. Мочевина, но не гуанидин, дестабилизирует белки, образуя водородные связи с пептидной группой. Proc. Natl. Акад. Sci. USA 106, 2595–2600 (2009).

    ADS CAS PubMed Google Scholar

  • Рейф М. М., Хуненбергер П. Х. и Остенбринк К. Новые параметры взаимодействия для заряженных боковых цепей аминокислот в силовом поле ГРОМОС. J. Chem. Теория вычисл. 8, 3705–3723 (2012).

    CAS PubMed Google Scholar

  • Дебец, К.Т., Гроненборн А. М. и Чонг Л. Т. Оценка прочности солевых мостиков: сравнение современных биомолекулярных силовых полей. J. Phys. Chem. В 118, 6561–6569 (2014).

    CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • Лакруа, Дж. Дж. И Безанилла, Ф. Управление переходом конечного стробирующего заряда с помощью гидрофобного остатка в сегменте S2 датчика напряжения канала K +. Proc. Natl. Акад. Sci. USA 108, 6444–6449 (2011).

    ADS CAS PubMed Google Scholar

  • Cheng, Y. M. et al. Функциональное взаимодействие зарядов датчика напряжения с гидрофобной пробкой S2 в каналах hERG. J. Gen. Physiol. 142, 289–303 (2013).

    CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • Лакруа, Дж. Дж., Хайд, Х. К., Кампос, Ф. В. и Безанилла, Ф. Перемещение стробирующих зарядов через стробирующую пору в датчике напряжения Kv-канала.Proc. Natl. Акад. Sci. USA 111, E1950 – E1959 (2014).

    CAS PubMed Google Scholar

  • Эль-Дин, Т.М.Г., Шойер, Т. и Каттералл, В.А. Отслеживание движения S4 с помощью стробирования поровых токов в бактериальном натриевом канале NaChBac. J. Gen. Physiol. 144. С. 147–157 (2014).

    Google Scholar

  • Лонг, С. Б., Тао, X., Кэмпбелл, Э. Б. и Маккиннон, Р. Атомная структура потенциал-зависимого K + канала в липидной мембраноподобной среде.Nature 450, 376–382 (2007).

    ADS CAS PubMed Google Scholar

  • Томбола, Ф., Патак, М. М. и Исакофф, Э. Ю. Аргинины, чувствительные к напряжению, в пермеате калиевого канала и закупоривают катион-селективные поры. Нейрон 45, 379–388 (2005).

    CAS PubMed Google Scholar

  • Miceli, F. et al. Чувствительный к напряжению домен каналов K (v) 7.2 как молекулярная мишень для мутаций, вызывающих эпилепсию, и противосудорожных средств.Фронт. Pharmacol. 2, 2 (2011).

    CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • Мейсон П. Э., Брэди Дж. У., Нейлсон Г. У. и Демпси К. Э. Взаимодействие ионов гуанидиния с модельным пептидом. Биофиз. J. 93, L4 – L6 (2007).

    Google Scholar

  • Wang, G.L. & Dunbrack, R.L. PISCES: сервер отбора белковой последовательности. Биоинформатика 19, 1589–1591 (2003).

    CAS PubMed Google Scholar

  • Берман, Х. М. и др. Банк данных о белках. Nucleic Acids Res. 28. С. 235–242 (2000).

    ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • ван дер Уолт, С., Колберт, С. и Варокво, Г. Массив NumPy: структура для эффективных численных вычислений. Comput. Sci. Англ. 13, 22–30 (2011).

    Google Scholar

  • Система молекулярной графики PyMOL, версия 1.4.1 Schrödinger, LLC.

  • Коленсо, К.К., Сешнс, Р. J. Chem. Инф. Мод. 2013. Т. 53. С. 1358–1370.

    CAS Google Scholar

  • 18.1: Свойства аминокислот

    Цели обучения

    • Для распознавания аминокислот и их классификации на основе характеристик их боковых цепей.

    Белки всех живых существ, от бактерий до людей, состоят из одного и того же набора из 20 аминокислот, названных так потому, что каждая из них содержит аминогруппу, присоединенную к карбоновой кислоте. Аминокислоты в белках представляют собой α-аминокислоты, что означает, что аминогруппа присоединена к α-углероду карбоновой кислоты. Человек может синтезировать только половину необходимых аминокислот; остальные должны быть получены с пищей и известны как незаменимые аминокислоты. Однако две дополнительные аминокислоты были обнаружены в белках в ограниченных количествах: селеноцистеин был открыт в 1986 году, а пирролизин был открыт в 2002 году.

    Аминокислоты представляют собой бесцветные, нелетучие кристаллические твердые вещества, плавящиеся и разлагающиеся при температуре выше 200 ° C. Эти температуры плавления больше похожи на температуры неорганических солей, чем у аминов или органических кислот, и указывают на то, что структуры аминокислот в твердом состоянии и в нейтральном растворе лучше всего представлены как имеющие как отрицательно заряженную группу, так и положительно заряженную группу. Такой вид известен как цвиттерион.

    Классификация

    Помимо амино и карбоксильных групп, аминокислоты имеют боковую цепь или группу R, присоединенную к α-углероду.Каждая аминокислота имеет уникальные характеристики, обусловленные размером, формой, растворимостью и ионизационными свойствами ее группы R. В результате боковые цепи аминокислот оказывают сильное влияние на структуру и биологическую активность белков. Хотя аминокислоты можно классифицировать по-разному, один общий подход состоит в том, чтобы классифицировать их в зависимости от того, является ли функциональная группа на боковой цепи при нейтральном pH неполярной, полярной, но незаряженной, отрицательно заряженной или положительно заряженной. Структура и названия 20 аминокислот, их одно- и трехбуквенные сокращения, а также некоторые их отличительные особенности приведены в Таблице \ (\ PageIndex {1} \).

    Первой аминокислотой, выделенной в 1806 году, был аспарагин. Он был получен из белка, содержащегося в соке спаржи (отсюда и название). Глицин, основная аминокислота, содержащаяся в желатине, был назван из-за его сладкого вкуса (по-гречески glykys , что означает «сладкий»). В некоторых случаях аминокислота, содержащаяся в белке, на самом деле является производным одной из 20 обычных аминокислот (одним из таких производных является гидроксипролин). Модификация происходит после того, как аминокислота была собрана в белок.

    Конфигурация

    Обратите внимание в таблице \ (\ PageIndex {1} \), что глицин является единственной аминокислотой, у которой α-углерод , а не хиральный. Следовательно, за исключением глицина, аминокислоты теоретически могут существовать либо в D-, либо в L-энантиомерной форме и вращать плоско-поляризованный свет. Как и в случае с сахарами, химики использовали L-глицеральдегид в качестве эталонного соединения для определения абсолютной конфигурации аминокислот. Его структура очень напоминает структуру аминокислоты, за исключением того, что в последней аминогруппа занимает место группы ОН на хиральном углероде L-глицеральдегида, а карбоновая кислота заменяет альдегид.Современные стереохимические определения с использованием правил приоритета Кана-Ингольда-Прелога, повсеместно используемых в химии, показывают, что все встречающиеся в природе хиральные аминокислоты являются S, за исключением Cys, который представляет собой R.

    Мы узнали, что все встречающиеся в природе сахара принадлежат к серии D. Поэтому интересно, что почти все известные растительные и животные белки полностью состоят из L-аминокислот. Однако некоторые бактерии содержат D-аминокислоты в своих клеточных стенках и несколько антибиотиков (например,g., актиномицин D и грамицидины) содержат различные количества D-лейцина, D-фенилаланина и D-валина.

    Сводка

    Аминокислоты могут быть классифицированы на основе характеристик их отличительных боковых цепей как неполярные, полярные, но незаряженные, отрицательно заряженные или положительно заряженные. Аминокислоты, содержащиеся в белках, являются L-аминокислотами.

    Упражнения по обзору концепции

    1. Какова общая структура α-аминокислоты?

    2. Укажите аминокислоту, которая подходит под каждое описание.

      1. , также известный как аспартат
      2. почти такое же сильное основание, как гидроксид натрия
      3. не имеет хирального углерода

      1. аспарагиновая кислота
      2. аргинин
      3. глицин
    3. Напишите боковую цепь каждой аминокислоты.

      1. серин
      2. аргинин
      3. фенилаланин
    4. Напишите боковую цепь каждой аминокислоты.

      1. аспарагиновая кислота
      2. метионин
      3. валин
    5. Изобразите структуру каждой аминокислоты.

      1. аланин
      2. цистеин
      3. гистидин
    6. Изобразите структуру каждой аминокислоты.

      1. треонин
      2. глутаминовая кислота
      3. лейцин
    7. Укажите аминокислоту, боковая цепь которой содержит (n)

      1. амидная функциональная группа.
      2. ароматическое кольцо.
      3. карбоксильная группа.
    8. Укажите аминокислоту, боковая цепь которой содержит (n)

      1. Группа OH
      2. разветвленная цепь
      3. аминогруппа
      1. CH 2 OH


      1. аспарагин или глутамин
      2. фенилаланин, тирозин или триптофан
      3. аспарагиновая кислота или глутаминовая кислота

    Аргинин — обзор | Темы ScienceDirect

    1.6 Применение и применение

    Аргинин — это аминокислота, наиболее известная как высвобождающее гормон роста. Снижение уровня гормона роста в организме человека с возрастом является основной причиной того, что мышечная масса имеет тенденцию уменьшаться с возрастом, а жировые отложения с возрастом увеличиваются. Снижение гормонов роста также частично отвечает за замедление роста кожи с возрастом, что приводит к более тонкой и менее эластичной коже. Инъекции гормона роста могут обратить вспять эти проблемы, но прием слишком большого количества гормона роста может быть опасен.Гормон роста нельзя принимать внутрь, потому что как пептид он расщепляется в пищеварительном тракте. Инъекции гормона роста настолько дороги, что немногие люди могут себе их позволить, если они не используются для лечения определенного заболевания, покрываемого страховкой [1,2].

    Добавка аргинина (1%) в контрольную лабораторную пищу, содержащую адекватное количество аргинина для роста и воспроизводства, увеличивает массу тимуса, клеточность и бластогенез тимических лимфоцитов у крыс и мышей [3,4]. Кроме того, добавление аргинина может уменьшить негативное влияние травмы на эти параметры тимуса [5].Было продемонстрировано, что аргинин становится незаменимой аминокислотой для выживания и заживления ран у крыс с дефицитом аргинина [6]. Эта работа показала, что добавление 1% аргинина недефицитным крысам привело к снижению потери веса в первый день после травмы и увеличению заживления ран у крыс, подвергшихся ранению на спинной поверхности кожи [6].

    Аргинин также является мощным иммуностимулятором [7–9]. Когда-то считалось, что это происходит исключительно из-за его свойств высвобождения гормона роста, но было обнаружено, что аргинин является мощным иммуностимулятором и средством заживления ран даже при отсутствии значительного высвобождения гормона роста.Длительный пероральный прием L-аргинина снижает утолщение интимы и усиливает неоэндотелий-зависимое ацетилхолин-индуцированное расслабление после повреждения артерии [10]. Кроме того, пероральный прием L-аргинина улучшает оценку симптомов интерстициального цистита [11].

    Аргинин используется при определенных состояниях, сопровождающихся гипераммонемией. Кроме того, хлорид аргинина также использовался в качестве подкисляющего агента [12]. При тяжелом метаболическом алкалозе внутривенные дозы (в граммах) рассчитывались путем умножения желаемого снижения концентрации бикарбоната в плазме (мэкв на литр) на массу тела пациента (в кг) и затем деления на 9.6. При передозировке рекомендуемая доза составляет 10 г внутривенно в течение 30 минут [12].

    Аргинин также использовался в виде различных солей, таких как ацетиласпарагинат, аспаратат, цитрат, глутамат, оксоглурат, тидиакат и тимонациат [12].

    L-аргинин — это основная генетически кодируемая аминокислота, которая является незаменимой аминокислотой для развития человека. Он является предшественником оксида азота [13] и синтезируется организмом из орнитина. Аргинин был отнесен к категории условно незаменимых аминокислот [14].

    Аминокислоты

    Введение:

    Каждая аминокислота имеет по крайней мере одну аминную и одну кислотную функциональную группу. группа, как следует из названия. Различные свойства являются результатом вариации в строении различных R-групп. Группа R часто называют боковой цепью аминокислоты. Аминокислоты имеют специальные общеупотребительные имена, однако сокращенное трехбуквенное поскольку имя используется большую часть времени.Вторая аббревиатура , одна буква, используется в длинных белковых структурах. таблица слева для структуры, названий и сокращений 20 аминокислот.

    Существует четыре основных класса аминокислот. определяется разными боковыми цепями: (1) неполярными и нейтральными, (2) полярный и нейтральный, (3) кислый и полярный, (4) основной и полярный.

    Принципы полярности:

    Чем больше электроотрицательности разницы между атомов в связи, более полярная связь.Частичные отрицательные заряды находятся на наиболее электроотрицательных атомах, остальные частично положительный. Проверьте полярность функциональных группы.

    Неполярные боковые цепи:

    Боковые цепи, содержащие чистых углеводородных алкильных групп (алкановые ответвления) или ароматические (бензольные кольца) неполярные . Примеры включают валин, аланин, лейцин, изолейцин, фенилаланин.

    Число алкильных групп также влияет на полярность. Чем больше присутствует алкильных групп, тем неполярнее аминокислота. будет. Этот эффект делает валин более неполярным, чем аланин; лейцин более неполярен, чем валин.

    QUES. Перечислите все аминокислоты с неполярными боковыми цепями.

    Распределите следующие по возрастанию неполярность i.е. 1 = наименее неполярный, 4 = наиболее неполярный.
    лей; phe; val; аля
    Ответ 1 = аля 2 = val 3 = лей 4 = phe Рейтинг основан на увеличивающиеся числа CHs.

    Полярные боковые цепи:

    Боковые цепи, которые имеют различные функциональные группы, такие как кислоты, амиды, спирты и амины придадут более полярный символ к аминокислоте.Рейтинг полярности будет зависеть об относительном ранжировании полярности для различных функциональных групп как определено в функциональных группах. Кроме того, количество атомов углерода в алкане или ароматическая часть боковой цепи должна рассматриваться вместе с с функциональной группой.

    Пример: аспарагиновая кислота более полярна, чем серин, потому что кислотная функциональная группа более полярна, чем спиртовая группа.

    Пример: серин более полярен, чем треонин, поскольку треонин имеет на одну метильную группу больше, чем серин. Метильная группа дает немного более неполярный характер к треонину.

    Пример: серин более полярен, чем тирозин, поскольку тирозин имеет углеводородное бензольное кольцо.

    QUES. Перечислите все аминокислоты по аббревиатуре, которые считаются полярными
    .

    Оцените следующие аминокислоты по возрастающая полярность.т.е.
    1 = более неполярный.
    ser; glu; жерех; лиз; ала; gln
    Ответ 1 = аля 2 = лиз 3 = сер 4 = глю 5 = жерех 6 = gln
    Какая аминокислота наиболее нерастворима в воде: изолейцин или
    аланин?
    Ответ Изолейцин имеет больше CHs, поэтому больше нерастворим, чем ала.
    Какая аминокислота наиболее растворима в воде: лиз или сер? Ответ Сер, алкогольная группа более полярен, чем амин в лиз.

    Исследование влияния поверхностного лизина на мутагенез аргинина на стабильность и структуру белка с использованием зеленого флуоресцентного белка

    Abstract

    Две положительно заряженные основные аминокислоты, аргинин и лизин, в основном подвергаются воздействию поверхности белка и играют важную роль в стабильности белка, формируя электростатические взаимодействия.В частности, гуанидиниевая группа аргинина допускает взаимодействия в трех возможных направлениях, что позволяет аргинину образовывать большее количество электростатических взаимодействий по сравнению с лизином. Более высокое значение pKa основного остатка в аргинине может также вызывать более стабильные ионные взаимодействия, чем лизин. В этой статье сообщается об исследовании, можно ли использовать преимущества аргинина по сравнению с лизином для повышения стабильности белка. Вариант зеленого флуоресцентного белка (GFP) был создан путем мутации максимально возможного количества остатков лизина на поверхности в аргинины при сохранении активности.Когда стабильность варианта была исследована в диапазоне денатурирующих условий, вариант был относительно более стабильным по сравнению с контрольным GFP в присутствии химических денатурантов, таких как мочевина, щелочной pH и ионные детергенты, но термостабильность белка не была измененный. Смоделированная структура варианта указала на предполагаемые новые солевые мостики и взаимодействия водородных связей, которые помогают улучшить жесткость белка против различных химических денатурантов. Структурный анализ электростатических взаимодействий также подтвердил, что геометрические свойства гуанидиниевой группы в аргинине имеют такие эффекты.С другой стороны, измененные электростатические взаимодействия, вызванные мутагенезом поверхностных лизинов в аргинины, отрицательно влияют на укладку белка, что снижает продуктивность функциональной формы варианта. Эти результаты предполагают, что мутагенез поверхностного лизина с образованием аргининов можно рассматривать как один из параметров в инженерии стабильности белка.

    Образец цитирования: Sokalingam S, Raghunathan G, Soundrarajan N, Lee S-G (2012) Исследование влияния поверхностного лизина на мутагенез аргинина на стабильность и структуру белка с использованием зеленого флуоресцентного белка.PLoS ONE 7 (7): e40410. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0040410

    Редактор: Пермяков Евгений Александрович, Институт биологического приборостроения РАН, Российская Федерация

    Поступила: 14 марта 2012 г .; Одобрена: 6 июня 2012 г .; Опубликовано: 9 июля 2012 г.

    Авторские права: © 2012 Sokalingam et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

    Финансирование: Это исследование было поддержано Программой фундаментальных наук через Национальный исследовательский фонд Кореи (NRF), финансируемым Министерством образования, науки и технологий (NRF-2011-0021222). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

    Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

    Введение

    Устойчивость белка к нефизиологическим условиям, таким как высокие температуры, кислотный или щелочной pH и детергенты, является важной проблемой в промышленных процессах и с академической точки зрения.Повышение стабильности белка становится все более важным из-за растущего спроса на использование белков в качестве частей биоустройств, обрабатываемых и работающих в суровых условиях в дополнение к традиционным ферментативным процессам [1] — [3]. Глубокое понимание механизма сворачивания белка и структур белка дало понимание стабильности белка, что позволило разработать ряд подходов к инженерии белка для улучшения стабильности белка [4] — [8]. Например, стабильность белка можно повысить путем введения большего количества внутридисульфидных связей, создания более гидрофобных ядер или изменения поверхностных зарядов [9] — [12].Тем не менее, необходимо определить дополнительные параметры, относящиеся к стабильности белка, поскольку стабильность белка является кооперативным феноменом различных взаимодействий в белке.

    Аргинин и лизин — это положительно заряженные основные аминокислоты в физиологических условиях, которые в основном находятся на поверхности белка [13], [14]. Две аминокислоты на поверхности белка играют важную роль в стабильности белка, образуя ионные взаимодействия и водородные связи в белках, а также взаимодействуя с молекулами воды [15], [16].Хотя оба они функционируют как основные остатки, остаток аргинина обеспечивает структуру белка с большей стабильностью, чем лизин, благодаря своей геометрической структуре. Группа гуанидиния в аргинине допускает взаимодействия в трех возможных направлениях через три асимметричных атома азота (N ε , N η1 , N η2 ), тогда как основная функциональная группа лизина допускает только одно направление взаимодействия [ 17], [18]. Это позволяет аргинину образовывать большое количество электростатических взаимодействий, таких как солевые мостики и водородные связи по сравнению с лизином, что предположительно приводит к более сильным взаимодействиям, чем взаимодействия, генерируемые лизином.Эти эффекты были косвенно продемонстрированы путем сравнения числа солевых мостиков, генерируемых аргинином и лизином в ряде белков, а также путем анализа отношения аргинина к лизину и солевых мостиков в термофильных и мезофильных белках [19] — [23]. Помимо геометрического эффекта, ионные взаимодействия, образованные аргинином, могут быть более стабильными, чем взаимодействия лизинов, особенно при щелочном pH, из-за более высокого pKa основного остатка в аргинине, чем у лизина [24].

    Превосходство аргинина по биохимическим свойствам над лизином в отношении электростатических взаимодействий, описанных выше, поднимает следующий вопрос.Что произойдет с точки зрения стабильности и структуры белка, если остатки лизина на поверхности белка заменятся на аргинин? В частности, это исследование фокусируется на следующем: (1) может ли замена аргининов лизинами на поверхности белка вызывать больше электростатических взаимодействий в белке; (2) может ли такой мутагенез стабилизировать белок; и (3) какой тип стабильности можно улучшить мутагенезом. Ответив на эти вопросы, можно было бы не только более непосредственно идентифицировать влияние аргинина и лизина на стабильность и структуру белка, но и определить, можно ли рассматривать такой мутагенез как способ стабилизации белка.

    В этом исследовании была предпринята попытка ответить на поставленные выше вопросы путем мутации остатков лизина на поверхности белка в аргинин и изучения его влияния на стабильность белка и электростатические взаимодействия. В качестве модельной системы был использован зеленый флуоресцентный белок (GFP), белок с активным флуоресцентным центром, где сворачивание и разворачивание можно отслеживать по его спектральным свойствам [25]. GFP использовался в основном как репортерная система [26], но он также используется в биологических устройствах, таких как биочипы и биосенсоры [27], [28], которые требуют стабильности белков в суровых условиях.На первом этапе этого исследования поверхностные остатки лизина GFP были максимально мутированы в аргинины с учетом складчатости белка (рис. 1). На втором этапе стабильность варианта была исследована в ряде условий денатурации белка, таких как высокие температуры, мочевина, щелочной pH и детергенты. Влияние мутагенеза на электростатические взаимодействия было также исследовано путем анализа смоделированной структуры варианта. Наконец, обсуждается возможность того, что мутагенез поверхностного лизина до аргинина может быть подходом к инженерии стабильности белка.

    Рисунок 1. Структурное представление вариантов GFP.

    Трехмерное графическое изображение GFP con и GFP14R, показывающее поверхностные лизины (синий) и поверхностные аргинины (красный) в виде палочек, которые были мутированы в GFP14R. Графическое изображение было создано с помощью Discovery Studio Visualizer от Accelrys Software Inc.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0040410.g001

    Результаты

    Анализ электростатических взаимодействий в GFP

    Электростатические взаимодействия в GFP анализировали с использованием кристаллической структуры GFP дикого типа с PDB Id 1GFL [29].В таблице 1 перечислены солевые мостики и водородные связи, связанные с остатками лизина и аргинина в GFP. GFP содержит 20 аминокислот лизина и 6 аминокислот аргинина, что соответствует 8,4% и 2,5% его общего аминокислотного состава, соответственно. Для 20 лизинов один, 8 и 11 расположены в областях спирали, бета-цепи и петли, соответственно. Для 6 аргининов 4 и 2 расположены в областях бета-цепи и петли соответственно. Более 25% боковых цепей подвергаются действию растворителя для 19 остатков лизина и 5 остатков аргинина, которые в данном исследовании считались открытыми остатками.Остатки лизина и аргинина вносят вклад в 9 и 4 взаимодействия соляного мостика соответственно. Остатки, такие как K45, K113, R109 и R122, образуют сложные солевые мостики, взаимодействуя более чем с одним противоположно заряженным остатком, тогда как остальные представляют собой простые солевые мостики, образуя ионное взаимодействие с одной аминокислотой. Среднее количество солевых мостиков на лизин и аргинин составило приблизительно 0,45 и 0,66 соответственно. Анализ взаимодействий водородных связей показал, что среднее количество взаимодействий водородных связей на лизин и аргинин составляет примерно 2 и 3, соответственно.Эти результаты предполагают, что, как и большинство других белков, большинство остатков лизина и аргинина подвергаются действию растворителя, а аргинин в GFP образует больше электростатических взаимодействий, чем лизины.

    Мутагенез поверхностных лизинов в аргинины

    GFP mut3.1b , GFP быстрого сворачивания с мутациями S65G и S72A [30], был использован в качестве целевого белка GFP и обозначен в этом отчете как GFP con . В первоначальном исследовании мутагенеза все 19 подвергнутых воздействию поверхности лизиновых аминокислот GFP con были мутированы в аргинины, что привело к образованию варианта, обозначенного GFP19R.Когда вариант экспрессировался в Escherichia coli при 37 ° C, белок был полностью неправильно свернут in vivo (фигура S1). Экспрессия GFP19R при более низких температурах была выполнена для повышения эффективности сворачивания варианта, но этот подход оказался неэффективным для получения растворимого и свернутого белка (рис. S1).

    Эти результаты предполагают, что некоторые остатки лизина в GFP важны для правильной укладки GFP. Предыдущее сообщение подтвердило важность образования сверхстабильного ядра с β-тяжами 1, 3, 4, 5 и 6 в сворачивании GFP [31], что было использовано в качестве основы для преодоления проблемы неправильного сворачивания GFP19R.Поскольку пять лизинов (K41, K45, K107, K113, K126) в GFP участвовали в β-цепях образования сверхстабильного ядра, соответствующие пять остатков аргинина в GFP19R подверглись обратной мутации в лизины, которые образовали вариант GFP14R. GFP14R также был в основном неправильно свернут при экспрессии при 37 ° C (рисунок S1), но растворимая экспрессия и флуоресценция всей клетки были обнаружены при его производстве при более низких температурах, 25 ° C (рисунок S2), несмотря на гораздо более низкий уровень экспрессии, чем у GFP con . Это предполагает, что восстановление пяти лизинов, участвующих в формировании сверхстабильного ядра GFP, эффективно для небольшого повышения эффективности сворачивания GFP19R.Достаточное количество GFP14R могло быть достигнуто путем его экспрессии в течение более длительных периодов времени при 25 ° C, и белок был очищен для дальнейших исследований (рис. S2). Очищенный GFP14R показал такие же спектры возбуждения и излучения, что и GFP con (рис. 2), а его удельная интенсивность флуоресценции была аналогична таковой у GFP con (рис. S3). Эти результаты предполагают, что 14 мутаций Arg, введенные в поверхностные остатки Lys, оказали существенное неблагоприятное влияние на эффективность укладки GFP, но не повлияли значительно на конечную структуру GFP из-за его флуоресцентной активности.Хотя уровень экспрессии варианта GFP14R был намного ниже, чем у GFP con , способность варианта сворачиваться в активную форму побудила нас провести дальнейшие исследования его стабильности.

    Рис. 2. Спектральные свойства вариантов GFP.

    A) Возбуждение и B) Спектр излучения GFPcon и GFP14R. Все амплитуды произвольно нормированы на максимальное значение 1,0. (а.е. — условные единицы).

    https://doi.org/10.1371 / journal.pone.0040410.g002

    Влияние мутагенеза поверхностных лизинов на аргинины на стабильность GFP

    GFP14R, полученный в результате вышеуказанного исследования, содержал 19 поверхностных аргининов и 5 лизинов, тогда как GFP con содержал 19 поверхностных лизинов и 5 аргининов. Это предполагает наличие заметного различия в соотношении поверхностного Arg к Lys между двумя белками. Чтобы изучить влияние такого различия на стабильность GFP, стабильность очищенного GFP14R и GFP con исследовали в четырех различных условиях денатурации белка, т.е.е. высокие температуры, добавление мочевины, щелочной pH и добавление моющего средства.

    Сначала было исследовано влияние температуры на стабильность белков GFP. Температурно-зависимый анализ проводили путем инкубации GFP14R и GFP con в диапазоне температур в течение 30 минут и измерения их флуоресценции. Как показано на рисунке 3A, GFP14R и GFP con показали аналогичную устойчивость к температуре. Все они имели тенденцию постепенно терять свою флуоресценцию после 60 ° C и полностью теряли свою активность при 80 ° C.И GFP14R, и GFP con показали аналогичные модели, когда анализ, зависящий от времени, проводился при 70 ° C (рис. 3B). Их период полураспада при 70 ° C оценивается примерно в 8 минут. Эти результаты предполагают, что введенные мутации Arg в остатки Lys не повлияли на термостабильность GFP.

    Рис. 3. Влияние температуры на стабильность вариантов GFP.

    A) Образцы белка инкубировали при различных температурах в течение 30 минут и измеряли оставшуюся флуоресценцию.Флуоресценция в нулевой момент времени при соответствующих температурах была принята за 100%. B) Образцы белка инкубировали при 70 ° C в течение различных интервалов времени и измеряли оставшуюся флуоресценцию. Флуоресценцию в нулевой момент времени приняли за 100%. (Планка погрешностей — стандартное отклонение трех независимых экспериментов).

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0040410.g003

    Была протестирована стабильность варианта GFP14R против хаотропного денатуранта, мочевины. Очищенные образцы GFP14R и GFP con инкубировали с различными концентрациями мочевины от 4 M до 8 M при 50 ° C в течение 30 минут.Вариант GFP14R показал стабильность до 5 М мочевины, но начал терять свою активность от 6 М мочевины. Напротив, GFP con показал пониженную активность от 4 M мочевины (фиг. 4A). Когда анализ, зависящий от времени, был проведен с 6 М мочевиной при 50 ° C, период полураспада GFP14R и GFP con был оценен приблизительно как 93 и 51 минута, соответственно (Рисунок 4B), что позволяет предположить, что стабильность На GFP против мочевины положительно влиял мутагенез поверхностных лизинов до аргининов.

    Рис. 4. Влияние мочевины на стабильность вариантов GFP.

    A) Образцы белка инкубировали при 50 ° C с различными концентрациями мочевины от 4 M до 8 M в течение 30 минут и измеряли оставшуюся флуоресценцию. Флуоресценцию в нулевой момент времени при соответствующих концентрациях мочевины приняли за 100%. B) Образцы белка инкубировали при 50 ° C в присутствии 6 M мочевины в течение различных интервалов времени и измеряли оставшуюся флуоресценцию. Флуоресценцию в нулевой момент времени приняли за 100%.(Планка погрешностей — стандартное отклонение трех независимых экспериментов).

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0040410.g004

    Значения pKa аргинина и лизина составляют 12,48 и 10,53 соответственно [32], что может приводить к различной стабильности ионных взаимодействий, связанных с аргинином. остатки и остатки лизина при щелочном pH, как описано во введении. Чтобы оценить, может ли такой эффект вызывать разницу в устойчивости белка к щелочному pH, GFP con и GFP14R инкубировали при определенном диапазоне pH и измеряли их флуоресценцию после 30 минут инкубации при 60 ° C.Эксперименты показали, что и GFP14R, и GFP con относительно стабильны до pH 12,0, но GFP14R показал более высокую стабильность, чем GFP con при pH 13,0 (рис. 5A). Анализ, зависящий от времени, при pH 13,0 и 60 ° C подтвердил, что мутант GFP14R имеет более высокую стабильность, чем контроль (рис. 5B). При pH 13,0 период полураспада GFP con и GFP14R составлял 19 и 34 минуты соответственно. Эти результаты предполагают, что введенные мутации стабилизировали белок GFP до щелочного pH, как и ожидалось.

    Рис. 5. Влияние pH на стабильность вариантов GFP.

    A) Образцы белка инкубировали при 60 ° C в течение 30 минут в буферных растворах с различным pH и измеряли оставшуюся флуоресценцию. Флуоресценция в нулевой момент времени в соответствующем буфере была принята за 100%. B) Образцы белка в буфере KCl с pH 13,0 инкубировали при 60 ° C в течение различных интервалов времени и измеряли оставшуюся флуоресценцию. Флуоресценцию в нулевой момент времени приняли за 100%. (Планка погрешностей — стандартное отклонение трех независимых экспериментов).

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0040410.g005

    Два анионных детергента (додецилсульфат натрия (SDS) и додецилбензолсульфонат натрия (SDBS)) и два катионных детергента (бромид цетилтриметиламмония (CTAB) и хлорид додецилтриметиламмония (DTAC)) были протестированы для изучения влияния детергента на стабильность варианта GFP. GFP con и GFP14R инкубировали с 1% соответствующих детергентов и проводили анализ флуоресценции в зависимости от времени.Как показано на рисунке 6, хотя профили дезактивации различались в зависимости от добавленных детергентов, GFP14R всегда демонстрировал более высокую стабильность, чем GFP con . В таблице 2 приведен расчетный период полураспада (t 1/2 ) каждого варианта в присутствии ионных детергентов. Интересно, что эффект стабилизации был выше в анионных детергентах, чем в катионных детергентах. В частности, эффект был наиболее выражен в SDS. Стабильность GFP14R была дополнительно исследована в диапазоне концентраций SDS.Белки инкубировали с 1-5% SDS при 50 ° C в течение 30 минут и определяли их оставшуюся флуоресцентную активность. Как показано на рисунке 7, GFP con в основном инактивировался добавлением SDS при всех концентрациях, но GFP14R проявлял примерно 50% активности даже при 5% SDS. Эти результаты предполагают, что вариант GFP14R более жесткий и устойчивый к детергентам по сравнению с GFP con .

    Рис. 6. Влияние ионных детергентов на стабильность вариантов GFP.

    Пробы белка инкубировали с 1% SDS (A), 1% SDBS (B), 1% CTAB (C) и 1% DTAC (D) при 50 ° C в течение различных интервалов времени и измеряли оставшуюся флуоресценцию. Флуоресценция в нулевой момент времени для соответствующего детергента была принята за 100%. (Планка погрешностей — стандартное отклонение трех независимых экспериментов).

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0040410.g006

    Анализ электростатических взаимодействий GFP14R по отношению к лизину и аргинину

    Приведенные выше результаты подтвердили, что введение аргининов в 14 остатков Lys GFP увеличивало стабильность GFP против мочевины, щелочного pH и детергентов.Хотя на термостабильность GFP не влиял мутагенез, результаты предполагали возможность изменений во взаимодействиях, связанных с поверхностными основными остатками, в сторону стабилизации белка. Чтобы проверить возможность более прямо, изменения в электростатических взаимодействиях, вызванные мутациями, были исследованы путем анализа солевых мостиков и водородных связей в GFP14R. Ожидалось, что анализ также ответит на один из основных вопросов, описанных во введении: может ли замена аргининов лизинами на поверхности белка вызвать большее электростатическое взаимодействие в белке?

    Как упоминалось выше, сходные спектральные свойства GFP con и GFP14R (Рисунок 2) предполагают, что существенная структура GFP не может быть существенно изменена мутациями.Это побудило нас предсказать трехмерную структуру GFP14R методом минимизации энергии. Кристаллическая структура GFP с PDB Id 1GFL [29] использовалась в качестве шаблонной структуры при моделировании, что позволило нам предположить, что локальный минимум энергии моделируемого варианта GFP был его собственным состоянием. Структура GFP con также была смоделирована с использованием той же процедуры, что и контроль. Модели in silico GFP14R и GFP con не показали значительных отклонений от структуры шаблона со среднеквадратичным отклонением приблизительно 0.1 Å. Молекулярно-динамическое моделирование смоделированных структур показало, что среднеквадратичное отклонение (среднеквадратичное отклонение) для GFP con и GFP14R было в пределах 2,5 Å в течение 10 наносекундного моделирования (Рисунок S4), что подтвердило, что предсказанные модели были в значительной степени стабильный. При анализе электростатических взаимодействий двух смоделированных белков расстояние между N-O для электростатической пары, образующей сильное солевое мостиковое взаимодействие, было принято равным ≤4 Å, а водородная связь была определена с использованием критериев примерно 2.От 5 до 3,2 Å [16], [33].

    В таблице 3 перечислены солевые мостики и водородные связи, связанные с 19 поверхностными остатками Lys в моделированном GFP con , а также измененные взаимодействия в моделированном GFP14R для 19 остатков. Процесс минимизации энергии при моделировании GFP con предсказал три новых взаимодействия солевого мостика (K79-E5, K131-D103 и K166-D180) и 12 новых водородных связей по сравнению с взаимодействиями в исходной структуре GFP, показанной в таблице 1 , но было потеряно 8 водородных связей, сохранив солевые мостики.Это привело к образованию 11 солевых мостиков и 30 водородных связей, связанных с 19 поверхностными лизинами GFP con . С другой стороны, в модели GFP14R было обнаружено, что 16 солевых мостиков и 39 водородных связей вовлечены в 19 основных остатков. Это предполагает, что мутагенез поверхностных 14 лизинов к аргининам в конечном итоге вызвал добавление еще 5 солевых мостиков и 9 водородных связей. Сравнение 11 солевых мостиков в GFP con и 16 солевых мостиков в GFP14R показало, что 9 солевых мостиков GFP con сохранились, 2 солевых мостика GFP con были потеряны и 7 солевых мостиков были вновь образованы мутагенезом.Что касается водородных связей, 24 водородные связи GFP con были сохранены, 6 были потеряны и было образовано 15 новых водородных связей. Это ясно показывает, что введение аргининов в 14 поверхностных остатков лизина значительно изменило электростатические взаимодействия в GFP. Это также демонстрирует, что аргинин более благоприятен для образования солевых мостиков и водородных связей на поверхности белка, чем лизин. Повышенное количество электростатических взаимодействий GFP14R по сравнению с GFP con может быть одним из факторов, влияющих на улучшение стабильности, хотя точно определить, насколько сильно добавленные солевые мостики и водородные связи, индуцированные мутагенезом, способствовали повышению стабильности GFP, трудно. для определения, потому что другие факторы, такие как электростатические взаимодействия между основными остатками и молекулами воды, также могут влиять на стабильность белка.

    Рисунок 7. Влияние концентрации SDS на стабильность вариантов GFP.

    Пробы белка инкубировали с различными концентрациями SDS при 50 ° C в течение 30 минут и измеряли оставшуюся флуоресценцию. Флуоресценция в нулевой момент времени при соответствующих концентрациях SDS была принята за 100%. (Планка погрешностей — стандартное отклонение трех независимых экспериментов).

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0040410.g007

    Структурный анализ вновь образованных солевых мостиков в GFP14R

    Вышеупомянутое исследование электростатических взаимодействий в GFP14R показало, что добавление аргининов к остаткам лизина создает более благоприятные солевые мостики и водородные связи.Это коррелирует с различной геометрической структурой основных боковых цепей аргинина и лизина, описанной во введении. Вновь образованные 7 солевых мостиков мутации лизина и аргинина были исследованы структурно с использованием их смоделированных структур, чтобы более точно определить разницу между лизином и аргинином в образовании электростатических взаимодействий.

    В GFP con Lys79 образовывал солевой мостик с Glu5, тогда как аргинин в том же положении в GFP14R проявлял три различных взаимодействия (рис. 8A): два солевых мостика с Glu5 и Asp76 с использованием N η1 и N η2 и водородная связь с использованием N с карбонильным кислородом основной цепи Tyr74.Это изменение в боковой цепи в 79 -й позиции также способствовало образованию в его основной цепи азота водородных связей с основными цепями Pro75 и Asp76. Lys209 и Lys52 из GFP con не могли производить какое-либо взаимодействие соляной мостик, даже несмотря на то, что вокруг них имелся соответствующий заряженный остаток, Asp216. С другой стороны, когда аргинин был введен в эти два положения, как Arg209, так и Arg52 образовывали взаимодействия солевого мостика с Asp216 (Рисунок 8B). Потеря водородной связи между Arg209 и Tyr143 в GFP14R, которая присутствует в GFP con , может быть компенсирована новым солевым мостиком.Солевой мостик Lys131-Asp103 в GFP con был потерян в GFP14R, но Arg131 образовал солевой мостик с Asp133 (фиг. 8C). Солевой мостик с Asp103 был потерян, потому что N ε Arg131 благоприятствовал водородной связи, тогда как N η1 и N η2 благоприятствовал солевому мостику с Asp133. Взаимодействие с Asp103 поддерживается за счет водородной связи с его основной цепью. Открытая поверхность Arg3 в GFP14R, расположенная на гибком N-конце белка, показала возможность нового взаимодействия путем создания солевого мостика с Glu6 (рис. 8D).Боковая цепь Lys140 в GFP con образовывала две водородные связи с основной цепью Asp133 и Gly134. С другой стороны, гуанидиновая составляющая аргинина в этом положении в GFP14R образовывала новый солевой мостик с Asp173 с использованием N η1 , сохраняя водородные связи с использованием N ε с Gly134 и N η2 с Asp133 (рис. 8E ).

    Рис. 8. Структурное представление новых взаимодействий соляных мостиков.

    Сравнение расстояний взаимодействия солевого мостика между GFP con (левая панель) и GFP14R (правая панель): (A) Lys / Arg79-Glu5, (B) Lys / Arg209-Asp216 и Lys / Arg52-Asp216, ( C) Lys / Arg131-Asp103, (D) Lys / Arg3-Glu6 и (E) Lys / Arg140-Asp173.Черные прямые и зеленые пунктирные линии обозначают взаимодействия соляных мостиков и водородных связей соответственно. Графическое изображение было создано с помощью Discovery Studio Visualizer от Accelrys Software Inc.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0040410.g008

    Недавно предсказанные соляные мостики в GFP14R были ≤4 Å, тогда как они были ≥4 Å для GFP con в семи положениях. Шесть новых взаимодействий соляной мостик в GFP14R были сформированы в областях петли белка, за исключением солевого мостика K41-D36, где вариант не содержит мутации в K41.Аргинин принимает большее количество конформаций из-за своего размера, гибкости боковой цепи и большего количества атомов, способных нести заряды, чем лизин [16]. Предполагалось, что гибкость петли и геометрическое преимущество аргинина увеличивают вероятность большего количества электростатических взаимодействий в GFP14R.

    Расстояния между атомами, участвующими в новых ионных парах GFP14R, были дополнительно проанализированы путем выполнения молекулярно-динамического моделирования при комнатной температуре для повышения точности вновь образованных солевых мостиков.Два (R52-D216 и R140-D173) солевых мостика, предсказанные с использованием смоделированной структуры GFP14R, показали меньшее изменение расстояния в течение 10 наносекунд моделирования, чем GFP con , в то время как расстояние между атомами для оставшейся соли- мосты оказались похожими на GFP con (Рисунок S5). Эти результаты динамического моделирования предполагают возможность того, что предсказанные солевые мосты с использованием статических смоделированных структур не были согласованными для всех случаев.

    Обсуждение

    Изучено влияние мутации поверхностного лизина GFP на аргинин на стабильность и структуру белка. Вариант GFP14R был получен заменой 14 поверхностных лизинов природного GFP на аргинин и сохранением 5 поверхностных лизинов, участвующих в формировании сверхстабильной сердцевинной структуры GFP. Вариант показал низкую скорость складывания (рис. S6), но его окончательная структура предположительно не изменилась. Тесты на стабильность варианта показали, что мутагенез поверхностного лизина до аргинина был эффективным в повышении стабильности GFP против мочевины, щелочного pH и детергентов, но не влиял на термостабильность GFP.Структурный анализ электростатических взаимодействий подтвердил не только то, что в результате мутаций возникли дополнительные солевые мостики и водородные связи, но и геометрические свойства гуанидиниевой группы в Arg. Эти результаты показали следующее: 1) введение аргининов на поверхностные остатки лизина может стабилизировать белок, но эффект может различаться в зависимости от условий денатурации; 2) мутагенез поверхностного лизина до аргинина может вызывать изменения электростатических взаимодействий дополнительным образом, что может быть фактором повышения стабильности; и 3) такой мутагенез может неблагоприятно повлиять на укладку белка.

    Интересно, что термическая стабильность GFP не была изменена мутагенезом, тогда как стабильность против мочевины, щелочного pH и детергентов была улучшена. Одним из объяснений этого может быть различие в механизме термической денатурации и другой денатурации, опосредованной химическими веществами. В случае тепловой денатурации энергия, передаваемая белку, вызывает общее движение атомов в белке, что приводит к неспецифическому и одновременному нарушению различных взаимодействий для сворачивания белка.Следовательно, усиленные электростатические взаимодействия, вызванные мутагенезом, могут не так эффективно предотвращать термическую денатурацию в диапазоне обнаружения. Кроме того, взаимодействия, образующиеся на поверхности белка, как в этом случае, лишь незначительно влияют на термостабильность белка [34], что может еще больше усилить такой эффект. С другой стороны, мочевина, щелочной pH и ионные детергенты начинают денатурировать белки, взаимодействуя со специфическими атомами, участвующими в электростатических взаимодействиях в белке.Следовательно, лизины и аргинины, обычно участвующие в электростатических взаимодействиях, могут подвергаться более специфическому и чувствительному воздействию добавленных химических денатурантов. Конечно, для более точного понимания эффекта потребуются дальнейшие исследования.

    В исследовании влияния pH GFP14R показал более высокую стабильность, чем GFP con при pH 13,0. Теоретическая оценка протонированных состояний основных остатков Arg и Lys на основе pKa их боковой цепи показала, что 20% боковых цепей аргинина протонированы при pH 13.0, тогда как большинство боковых цепей Lys депротонируются при этом pH (фигура S7). Это может привести к различию ионных взаимодействий на поверхности двух белков GFP и объяснить более низкую стабильность GFP con , чем GFP14R при щелочном pH. С другой стороны, GFP con был относительно стабилен при ph22 (рис. 5A), несмотря на почти полное депротонирование основного остатка Lys при этом pH (рис. S7), что предполагает отсутствие прямой корреляции между ионными состояниями Теоретически оценены остатки Lys и стабильность GFP.Разница между pH окружающей среды на поверхности белка и pH в объеме растворителя может привести к такому результату. Кроме того, на гидрофильные аминокислоты, отличные от Arg и Lys, также может влиять pH, что также может вызывать такой эффект.

    Исследование влияния ионного детергента на стабильность GFP показало, что отрицательно заряженные детергенты, такие как SDS, имели более заметный эффект, чем положительно заряженный детергент. Это можно объяснить, рассмотрев механизм разворачивания белка, вызванный детергентом.Хотя точный механизм неясен, было высказано предположение, что разворачивание белка ионными детергентами представляет собой комбинацию гидрофобных и электростатических взаимодействий [35] — [37]. Предыдущее исследование денатурации белка, индуцированной SDS, показало, что SDS связывается с полипептидной цепью сначала за счет гидрофобного взаимодействия с последующим отталкиванием заряда-заряда между мицеллами SDS и анионными боковыми цепями белка по мере увеличения концентрации SDS [38] — [40]. При поверхностном мутагенезе Lys в Arg частота аргинина увеличивалась с 2.От 5% до 8,4% для GFP14R, в результате чего среда на поверхности белка становится все более положительно заряженной. Следовательно, отрицательно заряженная гидрофильная головка анионного детергента может более благоприятно связываться с этими положительно заряженными боковыми цепями аргинина в GFP14R, тем самым уменьшая возможность отталкивания заряда-заряда, необходимого для дальнейшей денатурации. Это может быть дополнительным фактором для повышения стабильности GFP по отношению к анионным детергентам в дополнение к эффекту усиленных электростатических взаимодействий в белке, что может привести к более заметному эффекту для анионных детергентов.

    При анализе электростатических взаимодействий GFP14R с использованием модели минимизированной энергии было предсказано, что 7 новых солевых мостиков были образованы путем добавления аргининов в 6 остатков лизина (K3, K52, K79, K131, K140 и K209) GFP. против . Чтобы оценить, насколько новообразованные солевые мостики способствуют стабильности GFP14R, был создан вариант GFP6R, имеющий аргинины вместо лизинов в этих шести положениях, и его стабильность сравнивали с GFPcon и GFP14R.Стабильность GFP6R тестировали в денатурирующих условиях, таких как 1% SDS и щелочной pH 13,0, условиях, в которых GFP14R показал преимущественно более высокую стабильность. Интересно, что стабильность GFP6R не была улучшена и аналогична контролю GFP (рисунок S8). Эти результаты означают, что предсказанные новые солевые мостики не являются эффективным стабилизирующим фактором для повышенной стабильности GFP14R. Согласно молекулярно-динамическому исследованию изменения расстояния между ионными парами (Рисунок S5), существует вероятность того, что только два солевых мостика эффективны среди 6 солевых мостиков, что подтверждает этот экспериментальный результат.Мы предполагаем, что повышенная стабильность GFP14R была вызвана коллективными эффектами новых электростатических взаимодействий, включая взаимодействия аминокислоты с водой, а также взаимодействия аминокислоты с аминокислотами, генерируемые недавно введенными 14 аргининами. Для объяснения такого рода коллективных эффектов могут потребоваться дальнейшие подробные исследования.

    Из исследования экспрессии GFP14R, белок GFP продуцировался в основном в нерастворимой форме, а продуктивность растворимой формы была низкой. Скорость сворачивания GFP14R была подтверждена как низкая по сравнению с GFP con (Рисунок S6).С другой стороны, GFP14R показал более высокую стабильность к химическим денатурантам и сопоставимую термическую стабильность по сравнению с GFP con . Эти результаты показывают, что мутации, внесенные на поверхность, отрицательно повлияли на сворачивание белка, но белок был стабильным после сворачивания. Это означает, что измененные электростатические взаимодействия, вызванные мутагенезом, стабилизировали GFP кинетически, а не термодинамически. Для более точного понимания механизма стабилизации могут потребоваться дальнейшие термодинамические и кинетические исследования.

    Стратегия мутагенеза в настоящем исследовании все еще имеет ограничения, применимые непосредственно к стабилизации белка. Например, скорость сворачивания белка значительно снизилась из-за мутагенеза, что может вызвать проблему продукции целевого белка. Кроме того, только GFP был протестирован как целевой белок. Эффект мутагенеза может различаться в зависимости от свойств целевых белков. Многие факторы, такие как исходная стабильность белка, структура белка, количество и расположение поверхностных остатков лизина, могут по-разному влиять на эффективность укладки и стабильность целевых белков в зависимости от мутагенеза.Следовательно, существует необходимость в дальнейшем изучении этих эффектов с использованием других белков. Тем не менее, это исследование имеет смысл, поскольку влияние Lys и Arg на стабильность белка изучалось более непосредственно по сравнению с другими исследованиями. Это исследование подчеркивает возможность того, что мутагенез поверхностного лизина до аргининов можно рассматривать как один из параметров в инженерии стабильности белка.

    Материалы и методы

    Материалы

    Бактерия-хозяин E. coli штамм DH5α была использована для получения плазмидной ДНК.Штамм BL21 (DE3) E. coli использовали в качестве хозяина экспрессии для продукции рекомбинантных вариантов GFP. Реагенты для ПЦР и ДНК-лигаза Т4 были приобретены в New England Biolabs. Эндонуклеазы рестрикции были получены от Fermentas. IPTG (изопропил-D-тиогалактопиранозид), додецилсульфат натрия (SDS), додецилбензолсульфонат натрия (SDBS), бромид цетилтриметиламмония (CTAB), додецилтриметиламмонийхлорид (DTAC) и другие химические вещества были приобретены у Sigma Chemicals (St.Луис, Миссури, США). Аффинная колонка с Ni-NTA HisTrapHP была предоставлена ​​компанией GE healthcare (Швеция). Вектор pET30b был получен от Novagen.

    Построение плазмиды

    Гены GFP con , GFP19R, GFP14R и GFP6R были синтезированы Genscript Corporation (Нью-Джерси, США). Синтезированные гены клонировали в сайты рестрикции NdeI и XhoI вектора pET30b с гексагистидиновой меткой на С-конце.

    Экспрессия и очистка вариантов GFP

    Варианты GFP, клонированные в вектор pET30b, трансформировали в штамм BL21 (DE3) для экспрессии.Белки экспрессировали при 37 ° C в течение пяти часов, если не указано иное, после индукции 1 мМ IPTG при O.D. 0,6–0,8. Лизат клеток был приготовлен из осадка клеток, соответствующего 1 мл 3 O.D. клетки с использованием набора для экстракции белков BugBuster (Novagen) и центрифугировали при 12000 об / мин в течение 30 минут для разделения растворимой и нерастворимой фракций для анализа SDS-PAGE. Вариант GFP14R экспрессировали при 25 ° C в течение 20 часов для увеличения выхода белка. Клетки собирали центрифугированием при 5000 об / мин в течение 15 минут и ресуспендировали в буфере PBS (фосфатно-солевой буфер — 137 мМ NaCl, 2.7 мМ KCl, 10 мМ Na 2 HPO 4 , 2 мМ KH 2 PO 4 и pH 7,4). Клетки разрушали с помощью French Press и центрифугировали при 20000 об / мин в течение 30 минут при 4 ° C для сбора растворимой фракции. Затем растворимые белки очищали с использованием колонки Ni-NTA объемом 5 мл, уравновешенной 50 мМ натрий-фосфатным буфером (50 мМ фосфат натрия, полученный из 1 М Na 2 HPO 4 и 1 М NaH 2 PO 4 , 300 мМ NaCl, pH 7,4), содержащий 10 мМ имидазол.Затем колонку промывали 5 объемами колонки 50 мМ натрий-фосфатного буфера, содержащего 50 мМ имидазол, и элюирование проводили, используя 50 мМ натрий-фосфатный буфер, содержащий 500 мМ имидазол. Фракции элюции анализировали с помощью SDS-PAGE, фракции, обогащенные рекомбинантными белками, собирали и подвергали диализу буфером PBS, pH 7,4. Концентрации очищенных образцов белка определяли с использованием спектрофотометра UV / VIS при 280 нм с использованием коэффициента экстинкции, рассчитанного на основе последовательностей белков.

    Измерение флуоресценции

    Флуоресценцию целых клеток вариантов GFP измеряли с использованием счетчика Perkin Elmer / Wallac Victor 2 Multilabel (1420-011) с возбуждением и испусканием при 485 нм и 515 нм соответственно из щелей 5,0 нм после ресуспендирования осадка клеток в буфере PBS. Спектр возбуждения и испускания очищенных образцов белка 5 мкМ измеряли с использованием спектрофлуориметра Perkin Elmer LS-55 со щелями возбуждения / испускания 2,5 нм. Если не указано иное, флуоресценцию измеряли с образцами белка 5 мкМ с использованием 96-луночных планшетов с помощью счетчика Perkin Elmer / Wallac Victor 2 Multilabel Counter для всех анализов стабильности.

    Термическая стабильность вариантов GFP

    Температурно-зависимый анализ проводили путем инкубации образцов при температуре от 40 ° C до 100 ° C с интервалами 10 ° C в течение 30 минут, а флуоресценцию измеряли при комнатной температуре. Анализ, зависящий от времени, проводили путем инкубации образцов при 70 ° C в течение 30 минут с 10-минутными интервалами, а флуоресценцию измеряли при комнатной температуре.

    Стабильность вариантов GFP при различных значениях pH

    Образцы белка инкубировали с рядом буферов, содержащих pH 8.0 (50 мМ трис-HCl), pH 10,0 (50 мМ карбонат натрия), pH 12,0 и pH 13,0 (50 мМ KCl) при 60 ° C в течение 30 минут, и флуоресценцию измеряли при комнатной температуре. Кроме того, был проведен зависимый от времени анализ путем инкубации образцов с 50 мМ KCl (pH 13,0) при 60 ° C до 60 минут с 10-минутными интервалами, а флуоресценция измерялась при комнатной температуре.

    Устойчивость вариантов GFP к воздействию мочевины и ионных детергентов

    Для определения устойчивости вариантов к химическим денатурантам образцы инкубировали с 6 М мочевиной при 50 ° C в течение различных интервалов времени до 30 минут и измеряли флуоресценцию при комнатной температуре.Стабильность вариантов также измеряли в присутствии ионных детергентов, таких как додецилсульфат натрия (SDS) и додецилбензолсульфонат натрия (SDBS), которые являются анионными, и бромид цетилтриметиламмония (CTAB) и хлорид додецилтриметиламмония (DTAC), которые являются катионный. Для этого образцы инкубировали с 1% детергента при 50 ° C в течение различных интервалов времени до 60 минут. Кроме того, стабильность вариантов измеряли при различных концентрациях SDS, начиная от 1% до 5%, инкубируя образцы при 50 ° C в течение 30 минут.Во всех вышеупомянутых экспериментах pH образцов белка поддерживали на уровне 7,4 с помощью буфера PBS.

    Рефолдинг вариантов GFP

    Эффективность сворачивания вариантов GFP оценивали путем денатурирования образцов белка в суровых условиях и давали возможность повторно укладываться после разведения. Образцы белка с концентрацией 25 мкМ денатурировали путем инкубации при 95 ° C в течение 5 минут в буфере PBS, содержащем 8 М мочевину и 5 мМ дитиотреитол (DTT). Денатурированные образцы разбавляли в 100 раз с использованием буфера PBS, содержащего 5 мМ ДДТ, и флуоресценцию измеряли при комнатной температуре в течение 30 минут с интервалом времени 3 секунды с использованием спектрофлуориметра Perkin Elmer LS-55 (возбуждение 490 нм, испускание 511 нм, 2.Щель возбуждения / испускания 5 нм). Восстановленную флуоресценцию нормализовали к 1 путем деления на максимальное значение флуоресценции спектров.

    Моделирование и моделирование молекулярной динамики вариантов GFP

    Трехмерная структура GFP con и вариант моделировались с использованием структуры GFP с PDB Id 1GFL в качестве шаблона [29]. Модели были созданы с использованием протокола Build Homology Models из модуля Protein Modeling Discovery Studio 2.0 (Accelrys Software Inc., Сан-Диего, Калифорния, США). Минимизация энергии была выполнена с использованием протокола минимизации из модуля моделирования Discovery Studio 2.0 в соответствии с методом сопряженного градиента после набора текста с автоматическим назначением силового поля Momany & Rone CHARMm и отсечки несвязанных взаимодействий, установленной от 10 до 12 Å. . В качестве растворителя использовались диэлектрики, зависящие от расстояния, с диэлектрической проницаемостью, равной 4, чтобы имитировать экранирующие эффекты растворителя на неочищенном уровне.Циклы минимизации энергии выполнялись для 3000 шагов до тех пор, пока допуск на градиент RMS не стал ≤0,1 ккал · моль -1 Å -1 . Модели in silico вариантов GFP показали лишь небольшое отклонение от структуры шаблона со среднеквадратичным отклонением приблизительно 0,1 Å. Взаимодействие солевой мостик и водородная связь анализировали с помощью Discovery Studio 2.0 (Accelrys Software Inc., Сан-Диего, Калифорния, США). Предсказанные варианты GFP, сгенерированные выше путем молекулярного моделирования, были приняты в качестве стартовой структуры для выполнения молекулярно-динамического (МД) моделирования с использованием пакета МД-моделирования GROMACS 4.5.5 [41]. С помощью силового поля GROMOS96 53a6 структура была центрирована в кубической элементарной ячейке на расстоянии 1,0 нм от края ящика и сольватирована с использованием модели воды SPC / E. Затем систему нейтрализовали с помощью Na + и Cl в качестве противоионов и минимизировали энергию, используя алгоритм наискорейшего спуска для 2000 шагов. Система с минимизированной энергией была уравновешена с использованием моделирования с ограничением положения в ансамбле NVT (постоянное количество частиц, объем и температура) в течение 100 пикосекунд для стабилизации температуры на уровне 300 K с помощью термостата Берендсена, за которым следует ансамбль NPT (постоянное число частиц, давления и температуры) в течение 100 пикосекунд, чтобы стабилизировать давление на 1.0 бар с коэффициентом сопряжения по давлению Парринелло-Рахмана. Наконец, произвольное моделирование МД было выполнено в течение 10 наносекунд с термостатом Берендсена 300 К и давлением 1,0 бар с коэффициентом связи давления Парринелло-Рахмана. Утилиты trjconv, g_rms, make_ndx и g_dist из GROMACS 4.5.5 использовались для анализа результатов MD.

    Вспомогательная информация

    Рисунок S1.

    Гель SDS-PAGE показывает профиль экспрессии белка. A) Дорожки 1 и 2 указывают на растворимую фракцию GFP con и GFP19R, соответственно, а дорожки 4 и 5 указывают на нерастворимую фракцию GFP con и GFP19R, соответственно, индуцированную 1 мМ IPTG при 37 ° C для 5 часов.Дорожки 3 и 6 показывают растворимую и нерастворимую фракции GFP19R, соответственно, индуцированные 1 мМ IPTG при 25 ° C в течение 5 часов. B) Дорожка 1 и 2 указывают растворимую фракцию GFP , con и GFF14R, соответственно, а дорожка 3 указывает нерастворимую фракцию GFP14R, индуцированную 1 мМ IPTG при 37 ° C в течение 5 часов. Дорожка М — белковый маркер.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0040410.s001

    (TIF)

    Рисунок S2.

    A) Гель SDS-PAGE показывает профиль экспрессии белка GFP con и GFP14R, индуцированный 1 мМ IPTG при 25 ° C в течение 5 часов.Дорожки 1 и 2 показывают растворимую фракцию GFP con и GFF14R, соответственно, а дорожки 3 и 4 указывают нерастворимую фракцию GFP con и GFF14R, соответственно. Дорожки 5 и 6 показывают очищенный белок GFP con и GFP14R соответственно. Дорожка М — белковый маркер. B) Флуоресценция целых клеток GFP con и GFP14R, нормализованная по оптической плотности при 600 нм. (а.е. — условные единицы).

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0040410.s002

    (TIF)

    Рисунок S6.

    Денатурация и рефолдинг вариантов GFP. Эффективность сворачивания вариантов GFP измеряли путем денатурации в 8 М мочевине при 95 ° C с последующим ренатурацией путем разбавления при комнатной температуре. Нормированную флуоресценцию в произвольных единицах (а.е.) наносили на график зависимости от времени.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0040410.s006

    (TIF)

    Рисунок S7.

    Состояния протонирования были оценены теоретически с использованием уравнения log ([AH] / [A ]) = pKa-pH. Значения pKa боковой цепи лизина (pKa 10,53) и аргинина (pKa 12,48) использовали для оценки отношения [AH] к [A ] для каждого pH и преобразовывали в процент.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0040410.s007

    (TIF)

    Рисунок S8.

    A) Стабильность вариантов GFP в присутствии 1% SDS при 50 ° C в течение 30 минут. Флуоресценция в нулевой момент времени в 1% SDS была принята за 100%. B) Стабильность вариантов GFP в присутствии 50 мМ буфера KCl pH 13.0 при 60 ° C в течение 30 минут. Флуоресценция в нулевой момент времени при pH 13,0 была принята за 100%. (Планка погрешностей — стандартное отклонение трех независимых экспериментов).

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0040410.s008

    (TIF)

    Благодарности

    Авторы хотели бы поблагодарить профессора Хёндона Юна, Школа биотехнологии, Университет Йоннам, Южная Корея, за предоставление флуоресцентного спектрофотометра.

    Вклад авторов

    Задумал и спроектировал эксперименты: SS S-GL.Проведены эксперименты: СС ГР НС. Проанализированы данные: SS S-GL GR. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: S-GL. Написал статью: SS S-GL.

    Список литературы

    1. 1. Маррс Б., Делагрейв С., Мерфи Д. (1999) Новые подходы к открытию промышленных ферментов. Curr Opin Microbiol 2: 241–245.
    2. 2. Черри Дж. Р., Фиданцеф А. Л. (2003) Направленная эволюция промышленных ферментов: обновление. Curr Opin Biotechnol 14: 438–443.
    3. 3. Кирк О., Borchert TV, Fuglsang CC (2002) Промышленные применения ферментов.Curr Opin Biotechnol 13: 345–351.
    4. 4. Эйсинк В., Бьорк А., Гасейднес С., Сиреваг Р., Синстад Б. и др. (2004) Рациональная инженерия стабильности ферментов. J Biotechnol 113: 105–120.
    5. 5. Латтман Э. Э., Роуз Г. Д. (1993) Сворачивание белка — в чем вопрос? Proc Natl Acad Sci U S A 90: 439–441.
    6. 6. Baker D (2000) Удивительная простота сворачивания белка. Nature 405: 39–42.
    7. 7. Radford SE (2000) Сворачивание белка: достигнутый прогресс и перспективы на будущее.Тенденции Biochem Sci 25: 611–618.
    8. 8. Даггетт В., Фершт А.Р. (2003) Существует ли объединяющий механизм для сворачивания белков? Тенденции Biochem Sci 28: 18–25.
    9. 9. Тайгерстром А., Шварц Ф., Карлссон Г., Оквист М., Эльварес-Руа С. и др. (2004) Влияние новой дисульфидной связи и инженерных электростатических взаимодействий на термостабильность Азурина. Биохимия 43: 12563–12574.
    10. 10. Northey JGB, Di Nardo AA, Davidson AR (2002) Гидрофобная упаковка ядра в переходном состоянии сворачивания домена Sh4.Nat Struct Biol 9: 126–130.
    11. 11. Джексон С.Е., ЭльМасри Н., Фершт А.Р. (1993) Структура гидрофобного ядра в переходном состоянии для свертывания ингибитора химотрипсина 2: критический тест метода анализа белковой инженерии. Биохимия 32: 11270–11278.
    12. 12. Махатадзе Г.И., Лоладзе В.В., Грибенко А.В., Лопес М.М. (2004) Механизм термостабилизации в разработанном протеине холодового шока с оптимизированными поверхностными электростатическими взаимодействиями. J Mol Biol 336: 929–942.
    13. 13. Кумар С., Цай С. Дж., Нусинов Р. (2000) Факторы, повышающие термостабильность белка. Protein Eng 13: 179–191.
    14. 14. Yokota K, Satou K, Ohki S-y (2006) Сравнительный анализ термостабильности белков: различия в содержании и замене аминокислот на поверхности и в центральных областях термофильных и мезофильных белков. Наука и технология передовых материалов 7: 255–262.
    15. 15. Стриклер С.С., Грибенко А.В., Грибенко А.В., Кейффер Т.Р., Томлинсон Дж. И др.(2006) Стабильность белка и поверхностная электростатика: заряженная взаимосвязь. Биохимия 45: 2761–2766.
    16. 16. Barlow DJ, Thornton JM (1983) Ионные пары в белках. J Mol Biol 168: 867–885.
    17. 17. C.l. Бордерс Дж., Бродвотер Дж. А., Бекени П. А., Салмон Дж. Э., Ли А. С. и др. (1994) Структурная роль аргинина в белках: множественные водородные связи с карбонильными атомами кислорода в основной цепи. Protein Sci 3: 541–548.
    18. 18. Дональд Дж. Э., Кулп Д. В., ДеГрадо В. Ф. (2011) Солевые мосты: геометрически определенные, проектируемые взаимодействия.Белки: Struct Funct Bioinform 79: 898–915.
    19. 19. Мусафия Б., Бюхнер В., Арад Д. (1995) Сложные солевые мостики в белках: статистический анализ структуры и функции. J Mol Biol 254: 761–770.
    20. 20. Matsutani M, Hirakawa H, Nishikura M, Soemphol W., Ali IAI, et al. (2011) Повышенное количество солевых мостиков на основе аргинина способствует термотолерантности термотолерантных уксуснокислых бактерий, Acetobacter tropicalis SKU1100. Biochem Biophys Res Commun 409: 120–124.
    21. 21. Кумар С., Нусинов Р. (1999) Стабильность солевого мостика в мономерных белках. J Mol Biol 293: 1241–1255.
    22. 22. Strub C, Alies C, Lougarre A, Ladurantie C, Czaplicki J, et al. (2004) Мутация экспонированных гидрофобных аминокислот на аргинин для повышения стабильности белка. BMC Biochem 5: 9.
    23. 23. Chan C-H, Yu T-H, Wong K-B (2011) Стабилизирующий солевой мостик повышает термостабильность белка за счет уменьшения изменения теплоемкости разворачивания.PLoS One 6: e21624.
    24. 24. Turunen O, vuorio M, Fenel F, Leisola M (2002) Разработка множества аргининов на поверхности Ser / Thr 1,4-β-ксиланазы II Trichoderma ressei endo- увеличивает термотолерантность и сдвигает оптимум pH в сторону щелочного pH. . Protein Eng 15: 141–145.
    25. 25. Reid BG, Flynn GC (1997) Образование хромофора в зеленом флуоресцентном белке. Биохимия 36: 6786–6791.
    26. 26. Waldo GS, Standish BM, Berendzen J, Terwilliger TC (1999) Быстрый анализ сворачивания белка с использованием зеленого флуоресцентного белка.Нат Биотех 17: 691–695.
    27. 27. Rusmini F, Zhong Z, Feijen J (2007) Стратегии иммобилизации белков для белковых биочипов. Биомакромолекулы 8: 1775–1789.
    28. 28. Павор Т.В., Чо Ю.К., Шуста Е.В. (2009) Разработка биосенсоров на основе GFP, обладающих связывающими свойствами антител. Proc Natl Acad Sci U S. A 106: 11895–11900.
    29. 29. Ян Ф, Мосс Л.Г., Филлипс Г.Н. (1996) Молекулярная структура зеленого флуоресцентного белка. Нат Биотех 14: 1246–1251.
    30. 30. P. Cormack B, H.Valdivia R, Falkow S (1996) оптимизированные для FACS мутанты зеленого флуоресцентного белка (GFP). Gene 173: 33–38.
    31. 31. Хуанг Дж-р, Сюй С-ТД, Христодулу Дж., Джексон С.Е. (2008) Чрезвычайно медленно обменивающееся ядро ​​и кислотно-денатурированное состояние зеленого флуоресцентного белка. HFSP J 2: 378–387.
    32. 32. Бойл Дж. (2005) Принципы биохимии Ленингера (4-е изд.): Нельсон, Д., и Кокс, М. Биохимия и молекулярная биология, образование 33: 74–75.
    33. 33. Макдональд И.К., Торнтон Дж.М. (1994) Удовлетворение водородно-связывающего потенциала в белках. J Mol Biol 238: 777–793.
    34. 34. Такано К., Цучимори К., Ямагата Ю., Ютани К. (2000) Вклад солевых мостиков вблизи поверхности белка в конформационную стабильность. Биохимия 39: 12375–12381.
    35. 35. Тимашев С.Н. (2002) Гидратация белков, термодинамическое связывание и предпочтительная гидратация. Биохимия 41: 13473–13482.
    36. 36.Гитлин I, Гудиксен К.Л., Whitesides GM (2006) Перацетилированная бычья карбоангидраза (BCA-Ac18) кинетически более стабильна, чем нативные BCA, по отношению к додецилсульфату натрия. J. Phys Chem B 110: 2372–2377.
    37. 37. Otzen DE, Christiansen L, Schülein M (1999) Сравнительное исследование развертывания эндоглюканазы Cel45 из Humicola insolens в денатуранте и поверхностно-активном веществе. Protein Sci 8: 1878–1887.
    38. 38. Бхуян А.К. (2010) О механизме денатурации белков, индуцированной SDS.Биополимеры 93: 186–199.
    39. 39. Нильсен М., Андерсен К., Вест П., Отцен Д. (2007) Развертывание белков β-листа в SDS. Biophys J 92: 3674–3685.
    40. 40. Ся К., Мэннинг М., Хешам Х., Линь К., Быстрофф С. и др. (2007) Идентификация субпротеома кинетически стабильных белков с помощью диагонального 2D SDS / PAGE. Proc Natl Acad Sci U S A 104: 17329–17334.
    41. 41. Хесс Б., Кутцнер С., ван дер Споэл Д., Линдал Э. (2008) GROMACS 4: Алгоритмы для высокоэффективного, сбалансированного по нагрузке и масштабируемого молекулярного моделирования.J Chem Theory Comput 4: 435–447.

    Документ без названия

    Аминокислоты

    Белковые молекулы состоят из большого количества связанных друг с другом мономеров. Аминокислоты являются именно этими мономерами или строительными блоками, играющими важную роль в метаболизме живого организма, поскольку аминокислоты необходимы для поддержания азотного баланса и стимулирования роста.Более того, аминокислоты оказывают сильное влияние на питательную ценность пищевых продуктов, поскольку они непосредственно влияют на вкус и являются предшественниками некоторых соединений, которые образуются во время приготовления, хранения и приготовления пищи. Белки гидролизуются до двадцати различных аминокислот, девятнадцать из которых являются α-аминокислотами — это означает, что аминогруппа (Nh3) связана с атомом углерода, соседним с карбоксильной группой. Общая формула — RCH (Nh3) COOH, в которой радикал R (боковая цепь) находится в диапазоне от простого атома водорода (для глицина) до более сложных алифатических, ароматических или гетероциклических групп.Единственным исключением из этой общей формулы является пролин, поскольку группа Nh3 включена в пятиуглеродную циклическую структуру. Название каждой аминокислоты сокращается трехбуквенным кодом, основанным на первых трех буквах их названий (рис. 1).

    Определенная боковая цепь R каждой аминокислоты влияет на их физические и химические свойства и, следовательно, на свойства белков. В соответствии с полярностью R (рис. 1) можно сгруппировать аминокислоты в четыре класса: (i) незаряженные неполярные боковые цепи (аланин, глицин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин), (ii) незаряженная полярная боковая цепь (серин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин), (iii) заряженная боковая цепь (положительный заряд: лизин, аргинин и гистидин; отрицательный заряд: аспарагиновая и глутаминовая кислоты).

    Фиг.1. Химическая структура, название и трехбуквенный код для различных аминокислот.

    С точки зрения питания, аминокислоты подразделяются на две группы: незаменимые (аминокислоты, которые люди не могут синтезировать и, следовательно, должны быть получены с пищей) — валин, лейцин, изолейцин, фенилаланин, триптофан, метионин, гистидин, треонин, лизин и аргинин (полужидкие) и заменимые — глицин, аланин, пролин, серин, цистеин, тирозин, аспарагин, глутамин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты.Заменимые аминокислоты так же важны, как и незаменимые, поскольку они незаменимы в физиологических процессах организма, тем не менее, люди могут жить без их присутствия в рационе. Например, цистеин и тирозин незаменимы для взрослых людей, но не существенны, поскольку организм вырабатывает первый из метионина, а второй — из фенилаланина.

    Подобно белкам, содержащимся в молоке, яйцах и мясе, белки морепродуктов обладают высокой биологической ценностью, поскольку они содержат все аминокислоты, необходимые для питания человека (Таблица I).

    Таблица I. Средние уровни незаменимых аминокислот (%) в белках различного происхождения (морепродукты, молоко, говядина и яйца).

    Essencial a минокислота

    Морепродукты

    Молоко

    Говядина

    Яйцо

    Лизин (%)

    8,8

    8,1

    9,3

    6,8

    Триптофан (%)

    1,0

    1,6

    1,1

    1,9

    Гистидин (%)

    2,0

    2,6

    3,8

    2,2

    Фенилаланин (%)

    3,9

    5,3

    4,5

    5,4

    Лейцин (%)

    8,4

    10,2

    8,2

    8,4

    Изолейцин (%)

    6,0

    7,2

    5,2

    7,1

    Треонин (%)

    4,6

    4,4

    4,2

    5,5

    Метионин-цистеин (%)

    4,0

    4,3

    2,9

    3,3

    Валин (%)

    6,0

    7,6

    5,0

    8,1

    Если вы хотите узнать больше, см .:

    Белиц, Х.-D .; Groseh, W., 1985. Química de los alimentos. Редакция Acribia. S.A., Сарагоса. 813п.

    Ferreira, F.G., 1983. Nutrição Humana. Fundação Calouste Gulbenkian, Лиссабон. 1291 с.

    Аминокислоты | Введение в химию

    Учебная цель
    • Опишите структуру аминокислоты и особенности, которые придают ее специфическим свойствам

    Ключевые моменты
      • Каждая аминокислота содержит центральный атом C, аминогруппу (Nh3), карбоксильную группу (COOH) и определенную группу R.
      • Группа R определяет характеристики (размер, полярность и pH) для каждого типа аминокислоты.
      • Пептидные связи образуются между карбоксильной группой одной аминокислоты и аминогруппой другой путем дегидратационного синтеза.
      • Цепочка аминокислот представляет собой полипептид.

    Условия
    • полипептид Любой полимер (одинаковых или разных) аминокислот, соединенных пептидными связями.
    • Группа R Группа R представляет собой боковую цепь, специфичную для каждой аминокислоты, которая придает определенные химические свойства этой аминокислоте.
    • аминокислоты Любая из 20 встречающихся в природе α-аминокислот (имеющих амино- и карбоксильные группы на одном атоме углерода) и множество боковых цепей, которые объединяются через пептидные связи с образованием белков.

    Структура аминокислоты

    Аминокислоты — это мономеры, из которых состоят белки. Каждая аминокислота имеет одинаковую фундаментальную структуру, которая состоит из центрального атома углерода, также известного как альфа (α) углерод, связанного с аминогруппой (NH 2 ), карбоксильной группой (COOH) и водородом. атом.В водной среде клетки как аминогруппа, так и карбоксильная группа ионизируются в физиологических условиях, и поэтому имеют структуры -NH 3 + и -COO соответственно. Каждая аминокислота также имеет другой атом или группу атомов, связанных с центральным атомом, известную как группа R. Эта группа R или боковая цепь придает каждой аминокислоте специфические характеристики белков, включая размер, полярность и pH.

    Аминокислотная структура Аминокислоты имеют центральный асимметричный углерод, к которому присоединены аминогруппа, карбоксильная группа, атом водорода и боковая цепь (R-группа).Эта аминокислота неионизирована, но если ее поместить в воду с pH 7, ее аминогруппа получит еще один водород и положительный заряд, а гидроксил в своей карбоксильной группе потеряет водород и получит отрицательный заряд.

    Типы аминокислот

    Название «аминокислота» происходит от аминогруппы и карбоксикислотной группы в их основной структуре. В белках присутствует 21 аминокислота, каждая из которых имеет определенную группу R или боковую цепь. Десять из них считаются незаменимыми аминокислотами для человека, потому что человеческий организм не может их производить, и они должны быть получены с пищей.Все организмы имеют разные незаменимые аминокислоты в зависимости от их физиологии.

    Типы аминокислот В белках обычно встречается 21 обычная аминокислота, каждая из которых имеет свою R-группу (вариантную группу), которая определяет ее химическую природу. 21-я аминокислота, не показанная здесь, представляет собой селеноцистеин с группой R -CH 2 -SeH.

    Характеристики аминокислот

    Какие категории аминокислот вы ожидаете найти на поверхности растворимого белка, а какие — внутри? Какое распределение аминокислот вы ожидаете найти в белке, встроенном в липидный бислой?

    Химический состав боковой цепи определяет характеристики аминокислоты.Аминокислоты, такие как валин, метионин и аланин, неполярны (гидрофобны), тогда как аминокислоты, такие как серин, треонин и цистеин, полярны (гидрофильны). Боковые цепи лизина и аргинина заряжены положительно, поэтому эти аминокислоты также известны как основные (с высоким pH) аминокислоты. Пролин является исключением из стандартной структуры анимокислоты, поскольку его группа R связана с аминогруппой, образуя кольцеобразную структуру.

    Аминокислоты обозначаются одной заглавной буквой или трехбуквенным сокращением.Например, валин обозначается буквой V или трехбуквенным символом val.

    Пептидные облигации

    Последовательность и количество аминокислот в конечном итоге определяют форму, размер и функцию белка. Каждая аминокислота связана с другой аминокислотой ковалентной связью, известной как пептидная связь. Когда две аминокислоты ковалентно связаны пептидной связью, карбоксильная группа одной аминокислоты и аминогруппа входящей аминокислоты объединяются и высвобождают молекулу воды.Любая реакция, которая объединяет два мономера в реакцию, которая генерирует H 2 O в качестве одного из продуктов, известна как реакция дегидратации, поэтому образование пептидной связи является примером реакции дегидратации.

    Образование пептидной связи Образование пептидной связи — это реакция синтеза дегидратации. Карбоксильная группа одной аминокислоты связана с аминогруппой входящей аминокислоты. При этом выделяется молекула воды.

    Полипептидные цепи

    Образовавшаяся цепочка аминокислот называется полипептидной цепью.Каждый полипептид имеет свободную аминогруппу на одном конце. Этот конец называется N-концом или амино-концом, а другой конец имеет свободную карбоксильную группу, также известную как C или карбоксильный конец. При считывании или сообщении аминокислотной последовательности белка или полипептида принято использовать направление от N к C. То есть предполагается, что первая аминокислота в последовательности находится на N-конце, а последняя аминокислота — на C-конце.

    Хотя термины полипептид и белок иногда используются как взаимозаменяемые, полипептид технически представляет собой любой полимер аминокислот, тогда как термин белок используется для полипептида или полипептидов, которые свернуты должным образом, в сочетании с любыми дополнительными компонентами, необходимыми для правильного функционирования, и являются теперь работоспособен.

    Показать источники

    Boundless проверяет и курирует высококачественный контент с открытой лицензией из Интернета.


    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

    *
    *