Вход в личный кабинет | Регистрация
Избранное (0) Список сравнения (0)
Ваши покупки:
0 товаров на 0 Р
Итого: 0 Р Купить

Уколы для работы головного мозга: Препараты для улучшения работы мозга

Содержание

Неврологические заболевания у взрослых – Dr.Domodedoff Медицинский центр в Домодедово

«Все болезни от нервов». В этой шуточной половице есть большая доля правды, поскольку большинство заболеваний связано с нервной системой.

13.03.2017


С момента рождения и до глубокой старости наш организм накапливает повреждающие факторы от неправильного образа жизни, стрессов, воздействий внешней среды. Нервная система реагирует на это, пытаясь компенсировать отрицательное воздействие. Но возможности нашего организма не бесконечны, и с годами организм не молодеет. Таким образом, чем человек становится старше, тем больше вероятность возникновения неврологических расстройств.

Патологические состояния нервной системы можно разделить на три группы:

  1. группа заболеваний с поражением центральной нервной системы

  2. группа заболеваний с поражением периферической нервной системы

  3. группа заболеваний, вовлекающая как центральную, так и периферическую нервную систему.

Безусловно, есть заболевания и симптомы, с которыми пациенты чаще, чем с другими, обращаются к неврологу. О них и пойдет речь.

Одна из самых грозных категорий патологических состояний нервной системы, это та, которая связана с сосудами головного мозга. Острое нарушение мозгового кровообращения (инсульт), как правило, приводит к необратимым нарушениям функций мозга и инвалидности. Инсульт классифицируют на ишемический (самый частый) и геморрагический. Причинами ишемического инсульта является закупорка сосудов, вследствие сдавления или тромбоза. Геморрагический инсульт — это кровоизлияние в головной мозг, вследствие расслоения аневризмы или разрыва сосуда. Инсульт требует немедленной госпитализации. Похожие симптомы может вызывать Транзиторная ишемическая атака (ТИА) — преходящее нарушение мозгового кровообращения по ишемическому типу. При такой картине (на фоне лечения), симптоматика прекращается в течение суток.

Факторы риска, приводящие к сосудистой мозговой катастрофе это: артериальная гипертензия, ишемическая болезнь сердца, нарушения ритма сердца, сахарный диабет, ожирение, повышенный уровень холестерина, нарушения свертываемости крови, заболевания сосудов, курение, алкоголь и другие.

Симптомы, возникающие при инсульте: асимметрия лица, нарушение речи, слабость и утрата силы в конечностях на одной стороне, нарушения зрения, нарушение чувствительности(онемение) лица и конечностей, нарушения координации(неустойчивость), головокружение, рвота, потеря сознания.

Чем раньше пациент с инсультом попадет в стационар и начнется лечение, тем больше шансов избежать летального исхода и свести к минимуму необратимые изменения функций нервной системы. Помимо острых нарушений кровообращения головного мозга, нередко встречается хроническое нарушение функций сосудов головного мозга, как правило, атеросклеротической этиологии, которое проявляетя нарушением памяти разной степени, изменением интеллекта, поведения, вегетативными симптомами, координаторными нарушениями и др.

Кроме инсультов существует немало серьезных заболеваний нервной системы, например таких, как эпилепсия. Эпилепсия – это хроническое заболевание центральной нервной системы, проявляющееся неконтролируемыми приступами нарушения или изменения сознания, судорожным(тоническим, клоническим) напряжением мышц или пароксизмальной утратой мышечного тонуса. Причинами возникновения приступов могут быть: повреждение головного мозга ребенка в момент родов, генетические заболевания, опухоли головного мозга, травматическое или метаболическое поражение ЦНС. Морфология эпилептических приступов разнообразна. Принято делить эпилептические приступы на генерализованные(распространяющиеся на весь головной мозг) и фокальные(ограниченные одним или несколькими участками мозга). В свою очередь к генерализованным относят:

  1. Генерализованный судорожный приступ, который проявляется внезапной потерей сознания, падением, сначала тоническим напряжением мышц тела и конечностей, затем клоническими судорожными сокращениями мышц, непроизвольным мочеиспусканием, прикусом языка, дальнейшей спутанностью сознания.

  2. Миоклонический приступ проявляется резким коротким сокращением определенных групп мышц.

  3. Абсанс. Это приступ, который проявляется кратковременным отключением сознания, но без падения и без судорожных сокращений. Пациент внезапно замирает, прекращает начатую деятельность, останавливается речь. После прекращения приступа речь и деятельность продолжаются.

К фокальным приступам относят:

  1. Фокальный эпилептический приступ с утратой или изменением уровня сознания. Как правило, при фокальном эпилептическом приступе возникает непроизвольное тоническое напряжение в одной конечности или группе мышц(непроизвольное движение конечности или поворот головы, глаз).

  2. Фокальный приступ без изменения сознания с судорожными проявлениями.

  3. Фокальный приступ без изменения сознания и без судорог, который проявляется изменениями чувствительности, галлюцинациями(вкусовыми, обонятельными, слуховыми, зрительными), вегетативными проявлениями, психическими расстройствами.

Каждый эпилептический приступ имеет отрицательное воздействие на нормальную работу головного мозга. Поэтому эпилепсию необходимо лечить. Современные противосудорожные лекарства обладают высокой эффективностью и минимальными побочными явлениями. Для диагностики эпилепсии проводят обследования: электроэнцефалография (ЭЭГ), видеоЭЭГмониторинг, магнито-резонансная томография.

Помимо заболеваний центральной нервной системы, часто к неврологу обращаются с симптомами поражения периферических нервов. 

Неврит— воспаление периферического нерва(инфекционной, травматической, токсической, сосудистой этиологии). Чаще всего пациенты обращаются с лицевым невритом, невритом тройничного нерва, невритом седалищного нерва, радикулопатией, межреберной невралгией и др. Симптоматика неврита: нарушение чувствительности, боль, двигательные нарушения (парез), трофические нарушения, вегетатитвные проявления. Для лечения невритов применяют нестероидные противовоспалительные лекарства, витамины группы В, физиотерапевтические методы лечения, массаж, иглоукалывание. В сложных случаях для лечения назначают гормональные препараты.

Самой частой причиной обращения к неврологу является головная боль.

Причин, вызывающих головную боль, много. Мигрень проявляется приступами головной боли с одной стороны, заканчивающейся рвотой, приносящей облегчение. Перед приступом мигрени может возникать аура – зрительные феномены (нарушения зрения, мерцание, молнии), неприятные ощущения (светобоязнь, звукобоязнь, повышенная чувствительность запахов). Потом наступает приступ сильной головной боли, которая не позволяет нормально работать или отдыхать. Анальгетики не помогают при такой картине. Необходим прием специальных лекарств.

Кроме мигрени бывает головная боль напряжения, которая возникает по причине постоянного напряжения мышц скальпа черепа. Сосудистая головная боль возникает на фоне спазма сосудов головного мозга, повышения артериального давления. При опухоли головного мозга возникает головная боль, вызванная сдавлением сосудов или ликвородинамическими нарушениями. А также другие виды головной боли.

Кроме перечисленных заболеваний существует еще много патологических состояний, таких как травмы ЦНС, врожденные патологии, прогрессирующие демиелинизирующие заболевания, миопатии, полинейропатии, расстройства сна, нарушения памяти и многие другие.

В медицинском центре Dr.Domodedoff ведет прием опытный невролог, эпилептолог, который проведет грамотный осмотр, назначит обследования и проведет эффективное лечение.

Возврат к списку

Церебролизин при сосудистой деменции | Cochrane

Актуальность

Сосудистая деменция является распространенной формой деменции, вызванной плохим кровотоком в головном мозге. В настоящее время не существует доказанных и лицензированных методов лечения сосудистой деменции. Церебролизин — это лекарство, изготовленное из головного мозга свиней и применяемое в виде инъекции. В некоторых странах Церебролизин используют в качестве лечения при сосудистой деменции. В предыдущем обзоре от 2013 года были рассмотрены все исследования Церебролизина и сосудистой деменции. Окончательный вывод о том, является ли Церебролизин полезным, сделать не удалось.

Цель этого обзора

Мы хотели узнать, может ли Церебролизин помочь людям, страдающим сосудистой деменцией. Нас особенно интересовало влияние лекарства на память и мышление, повседневную деятельность, побочные эффекты и качество жизни людей с сосудистой деменцией и людей, оказывающих помощь/уход. Прошло некоторое время с момента выхода последнего обзора Церебролизина, и мы хотели обновить обзор, проведя поиск новых исследований.

Что мы сделали

Мы провели поиск исследований, в которых описывали эффект Церебролизина у людей, страдающих сосудистой деменцией. Мы провели поиск в базах данных научных исследований, включая ресурсы из стран, где широко используется Церебролизин. Для включения в наш обзор в исследованиях должны были в случайном порядке определить людей в группу лечения Церебролизином и группу сравнения. Мы объединили результаты включенных исследований для оценки эффекта Церебролизина. Мы также оценили качество проведения исследований и надежности их результатов. Доказательства актуальны по состоянию на май 2019 года.

Что мы нашли

Мы обнаружили шесть исследований с участием 597 человек, страдающих сосудистой деменцией. Метод лечения Церебролизином, дозы и длительность лечения различались в разных исследованиях. Исследования показали, что Церебролизин оказывает положительное влияние на память, мышление и повседневную деятельность. О риске побочных эффектов при лечении не сообщали. Ни в одном из исследований не было описано качество жизни людей, страдающих сосудистой деменцией, и лиц, осуществляющих уход за ними.

Несмотря на то, что в исследованиях предположили пользу от лечения Церебролизином, результаты не являются определенными и окончательными. Во включенных исследованиях был ряд проблем, которые могли привести к вводящим в заблуждение результатам. Даже если польза, о которой сообщали в исследованиях, реальна, эффект был скромным и, возможно, не является значимым для людей, страдающих деменцией. Необходимы крупные, хорошо проведенные исследования, чтобы лучше понять, является ли Церебролизин полезным средством лечения для людей, страдающих сосудистой деменцией.

Зачем нужна электроэнцефалография головного мозга?

 

Головной мозг состоит из огромного количества нейронов, которые бесконечно генерируют импульсы. Определенные участки должны работать слаженно и согласованно для выполнения определенных действий и задач организма. Вычислить силу, амплитуду и функциональное состояние мозгового вещества можно с помощью электроэнцефалографии (ЭЭГ). Данная процедура абсолютно безболезненна и не требует специальной подготовки.

Особенности исследования

ЭЭГ помогает регистрировать активность мозга с помощью металлических электродов. С их помощью улавливается колебания мозга, фиксируется и отображается на мониторе. Результат также можно переносить на бумагу для дальнейшего изучения. Полученное изображение в виде волн является графическим дублированием работы мозга в реальном времени. Пациент, находясь в специальной комнате, получает необходимую стимуляцию с помощью звука, света или седативных препаратов. Вся процедура занимает от 30 минут до 2 часов и проводится только в светлое время суток.

Зачем надо делать ЭЭГ?

Показания к проведению электроэнцефалография головного мозга могут быть разными. Процедура назначается только лечащим врачом для подтверждения точного диагноза. Полученные снимки позволяют увидеть особенности работы конкретных участков мозга после травм или хирургических вмешательств. К показаниям для ЭЭГ также относят:

  • воспалительные процессы и заболевания нервной системы;
  • приступы, судороги, панические атаки;
  • черепно-мозговые травмы;
  • эндокринные заболевания;
  • расстройство сна, головокружения, головные боли;
  • последствия хирургических вмешательств;
  • опухоли, объемные образования;
  • патологии сосудов, вегетососудистая дистония.

ЭЭГ часто назначают новорожденным после родовых травм, а также детям при нарушениях развития и поведения. Процедура позволяет быстро и качественно держать на контроле особенности протекания болезни или осложнения. С ее помощью корректируют лекарственную или физиотерапевтическую терапию для конкретного пациента. Большим плюсом является возможность проводить электроэнцефалографию в любом состоянии пациента, когда он бодрствует или спит.

Как правильно подготовиться к процедуре?

Пациенту не советуют принимать лекарственные препараты за несколько часов до процедуры. За 12 часов до этого нельзя употреблять энергетики или продукты с кофеином (кофе, чай, шоколад, сладкие газированные напитки). Заранее нужно подготовить кожу головы, вымыть волосы, но не наносить спреи, кондиционеры, лаки и масла. Косметические средства могут ослабить контакты электродов, не получив на выходе нужной картины. Пациент должен быть спокойным и расслабленным. Если врач замечает повышенную активность мозга, то ЭЭГ могут переносить на позднее время, когда человек утомиться и захочет спать.

Процедура может применяться кому угодно. В исключение попадают пациенты с обширными травмами, послеоперационными швами или острыми инфекционными процессами. ЭЭГ не противопоказанно для беременных женщин или детей, так как не несет никакого вреда организму.

Особенности исследования

Для более точного результата, врачи могут назначать исследование ЭЭГ с депривацией сна. Для этого пациента просят не спать в течение 24 часов для выявления патологий в головном мозге. При записи могут применяться дополнительные нагрузки в виде световой стимуляции или дальнейшего лишения сна. 

Для выявления проблем, связанных с неврологией, применяют ЭЭГ видеомониторинг. Это длительное исследование, которое фиксирует синхронную запись видео и записи активности мозга при различных нагрузках. Пациента могут заставлять двигаться или вызывать у него различные эмоции или поведенческие особенности. Часто применяется для выявления эпилепсии или лунатизма. Данная методика используется при слуховых галлюцинациях, панических атаках, частых обморочных состояниях.

ЭЭГ – это безболезненная процедура, которая не несет вред для организма. Это быстрый способ выявить или понять особенности работы головного мозга. Проводится лишь после назначения лечащего врача и не имеет побочных последствий.

Метод ТЛНС в клинике реабилитации «В новый день» в Санкт-Петербурге

Применение неинвазивных стимуляционных методик воздействия на головной мозг при судорожных состояниях вызывает много споров среди врачей. Действительно, есть методики, использование которых противопоказано при судорожных состояниях, и это прямо указано в рекомендациях по их применению. Речь идёт о транскраниальной магнитной стимуляции (ТМС), микрополяризации. Эти методики объединяет стимулирующее влияние на кору головного мозга, а как известно, эпилепсия возникает, когда в головном мозге есть очаг патологической активности, поэтому дополнительное возбуждающее действие может спровоцировать возникновение приступа.

Однако если разобраться более детально, то, во-первых, не любое судорожное состояние это эпилепсия. Часто бывает, что судороги возникают только на высокую температуру (фебрильные судороги у детей), алкоголь или другие ситуационные воздействия, вне которых человек здоров, патологической активности головного мозга не регистрируется. Однажды выставленный диагноз судорожного состояния может долгое время являться противопоказанием ко многим процедурам, например, к прививкам, физиотерапии и т.д., даже если в этом давно нет никакой необходимости.

Во-вторых, если речь идёт именно об эпилепсии, то при этом назначается противосудорожная терапия, которая угнетает головной мозг (иначе эти препараты не смогли бы предотвращать приступы). Назначение противоэпилептических препаратов в детском возрасте в большинстве случаев приводит к задержке развития. Если не помочь такому ребёнку, то он может не догнать свой возраст и будет умственно отсталым. У взрослых с эпилепсией приём противосудорожных препаратов также угнетает головной мозг, что ограничивает их активную жизнедеятельность.

В третьих, есть пациенты, резистентные к противосудорожным препаратам. Им невозможно подобрать эффективную терапию, даже если назначаются высокие дозировки и сложные комбинации. В некоторых случаях их оперируют, результаты, как правило, хорошие. Но операция не всем может помочь, нужно пробовать и другие методы.

В четвёртых, есть заболевания, которые изначально связаны с нарушением работы головного мозга и одновременно могут сопровождаться судорожными состояниями, например, ДЦП, последствия черепно-мозговой травмы и др. Таким пациентам обязательно нужна реабилитация, иначе они могут остаться глубокими инвалидами, но реабилитация требует активной работы мозга и может спровоцировать приступы эпилепсии. Замкнутый круг.

Для всех этих пациентов необходима методика, которую можно использовать в реабилитации без риска спровоцировать приступ. Кроме безопасности, необходимо, чтобы эта методика была достаточно эффективной, способствовала нормализации активности головного мозга, развитию его функций, восстановлению и компенсации повреждений вследствие болезни или воздействия противосудорожных лекарств.

Методика транслингвальной нейростимуляции НЕ ВОЗБУЖДАЕТ КОРУ ГОЛОВНОГО МОЗГА. ТЛНС действует на уровне стволовых структур, и влияние на кору опосредованное за счет регуляции её активности. Можно сказать, что ТЛНС НЕ СТИМУЛИРУЕТ, А МОДУЛИРУЕТ И РЕГУЛИРУЕТ активность коры головного мозга. Это значит, что у детей не усугубляется отставание в развитии, быстрее и эффективнее происходит овладение новыми навыками, такими как сидение, ходьба, самообслуживание, речь, чтение и проч. В реабилитации применение ТЛНС способствует более быстрому восстановлению и возврату к активной деятельности: к работе, учёбе, домашним делам. Применение ТЛНС не ограничивает приём противосудорожных препаратов, однако необходимость в них после проведения курсов лечения может уменьшиться. Снижение дозировок противосудорожных препаратов, даже незначительное, уменьшает их угнетающее влияние на головной мозг и другие побочные эффекты.

В нашей клинике было несколько пациентов с разными судорожными состояниями: это были дети и взрослые. Некоторые получали противосудорожное лечение, кому-то оно было отменено ранее в связи с ремиссией заболевания. Ни у одного из пациентов мы не наблюдали какого-либо ухудшения течения эпилепсии, судорожные состояния (если они на тот момент были) могли становиться реже, но не учащались и не утяжелялись. Ни разу ТЛНС не спровоцировала судороги ни во время процедуры, ни после. Опыт применения ТЛНС при эпилепсии и других судорожных состояниях есть не только в нашей клинике. В различных реабилитационных учреждениях Санкт-Петербурга и Москвы накоплен опыт по примерно 300 детям и взрослым, имеющим в анамнезе судорожные состояния или диагноз эпилепсия. Методика ТЛНС применялась у них при реабилитации различных неврологических заболеваний (ДЦП, последствия травм и проч.). На данный момент ни в одном из случаев не отмечалось учащение приступов или другие ухудшения течения эпилепсии.

В мире также проявляют интерес к возможности применения стимуляционных методик при эпилепсии. В США, к примеру, стимуляция тройничного нерва используется для предотвращения приступов при резистентных формах эпилепсий. Этот метод считается эффективным и безопасным, даже в сравнении с медикаментозной терапией.

Несомненно, применение ТЛНС при эпилепсии требует дальнейшего изучения и взвешенного подхода. В нашей клинике мы перед началом лечения привлекаем к консультации эпилептологов. Если раньше они занимали непримиримую позицию, то сейчас всё чаще смягчают своё мнение в пользу возможности применения ТЛНС у пациентов с судорогами. Некоторым пациентам мы не применяем ТЛНС, но не потому, что у них эпилепсия, а ввиду общего тяжёлого состояния.

Малотравматичное лечение аневризм сосудов головного мозга – по ВМП

В Ростовской областной клинической больнице приступили к планомерному проведению малотравматичного лечения аневризм церебральных артерий в рамках оказания высокотехнологичной медицинской помощи (ВМП). Рентгенэндоваскулярная эмболизация аневризмы сосудов головного мозга была освоена в РОКБ еще 10 лет назад, но проводилась редко, так как не включена в обязательное медицинское страхование и до этого года не входила в программу оказания ВМП на Дону.

Аневризма – это значительное расширение артерии головного мозга, в результате которого сдавливаются окружающие ее структуры. Среди провоцирующих заболевание причин, кроме стандартной наследственности: атеросклероз и гипертония, травма головы, инфекция и многое другое. Поражает где-то 5% населения планеты, чаще всего, между 30 и 50 годами. Проявляется, только достаточно развившись, как правило, зрительными и слуховыми нарушениями, головными болями, проблемами с координацией движений и пр. Консервативно аневризма не лечится, а, прогрессируя, угрожает разрывом стенок, геморрагическим инсультом. Смертность при таком варианте развития событий составляет порядка 30 процентов, а выжившие пациенты часто имеют впоследствии тяжелые неврологические нарушения, и крайне высок риск повторного разрыва аневризмы.

В течение многих лет стандартной нейрохирургической практикой оперативного лечения аневризм является клипирование шейки аневризмы. Это сложнейшее вмешательство, которое требует вскрытия черепной коробки, манипуляций на открытом мозге, но, как отмечает главный нейрохирург Ростовской области, заведующий Нейрохирургическим отделением Ростовской областной клинической больницы Владимир Ефанов, в большинстве случаев оно даже предпочтительнее малотравматичного лечения.

– Важнейшее преимущество эндоваскулярного метода – это возможность лечения аневризм, чья локализация или размеры серьезно затрудняют, а то и просто исключают прямое вмешательство, – поясняет Владимир Ефанов. – Он также показан для больных в остром периоде кровоизлияния, тех, кто не способен перенести открытую операцию. Именно таким пациентам и были успешно проведены первые семь процедур в нашей больнице. И, как и всегда при малотравматичном вмешательстве, все пациенты быстро восстановились и уже выписаны из отделения.

Во время процедуры эмболизации аневризмы задача у рентгенохирургов та же, что и у нейрохирургов – что называется, выключить опасный участок из кровотока, но не снаружи, а изнутри сосуда. Для этого в ходе процедуры через прокол на бедренной артерии, по сосудам больного, врачи проводят, а затем укладывают в полость аневризмы, часто имеющей форму мешочка, платиновые спирали. Так создаются необходимые условия для последующегго тромбирования опасного участка, кровоток больше не оказывает критического давления, риск разрыва исчезает. Однако встречаются аневризмы, в которых смещение витков спиралей в просвет сосуда неизбежно, и для закрепления конструкции приходится дополнительно устанавливать специальный стент.

– Сейчас мы выполнили еще более сложную процедуру, – рассказывает главный рентгенохирург Ростовской области, заведующий Отделением рентгенохирургических методов диагностики и лечения № 2 Сосудистого центра Ростовской областной клинической больницы Михаил Малеванный. – Мы впервые на Дону установили поток перенаправляющие стенты, которые позволяют снижать давление в аневризме, направляя основной поток крови по несущему сосуду. Тромбирование аневризмы после установки такого стента в среднем наступает в период от 4 до 6 месяцев после операции. Эта методика наиболее эффективна для лечения аневризм крупных и гигантских размеров.

Всего в 2019 году в Ростовской областной клинической больнице, благодаря финансированию из областного бюджета, будет проведено в рамках оказания высокотехнологичной медицинской помощи 17 процедур рентгенэндоваскулярного лечения аневризмы сосудов головного мозга.

Повреждение спинного мозга

Проблема

Термин «повреждение спинного мозга» означает поражение спинного мозга в результате травмы (например, в случае автомобильной аварии) либо болезни или дегенерации (например, рак). В настоящее время нет надежной оценки распространенности этого явления в мире, однако коэффициент заболеваемости на глобальном уровне составляет, по оценкам, 40-80 случаев на миллион жителей в год. До 90% этих случаев обусловлены травмами, хотя доля атравматических повреждений спинного мозга, судя по всему, постоянно растет.

Симптомы повреждения спинного мозга зависят от серьезности этого повреждения и его местоположения на спинном мозге. Симптомы могут включать частичную или полную утрату сенсорной функции или двигательной функции верхних конечностей, нижних конечностей и/или тела. Наиболее серьезные повреждения спинного мозга поражают системы, которые регулируют работу желудочно-кишечного тракта или мочевого пузыря, дыхание, сердечный ритм и кровяное давление. Большинство людей, страдающих повреждениями спинного мозга, испытывают хроническую боль.

Демографические тенденции

Наибольшей опасности подвергаются мужчины на раннем этапе зрелости (20-29 лет) и в преклонном возрасте (старше 70 лет). Женщины подвергаются наибольшему риску в подростковом (15-19 лет) и преклонном возрасте (старше 60 лет). По данным исследований, соотношение коэффициентов подверженности мужчин и женщин составляет в зрелом возрасте, как минимум, 2:1, а иногда и гораздо выше.

Смертность

Самый высокий риск смертности отмечается в течение первого года после повреждения и остается высоким по сравнению с населением в целом. Вероятность того, что люди с повреждением спинного мозга могут умереть раньше, в 2-5 раз выше.

Риск смертности повышается с повышением уровня и тяжести повреждения и в значительной мере обусловлен наличием своевременной и качественной медицинской помощи. Важное значение имеют также такие факторы, как метод транспортировки в больницу после повреждения и время, прошедше6е до поступления в больницу.

Вторичные условия, которые можно предотвратить (например, инфекции в результате необработанных пролежневых язв), более не считаются ведущими причинами смерти людей с повреждением спинного мозга в странах с высоким уровнем доходов, однако эти условия все же остаются основными причинами смерти людей, получивших повреждение спинного мозга, в странах с низким уровнем доходов.

Медико-санитарные, экономические и социальные последствия

Повреждение спинного мозга ассоциируется с возникновением риска развития вторичных условий, которые могут привести к общему ухудшению здоровья и даже к угрозе жизни, например к тромбозу глубоких вен, инфекции мочевыводящих путей, мышечным спазмам, остеопорозу, пролежням, хронической боли и осложнениям дыхательных путей. Для профилактики и лечения этих состояний требуется неотложная помощь, система услуг по реабилитации и постоянное обеспечение медицинской помощи.

Повреждение спинного мозга может привести к тому, что данное лицо будет нуждаться в посторонней помощи. Зачастую для облегчения мобильности, общения, ухода за собой или для домашней работы нужна ортопедическая и реабилитационная техника. По оценкам, 20-30% людей с повреждением спинного мозга обнаруживают клинически значимые симптомы депрессии, которая в свою очередь оказывает негативное воздействие на улучшение функций жизнедеятельности и здоровья в целом.

Неправильное восприятие, негативное отношение и физические барьеры, сдерживающие основные функции мобильности, приводят к тому, что многие люди лишены возможности принимать всестороннее участие в жизни общества. Дети с повреждением спинного мозга имеют скорее всего меньше шансов, чем их сверстники, начать учебу в школе, а после зачисления — меньше шансов успешно учиться. Взрослые с повреждением спинного мозга сталкиваются с аналогичными барьерами, которые препятствуют им участвовать в экономической жизни, что подтверждается их уровнем безработицы на глобальном уровне, который составляет более 60%.

Существующие данные не позволяют оценить затраты, связанные с повреждением спинного мозга на глобальном уровне, однако они дают возможность нарисовать общую картину:

  • уровень и тяжесть травмы оказывает существенное воздействие на эти затраты — чем выше расположена травма на спинном мозге (например, тетраплегия по сравнению с параплегией), тем выше затраты;
  • прямые затраты наиболее высоки в первый год сразу же после повреждения спинного мозга и затем существенно снижаются с течением времени;
  • косвенные затраты, в особенности потеря источников дохода, зачастую превышают прямые затраты;
  • большая часть этих затрат ложится на плечи самих людей, которые получили повреждение спинного мозга;
  • затраты, связанные с повреждением спинного мозга, выше затрат, связанных с сопоставимыми состояниями, такими как деменция, множественный склероз и церебральный паралич.

Профилактика

Ведущими причинами повреждения спинного мозга являются автомобильные аварии, падения и акты насилия (включая попытки самоубийства). Существенная доля травматических повреждений спинного мозга обусловлена травмами, связанными с работой или спортом. Для предотвращения некоторых из основных причин повреждения спинного мозга в настоящее время существуют эффективные меры, включая улучшение состояния дорог, транспортных средств и поведения людей на дорогах, что позволяет избежать автомобильных аварий, оснащение окон защитными элементами, препятствующими выпадению, и меры на директивном уровне, имеющие целью предотвратить злоупотребление алкоголем и ограничить доступ к огнестрельному оружию в целях сокращения числа случаев насилия.

Улучшение медицинской помощи и решение проблем

Многие из последствий, связанных с повреждением спинного мозга, обусловлены не самим состоянием человека, а неадекватным уровнем медицинской помощи и реабилитационных услуг, а также барьеров, существующих в физической окружающей среде, социальной сфере и на уровне политики.

Осуществление Конвенции ООН о правах инвалидов (КПИ) предполагает необходимость соответствующих действий в целях устранения этих пробелов и решения проблем.

Основные меры по повышению уровня выживания, здоровья и участия в жизни общества людей с повреждением спинного мозга включают следующие:

  • Своевременное и надлежащее обследование до поступления в больницу: оперативное распознавание травмы с подозрением на повреждение спинного мозга, быстрая оценка и принятие мер по оказанию первой помощи пострадавшему, включая иммобилизацию позвоночника.
  • Неотложная помощь (включая хирургическое вмешательство), соответствующая типу и тяжести повреждения, степени нестабильности и наличию сдавления нервов и в соответствии с пожеланиями пациента и его семьи.
  • Доступ к имеющимся средствам медицинской помощи, информационным материалам и изделиям медицинского назначения (например катетерам) в целях снижения риска вторичных состояний и повышения качества жизни.
  • Доступ к квалифицированным услугам в области реабилитации и психического здоровья с целью обеспечения максимального восстановления функций, самостоятельности, общего благосостояния и включения в жизнь общества. Исключительно важное значение имеет поддержание функции мочевого пузыря и желудочно-кишечного тракта.
  • Доступ к надлежащим вспомогательным устройствам, которые могут дать людям возможность осуществлять повседневную деятельность, осуществить которую в ином случае они были бы неспособны, что позволит снизить уровень функциональных ограничений и зависимости. В странах с низким и средним уровнем доходов только 5-15% лиц имеют доступ к вспомогательным устройствам, в которых они нуждаются.
  • Специализированные знания и навыки среди медицинских работников и реабилитационных служб.

Необходимые меры по обеспечению права на образование и участие в экономической жизни включают законодательство, политику и программы, которые оказывают содействие в следующих областях:

  • создание физически доступных домов, школ, рабочих мест, больниц и транспорта;
  • создание системы образования для всех;
  • устранение случаев дискриминации на работе и в сфере образования;
  • восстановление профессиональных навыков в целях оптимизации шансов на трудоустройство;
  • микрофинансирование и иные формы льгот, способствующих самостоятельной занятости, в порядке оказания поддержки альтернативным формам материальной самодостаточности;
  • обеспечение доступа к системе выплат социальных пособий, которые не действуют в качестве меры, снижающей заинтересованность в возобновлении работы;
  • правильное понимание проблемы повреждения спинного мозга и позитивное отношение к людям, которые живут в этом состоянии.

Деятельность ВОЗ

ВОЗ проводит работу по всему спектру мер, начиная с первичной профилактики травматических и атравматических причин повреждения спинного мозга, улучшения травматологической помощи, укрепления медико-санитарных и реабилитационных услуг и оказания поддержки по включению людей с повреждениями спинного мозга в жизнь общества. ВОЗ выполняет следующие задачи:

  • работает на межведомственной основе в партнерстве с национальными субъектами деятельности в самых разных секторах (например здравоохранение, правоприменение, транспорт, образование) в целях улучшения профилактики случаев повреждения спинного мозга, в том числе в результате дорожно-транспортных происшествий, падений, актов насилия и дефектов нервных трубок;
  • ориентирует и поддерживает государства-члены в работе по повышению осведомленности в вопросах инвалидности и содействует включению проблемы инвалидности в качестве одного из компонентов национальной политики и программ в области здравоохранения;
  • содействует сбору и распространению информации и данных, связанных с инвалидностью;
  • разрабатывает нормативные средства, включая руководства и примеры надлежащей практики в целях укрепления первичной профилактики (автомобильные аварии, падения и акты насилия), травматологической помощи, медико-санитарной помощи, реабилитации и поддержки, а также иной помощи;
  • создает соответствующий потенциал среди директивных органов здравоохранения и поставщиков услуг;
  • содействует расширению масштабов работы по реабилитации на местном уровне; и
  • пропагандирует стратегии, имеющие целью добиться того, чтобы инвалиды были хорошо осведомлены о состоянии своего здоровья и чтобы медико-санитарный персонал поддерживал и охранял права и достоинство инвалидов.

 

Инъекции ботокса могут достичь головного мозга

Ботулотоксин, используемый в ботоксе и других аналогичных препаратах, может достичь головного мозга, перемещаясь по аксонам нервных клеток. Таковы выводы итальянских ученых, проводивших эксперименты с лабораторными крысами.

Специалисты Института Неврологии в Пизе вводили токсин ботулизма в мышцы, управляющие движениями усов животных. Спустя три дня после инъекций в клетках ствола головного мозга крыс были обнаружены фрагменты белков, разлагающихся под действием токсина. Впрочем, достигшие мозга концентрации ядовитого вещества были ничтожно малы, и вызванные им повреждения нервных клеток никак не отразились на поведении грызунов.

В следующей серии экспериментов ботулотоксин напрямую вводили в мозг животных. При вскрытии следы токсина были выявлены не только в области инъекций, но и в других, весьма отдаленных отделах мозга.

По словам исследователей, способность ботулотоксина проникать в головной мозг через периферические нервы вызывает определенное беспокойство, однако вероятность связанных с этим явлением осложнений у пациентов чрезвычайно мала. В настоящее время американское Управление по продуктам и лекарствам проводит дополнительную оценку безопасности ботулотоксина в связи с участившимися сообщениями о побочных эффектах.

Впрочем, беспрепятственно преодолевающий гематоэнцефалический барьер токсин может со временем найти новое применение в медицине. Например, его свойства можно использовать при разработке новых путей доставки лекарств в ткани головного мозга. Главной же задачей итальянских специалистов была оценка эффективности ботулотоксина в лечении тяжелых форм эпилепсии.

Ботулинический токсин, вырабатываемый возбудителем ботулизма бактерией Clostridium botulinum, один из сильнейших ядов, встречающихся в природе. В медицине это вещество используется более 20 лет. Сейчас препараты с ботулотоксином применяются не только для разглаживания морщин, но и для предотвращения спазмов и непроизвольных сокращений различных групп мышц.


Ссылка на публикацию: MedPortal

Инъекции плазмы бегунов могут увеличить продолжительность жизни мозга

В будущем, , мы сможем извлекать плазму у бегунов и тех, кто посещает спортзалы по всему миру, и вводить ее другим, чтобы передать пользу для мозга упражнений. Новое исследование на мышах показывает, что такие пересадки плазмы от молодых и желтых могут помочь людям с деменцией.

Что нового — В исследовании, опубликованном в среду в Nature , ученые вводили плазму, полученную от грызунов, которые занимались спортом, мышам, которые находились в режиме ожидания.Активные мыши передали многие когнитивные и клеточные преимущества физической активности.

Эффект можно воспроизвести на людях. Ученые в Норвегии уже планируют пилотное исследование, в ходе которого пожилые люди с ранними признаками болезни Альцгеймера будут получать еженедельные инъекции плазмы от здоровых молодых людей, которые занимаются спортом.

«Население с когнитивными нарушениями растет с каждым годом», — говорит соавтор исследования Зурин де Мигель Inverse . «Трудно найти лечение или лекарства, влияющие на мозг.Если мы сможем понять, как плазма влияет на мозг, мы сможем использовать естественный путь».

Это исследование основано на растущих доказательствах того, что регулярные физические упражнения уменьшают воспаление мозга, снижают уровень гормонов стресса и коррелируют с улучшением памяти и когнитивных способностей. Упражнения могут даже замедлить легкое снижение когнитивных функций у пожилых людей. Частично это преимущество связано с воздействием физических упражнений на плазму, которая регулирует содержание воды в организме и массу эритроцитов для уменьшения воспаления.

Как они это сделали — Де Мигель и ее команда из Стэнфордского университета сначала разделили мышей из одного помета на две группы, одна из которых бегала на колесе для хомяка, а другая не имела «доступа к колесу».Затем они взяли «плазму бегунов» у тренирующихся мышей и ввели ее внутривенно некоторым сидячим мышам.

«Эти результаты очень похожи на прямые эффекты бега».

Бегуновая плазма спровоцировала ряд реакций здоровых клеток в мозге не тренирующихся мышей-реципиентов, некоторые из них были связаны с уменьшением воспаления.

Исследователи обнаружили, что кластерин, белок, участвующий в удалении клеточного мусора и замещении клеток, передавался от мыши к мыши с помощью инъекции плазмы.Оказавшись у холостых мышей, недавно приобретенный кластерин связался со специфическими клетками мозга и уменьшил экспрессию генов, связанных с воспалением. Перенос также уменьшил экспрессию генов, связанных с мышиным эквивалентом болезни Альцгеймера.

Плазму лабораторных мышей, имевших доступ к колесу для упражнений, пересаживали мышам, у которых его не было. George Steinmetz/Getty Images News/Getty Images

Мыши с инъекциями также показали лучшие результаты в тестах на их когнитивные способности по сравнению с мышами-лежаками без инъекций.

«Примечательно, что эти результаты очень похожи на прямые эффекты бега», — говорится в исследовании.

Исследователи также индуцировали воспалительную реакцию в мозге некоторых ленивых мышей, чтобы посмотреть, может ли это ослабить эффекты инъекции плазмы, но плазма-бегун по-прежнему обращала вспять экспрессию генов, приводящих к воспалению у этих мышей.

Авторы исследования заключают:

«Мы показываем, что изменений в плазме в результате физических аэробных упражнений достаточно, чтобы резюмировать положительное влияние упражнений на нейрогенез и память, а также уменьшить воспаление гиппокампа у нетренированных мышей и мышей с экспериментально индуцированное нейровоспаление.

Почему это важно — Легко представить себе сценарий Black Mirror , в котором низший класс проводит каждый день прикованным к умным велосипедам, чтобы они могли быть источником ценной, улучшающей работу мозга плазмы, которая доступна в прилавок сока рядом с вами. В качестве альтернативы у спортсменов может возникнуть соблазн продать свою плазму тому, кто предложит самую высокую цену.

Эти сценарии фантастичны. Ученые больше всего заинтересованы в разработке новых методов лечения стареющего населения и растущего числа людей с возрастными когнитивными нарушениями.

Более 55 миллионов человек во всем мире страдают той или иной формой деменции, и ежегодно регистрируется около 10 миллионов новых случаев. Болезнь разрушительна для людей, у которых она есть, их семьи и их друзей. Пострадавший может потерять свою личность, память и двигательные навыки. Часто они требуют дорогостоящего ухода для поддержания низкого качества жизни. Прогнозируется, что финансовое, эмоциональное и трудовое бремя деменции значительно возрастет с продолжающимся старением значительного поколения бэби-бумеров, численность которого в США составляет около 70 миллионов человек.С. в одиночку.

Что дальше — В настоящее время исследователи Норвежского университета науки и технологии набирают людей в возрасте от 50 до 75 лет с диагнозом легкого когнитивного нарушения или ранней стадии болезни Альцгеймера для получения ежемесячных инъекций «плазмы тренировки» — ExPlas , как называют его норвежские исследователи, — от здоровых взрослых в возрасте от 18 до 40 лет.

Это не означает, что скоро в Whole Foods появятся бутылки с плазмой вашего инструктора по аэробике.Это пилотное исследование — небольшое предварительное исследование, проведенное для демонстрации риска, осуществимости и стоимости более крупного исследования, которое позволит более убедительно изучить гипотезу. Пилотное исследование должно продолжаться до 2025 года.

Донорство плазмы может когда-нибудь стать ключом к борьбе со снижением когнитивных функций Group4 Studio/E+/Getty Images

возможно, что этот протокол можно будет использовать для лечения других видов когнитивных нарушений, помимо старения мозга, — говорит де Мигель.Одним из потенциальных применений, по ее словам, может быть использование плазмы для устранения когнитивных проблем, вызванных, например, черепно-мозговой травмой.

Пределы теоретической терапии до сих пор остаются загадкой, добавляет она.

«Раньше мы думали, что мозг изолирован от тела, но мы обнаруживаем, что он более связан, чем когда-либо прежде [мысль]», — говорит она.

Abstract: Физические упражнения, как правило, полезны для всех аспектов здоровья человека и животных, замедляя когнитивное старение и нейродегенерацию1.Когнитивные преимущества физических упражнений связаны с повышенной пластичностью и уменьшением воспаления в гиппокампе, но мало что известно о факторах и механизмах, которые опосредуют эти эффекты. Здесь мы показываем, что «плазма бегунов», собранная у добровольно бегающих мышей и введенная мышам, ведущим малоподвижный образ жизни, снижает исходную экспрессию нейровоспалительных генов и экспериментально индуцированное воспаление мозга. Протеомный анализ плазмы выявил согласованное увеличение ингибиторов каскада комплемента, включая кластерин (CLU).Внутривенно введенный CLU связывается с эндотелиальными клетками головного мозга и снижает экспрессию нейровоспалительных генов в мышиной модели острого воспаления головного мозга и мышиной модели болезни Альцгеймера. У пациентов с когнитивными нарушениями, которые занимались структурированными упражнениями в течение 6 месяцев, уровень CLU в плазме был выше. Эти результаты демонстрируют существование переносимых противовоспалительных факторов упражнений, нацеленных на сосуды головного мозга и благотворно влияющих на мозг, и присутствующих у людей, которые занимаются физическими упражнениями.

Зачем принимать таблетки, если вместо них можно сделать инъекцию мозга?

Всем известно, что таблетки — самый распространенный способ приема лекарств: у нас есть таблетки практически от всего. Но компания под названием MRI Interventions, Inc. может изменить это.

Существует ряд причин, по которым пероральное введение фармацевтических препаратов является хорошей идеей. Во-первых, это легко. Вы просто говорите пациенту проглотить таблетку. Кроме того, таблетки не очень дороги в производстве, их легко упаковывать и распространять.Самое главное, они работают. По крайней мере, большую часть времени. В то время как пероральные лекарства эффективны при лечении ряда заболеваний в различных частях тела, они не доказали свою эффективность при решении проблем, связанных с мозгом.

Причиной является гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), образованный слоем клеток, который удерживает молекулы крови от попадания в мозг. Это помогает избежать многих вещей, которые не должны находиться в мозгу, но также затрудняет разработку лекарств, которые правильно попадают в мозг.ГЭБ чрезвычайно избирательна и очень хороша в том, что она делает, а это означает, что многие лекарства не проходят мимо нее. И если они это сделают, они могут повлиять на весь мозг, а не только на область, в которой наблюдается патология.

Чтобы обойти эту проблему, MRI Interventions, Inc. разработала систему ClearPoint, которая позволяет нейрохирургам доставлять контролируемые дозы лекарств в очень определенные области мозга с помощью управляемого компьютером катетера и устройства, называемого траекторией SmartFrame. направляющую, которая позволяет хирургу точно видеть, где в головной мозг вводится катетер.Весь процесс происходит в аппарате МРТ, а направляющая траектории заполнена жидкостью, которая отображается на МРТ, а это означает, что хирург может точно видеть, где находится устройство, как оно ориентировано и куда направлено.

Программное обеспечение ClearPoint помогает нейрохирургу, отслеживая точное положение направляющей траектории в пространстве, чтобы убедиться, что катетер находится точно в нужной точке мозга. И это невероятно точно.Президент MRI Interventions, Inc. заявляет, что система может доставлять лекарство в указанную точку размером с кунжутное семя в любом месте мозга живого субъекта. Это значительно точнее, чем любая другая подобная система, которая тестировалась в прошлом.

Конечно, необходимы дальнейшие испытания, прежде чем система такого рода может получить широкое распространение. Как и при любой операции на головном мозге, даже самой незначительной, существует ряд потенциальных побочных эффектов.Любое кровотечение в головном мозге может быть опасным для жизни, и необходимо соблюдать крайнюю осторожность, чтобы убедиться в отсутствии инфекционных агентов. На веб-сайте MRI Interventions мало обсуждается риск, хотя в соответствующей статье сообщается, что руководитель отдела стереотаксической и радиохирургии Калифорнийского университета в Сан-Диего говорит, что точечная доставка сводит риск к минимуму. Мы будем с нетерпением ждать более известных результатов.

Что вы думаете? Является ли это следующей волной лечения заболеваний головного мозга? Или она будет быстро превзойдена следующей многообещающей технологией? Хотели бы вы попробовать?

Список литературы

Хок, Л.(25 февраля 2014 г.) Более безопасная доставка лекарств в мозг. Журнал Д.

Изображение предоставлено Spectral-Design/Shutterstock.

Новые инструменты для поведенческой генетики у колюшек

Образец цитирования: Джеймс Н., Белл А. (2021) Минимально инвазивные инъекции в мозг для трансгенеза, опосредованного вирусами: новые инструменты для поведенческой генетики у колюшек. ПЛОС ОДИН 16(5): е0251653. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0251653

Редактор: Себастьян Д.Фугманн, Университет Чан Гунг, ТАЙВАНЬ

Получено: 2 февраля 2021 г .; Принято: 30 апреля 2021 г .; Опубликовано: 17 мая 2021 г.

Авторское право: © 2021 James, Bell. Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все сценарии и данные общедоступны в Open Science Framework (https://osf.io/v56zt) как «Скрипты нейрохирургического протокола.R» для нейрохирургической оптимизации, «Поведение фармацевтического лечения AVP.R» и как «Сценарии поведенческих экспериментов для выпуска.R» для трансгенеза, опосредованного вирусом. Полный список деталей хирургической установки вместе с инструкциями по сборке находится в открытом доступе через Open Science Framework (https://osf.io/sgpvm).

Финансирование: Эта работа была поддержана грантом NSF Edge Grant # 1645170, присужденным доктору Дэниелу Болнику и со-PI Alison Bell, Michael White, Craig Miller и Kathryn Milligan-Myhre.Общая поддержка животных была предоставлена ​​NSF (IOS 1121980), NIH (R01 GM082937) и UIUC. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Сложное поведение неоднократно демонстрировалось (обзор в Dochtermann et al., [1]), однако установление причинно-следственной связи между генами и социальным поведением остается сложной задачей.Частично эта трудность возникает из-за ограничений преимущественно корреляционных методов изучения взаимодействия между генами и поведением (обзор в Charney [2]), а частично из-за малых размеров эффекта [3, 4]. В то время как картирование локуса количественных признаков (QTL), полногеномные исследования сцепления/ассоциации (GWAS) и современные технологии секвенирования, такие как исследования RNA-Seq, выявили тысячи генов-кандидатов, важных для естественного поведения, по-прежнему сложно охарактеризовать механизмы и лежащие в основе нейронные схемы. .Чтобы полностью охарактеризовать вклад гена в поведение, необходимо учитывать не только различия в последовательности, но также регуляторные и эпигенетические влияния. Следовательно, чтобы продемонстрировать и полностью охарактеризовать причинно-следственную связь между геном и поведением, крайне важно иметь метод манипулирования экспрессией гена в определенное время и в определенном месте [5].

Существует растущий набор инструментов для потенциального манипулирования функцией генов в нетрадиционных модельных организмах, и важно выбрать правильные инструменты, поскольку каждый метод имеет свои собственные предположения, а также необходимые возможности в рамках системы [6].Здесь мы сосредоточимся на разработке минимально инвазивного нейрохирургического метода прямой инъекции головного мозга для опосредованного вирусом трансгенеза у трехиглой колюшки ( Gasterosteus aculeatus ), основного организма в этологии (обзор в Huntingford & Ruiz-Gomez [7]). Эта процедура может доставлять либо фармакологические агенты для тестирования сигнальных путей, либо трансгенные элементы для прямого изменения экспрессии генов в мозг колюшки. Используя прямую инъекцию в мозг, мы исследовали влияние генов-кандидатов на территориальную агрессию с помощью фармакологических манипуляций и трансгенеза, опосредованного вирусами.

Основной альтернативой трансгенезу, опосредованному вирусами, является полный трансгенез зародышевой линии, обычно осуществляемый путем микроинъекции ДНК непосредственно в ядро ​​оплодотворенной яйцеклетки. Трансгенез, опосредованный вирусами, привлекателен по сравнению с изучением поведения, потому что манипуляции именно в мозгу взрослых животных позволяют избежать нецелевых, связанных с развитием и компенсаторных эффектов. Кроме того, опосредованная вирусами доставка конструкций непосредственно в мозг следует временной шкале, которая более благоприятна для поведенческих исследований у долгоживущих животных.Этот подход уже оказался важным при функциональном тестировании генов, связанных с поведением [5, 8, 9], а также при анализе нейронных цепей [10].

Вирус-опосредованный трансгенез можно использовать для увеличения или уменьшения уровней экспрессии генов, используя либо прямую полезную нагрузку генов, либо кассету CRISPR соответственно [11, 12]. Выбор промотора, включенного в вирусную полезную нагрузку, позволяет исследователям адаптировать профили экспрессии и продолжительность к их экспериментальным потребностям. Например, в экспериментальной работе для этого исследования изучали краткосрочный промотор mCMV, который продуцировал экспрессию уже через 4 дня после инъекции, а также долговременный промотор hCMV, экспрессия которого продолжалась не менее 5 недель.Точно так же различные вирусные векторы обеспечивают выбор временной эписомальной экспрессии или, с помощью ретровирусных векторов, постоянной интеграции в геном хозяина. Этот метод трансгенеза является быстрым и гибким и подходит для экспериментальных планов, в которых одни и те же отдельные животные измеряются до и после изменения экспрессии генов, что позволяет нам показать причинно-следственную связь. Используя повторяющиеся измерения внутри субъекта, каждое животное выступает в качестве своего собственного контроля, который статистически контролирует вариации между людьми.Это большое преимущество при работе с высокой межиндивидуальной изменчивостью, например, при изучении поведения или беспородных животных, собранных из естественных популяций.

Трехиглая колюшка уже является одним из наиболее хорошо изученных животных с точки зрения поведения и имеет растущий молекулярный набор инструментов, включая полностью секвенированный геном [13]. Таким образом, колюшки в настоящее время набирают популярность в других областях, включая эволюцию, физиологию, сравнительную геномику и неврологию [14–16]. Они использовались в сравнительных кросс-таксоновых исследованиях, направленных на сохранение молекулярных основ социального поведения как в новых, так и в классических модельных системах [17, 18], а также в эволюции поведения [7, 14, 19, 20]. ].Действительно, уже есть сотни ранее идентифицированных генов-кандидатов социального поведения, ожидающих описания [21-27]. У колюшек хорошо зарекомендовали себя поведенческие тесты [28, 29], которые можно автоматизировать [15, 30].

Недостаточно информации о хирургической методологии у мелких (3–4 см) рыб, несмотря на их популярность в качестве систем моделирования поведения, включая рыбок данио ( Danio rerio ) [31], медаку ( Oryzias latipes ) [32] и колюшки [7].Обезболивание остается одним из самых сложных аспектов хирургии, потому что правильное время анестезии должно определяться индивидуально. При модификации процедуры трансгенеза, опосредованного вирусом рыбок данио [33], нам сначала нужно было усовершенствовать процесс анестезии [34, 35], чтобы обеспечить более длительную и точную операцию. Важно отметить, что мы внедряем использование оральной канюли, обеспечивающей оксигенацию и поддерживающую анестезию на протяжении более длительной (10 минут без воды) процедуры. Вода, подаваемая через канюлю, проходит через жабры и имеет побочный эффект, сохраняя во влажном состоянии зажимные губки и поверхность тела животного.Чтобы повысить точность инъекций в мозг, мы разработали и изготовили специальное хирургическое оборудование, поскольку в продаже нет совместимых с водой крошечных столов для стереотаксиса. Чтобы максимизировать благополучие животных, нам дополнительно необходимо было выявить четкие предупредительные признаки неспособности восстановить силы, установив нормальную картину восстановления у колюшки, аналогичную работе Harms et al. с кои [36]. Благодаря этому оборудованию и возможности раннего вмешательства показатели выживаемости выросли до 90%.

Чтобы облегчить будущую поведенческую работу с этой стереотаксической операцией на головном мозге для колюшки, мы протестировали методы минимизации послеоперационного периода простоя, такие как дополнительная оксигенация, и подтвердили быстрое восстановление поведения с помощью имитации территориального вторжения сразу после физиологического восстановления.В качестве первого теста этого метода на этом виде мы решили сосредоточиться на территориальной агрессии по трем причинам: 1) это хорошо зарекомендовавший себя, легко поддающийся оценке поведенческий тест [15, 28, 37–39], 2) агрессия важны для приспособленности [40, 41] и 3) есть хорошие гены-кандидаты на агрессию, основанные на исследованиях на других позвоночных [18, 42, 43].

Здесь мы используем этот нейрохирургический метод для проверки функции двух законсервированных генов-кандидатов, связанных с агрессией у колюшки: аргинин-вазопрессина и моноаминоксидазы.Используя опосредованный вирусом трансгенез с помощью прямых инъекций в мозг, мы проверили, обнаруживаются ли изменения уровня поведения из-за избыточной экспрессии по всему мозгу либо AVP , либо MAOA у выловленных в природе самцов колюшки. Чтобы повысить доступность вирусно-опосредованного трансгенеза у колюшек, системы, уходящей корнями в этологию, а не в генетику, мы демонстрируем использование метода для поведенческой генетики с использованием широко доступных плазмид млекопитающих, а не путем синтеза или клонирования последовательностей генов колюшки.Чтобы подтвердить эффективность фармацевтических манипуляций с помощью инъекций в мозг, мы сравнили внутримозговое и системное введение вазотоцина.

Аргинин-вазопрессин ( AVP ) и его немлекопитающий гомолог аргинин-вазотоцин ( AVT ) являются высококонсервативными [44] и плейотропными [45] олигопептидами. Вазопрессин (CYFQNCPRG) и вазотоцин (CYIQNCPRG) отличаются только одной аминокислотной заменой между млекопитающими (человеком) и костистыми (колюшками), а их соответствующие рецепторы V 1a имеют сходную специфичность, сигнальные механизмы и аминокислотные последовательности [46]. ].Было обнаружено, что и вазопрессин, и вазотоцин обладают сходными физиологическими эффектами у крыс [47]. Кроме того, было показано, что передача сигналов вазотоцином влияет на агрессию в различных контекстах как у рыб, так и у млекопитающих (обзор в Goodson [48]) и была охарактеризована во всей сети принятия социальных решений (SBDN) в головном мозге [49–52]. Фактически, нонапептидные гормоны (вазопрессин/вазотоцин, изотоцин/мезотоцин и окситоцин) взаимодействуют с половыми стероидами, влияя на поведение [46, 53], что делает их типичными поведенческими генами-кандидатами.

Пик вазотоцина у колюшки приходится на начало сезона размножения как у самцов, так и у самок [54]. Гнездящиеся самцы колюшки имеют повышение уровня вазотоцина в мозгу после зеркального (агрессивного) воздействия [55]. Ген arginine-vasopressin-like ( avpl ) показал наибольшую избыточную экспрессию у доминантных рыбок данио по сравнению с подчиненными [56], что дополнительно подтверждает его роль в агрессивном поведении костистых рыб. Вазотоцин у взрослых костистых рыб в основном расположен в преоптической области (ПОА) гипоталамуса [49, 57, 58], где он является активным регулятором гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой (ГГН) оси [59].Поэтому мы предположили, что дополнительная экспрессия аргинин-вазопрессина ( AVP ) в сети принятия социальных решений в мозгу колюшки будет усиливать агрессию.

Экзогенное введение вазотоцина использовалось у многих костистых и других позвоночных для изменения поведения, как посредством внутричерепной, так и системной инъекции [46], и имело реакцию, основанную на дозировке [60–62]. Кроме того, учитывая его роль в качестве антидиуретического гормона [63], вазотоцин вызывает быструю физиологическую реакцию учащения дыхания, что делает его физиологические эффекты быстрыми и неинвазивными для мониторинга.Вазотоцин может проходить через гематоэнцефалический барьер [64, 65]. Таким образом, если травма головного мозга в результате внутричерепной инъекции не сделала этот метод непригодным, мы ожидали, что вазотоцин будет давать аналогичные эффекты при внутричерепном или внутрибрюшинном (IP) введении.

Моноаминоксидаза, другой наш ген-кандидат, имеет давнюю связь с психопатологиями, особенно с агрессией и тревогой [66], не только в модельных системах, но и у людей [67]. Моноаминоксидаза представляет собой фермент, который расщепляет и тем самым инактивирует несколько биогенных аминов, включая нейротрансмиттеры серотонин, норадреналин и дофамин [68].Широко признано, что эти нейротрансмиттеры играют решающую роль в регуляции познания, настроения, стресса и мотивации [69]. Было высказано предположение, что уровни серотонина и дофамина следуют «перевернутой U» связи с когнитивными функциями, так что как слишком низкая, так и слишком большая активность отрицательно влияют на производительность [70, 71].

Кости имеют только один ген моноаминоксидазы ( MAO ), в отличие от двух, обнаруженных у млекопитающих ( MAOA и MAOB ). Колюшка MAO (ENSGACT00000012444.1) и мышиный MAOA (NP_776101.3) имеют 68% консервативность на уровне белка. Несмотря на низкий уровень консервативности, ген моноаминоксидазы костистых костистых костей функционально сравним [68, 72].

В большинстве предыдущих исследований связи между моноаминоксидазой и агрессией изучалось подавление или нокаут MAOA и соразмерное увеличение активности серотонина. Мыши с низкой или отсутствующей активностью MAOA демонстрировали повышенную пугливость в молодости и повышенную агрессию у взрослых самцов, а также повышенный риск антисоциального поведения [66, 68].У костистых рыб, как и у мышей и людей, более высокие уровни серотонина в синапсах связаны со снижением агрессии [73]. У рыбок данио агрессивные взаимодействия приводят к повышению серотонинергической активности как у победителей, так и у проигравших [73]. Введение соответствующего сигнального вещества рыбкам данио приводило к снижению уровня белка МАО и повышению агрессии [74].

Однако есть также предварительные данные о том, что активация МАО также может усиливать агрессию. Многие гены серотонинового и дофаминового путей, в том числе MAO , активируются у доминирующих рыб [73], при этом сверхэкспрессия MAO наблюдается, в частности, в гипоталамусе [56].У людей и мышей активация MAOA связана с повышенной тревожностью [75, 76]. В брачный период самцы в одиночку охраняют свои гнездовые территории [38]; повышенная тревожность может легко вызвать повышенную бдительность и раздражительность. Поэтому ожидалось, что повышенная экспрессия MAOA усилит агрессию за счет обмена серотонина.

Материалы и методы

Обзор

В ходе десятиминутной нейрохирургической процедуры суспензию инородного материала (физиологического раствора, вирусной конструкции или фармакологического агента) вводили в переднюю часть промежуточного мозга головного мозга посредством транскраниальной инъекции.Для части эксперимента, опосредованной вирусным трансгенезом, двусторонние инъекции доставляли в общей сложности 600 нл репликационно-дефицитного вируса простого герпеса 1 (HSV-1), содержащего генетические полезные нагрузки либо флуоресцентного контроля EYFP , либо клонов ORF кДНК млекопитающих . АВП или МАОА .

Для облегчения сравнения с предыдущими исследованиями эксперимент также включал фармакологическую обработку экзогенным вазотоцином, соединением Мэннинга (антагонист рецептора V 1 и антивазопрессор) или физиологическим раствором.Вазотоцин и физиологический раствор вводили как по тому же транскраниальному протоколу, так и путем внутрибрюшинной инъекции, как ранее было установлено для колюшек. Соединение Мэннинга доставлялось только путем внутрибрюшинной инъекции.

В поведенческом тесте изучалась территориальная агрессия путем регистрации реакции подопытной особи на незваного гостя, помещенного в стеклянную колбу, — хорошо зарекомендовавший себя метод [28, 29] у колюшек. Исходные анализы проводились не менее чем за 24 часа до любых манипуляций.Анализы экспериментального состояния проводились в соответствующие моменты времени в зависимости от метода вмешательства: через 30 минут после внутрибрюшинных инъекций, через 2 часа после фармакологической инъекции в мозг или через 14 и 16 дней после вирусопосредованных инъекций. Частоту дыхания также регистрировали непосредственно перед каждым поведенческим испытанием.

Наконец, многочисленные пилотные эксперименты усовершенствовали протоколы, использовавшиеся до настоящего поведенческого эксперимента. В них, среди прочего, изучались выбор промотора для управления экспрессией гена при трансгенезе, опосредованном вирусом, место и глубина транскраниальной инъекции и их качественное соотношение с площадью трансфицированных клеток, использование трепанации черепа в отличие от прямого прокалывания черепа с помощью инъекционная игла, влияние калибра иглы на показатели выживаемости и восстановления, время восстановления частоты дыхания до нормы после транскраниальной инъекции и влияние дополнительной оксигенации во время хирургического восстановления на выживаемость.

Животные

Весной-летом с 2016 по 2018 год в Пута-Крик, Калифорния, было собрано

взрослых пресноводных рыб. Дополнительные рыбы F1 от кроссов, созданных в 2015 и 2016 годах и выращенных в лаборатории, также использовались для оптимизации нейрохирургической процедуры. Все рыбы содержались в лаборатории в групповых аквариумах объемом 83 л (107 x 33 x 24 см) с циркулирующей пресной водой (5 ppm Instant Ocean Sea Salt). Температура в комнате поддерживалась при 18°C ​​в фотопериод 16:8 (Д:Д) «размножение» с апреля по октябрь, а в остальных случаях – «не размножение» фотопериод 8:16 (Д:Д).На момент операции рыбе было от одного до двух лет. Самцов идентифицировали по брачному окрасу (вторичные половые признаки) и по определению пола с помощью ПЦР [77]. Отдельных самцов взвешивали и измеряли (стандартная длина от носа до хвостового стебля), общая средняя длина составила 47,5 мм ± 2,66 (среднее значение ± стандартное отклонение) и вес 1,40 г ± 0,25 (среднее значение ± стандартное отклонение). Затем их переселили в индивидуальные емкости объемом 9,5 л (32x21x19 см), выстланные гравием и содержащие синтетическое растение. Каждой особи давали возможность акклиматизироваться в течение трех дней до любых поведенческих измерений.Все рыбы подверглись только одной инъекции или операции и не использовались повторно.

Заявление об этике

Все работы с животными проводились в соответствии с протоколом Институционального комитета по уходу и использованию животных (IACUC № 15077 и 18080) и протоколом Институционального комитета по биобезопасности (IBC-4140) Университета Иллинойса в Урбана-Шампейн. Во время всех смоделированных территориальных вторжений житель и злоумышленник были разделены, чтобы предотвратить любые травмы. Групповое размещение использовалось для обеспечения нормальной, экологически значимой социальной среды до и после эксперимента.Весь отлов рыбы осуществлялся в соответствии с разрешением на научный сбор (SC-3310) от California Fish and Game в соответствии с самыми высокими стандартами (IACUC и законодательство США) обученными исследователями с предварительного одобрения. Сборы сведены к минимуму, чтобы не мешать местному населению. Члены лаборатории ежедневно проверяют рыбу на кормление и болезни. Кроме того, технические специалисты Университетского отдела исследований животных проводят ежедневные проверки помещений и воды.

Хирургическая установка

Для этой процедуры мы разработали специально изготовленную хирургическую установку (рис. 1).Чтобы обеспечить постоянную оксигенацию и анестезию рыбе, находящейся вне воды, был необходим канюльный насос с низким давлением и скоростью потока. Полный список деталей вместе с инструкциями по сборке находится в открытом доступе через Open Science Framework (https://osf.io/sgpvm).

Рис. 1. Хирургическая установка, изготовленная по индивидуальному заказу.

1. Трехиглая колюшка в подкладке. Зажим. 2. Альтернативный мягкий зажим для крупной рыбы. 3. Шприц Нейрос, 5 мкл. 4. Трехосный манипулятор. 5. Оральная канюля и направляющая трубка.6. Перистальтический канюльный насос, 100 мл/мин. 7. Резервуар источника насоса. 8. Поддон для капель.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0251653.g001

Анестезия

Перед анестезией определяли предоперационную исходную частоту дыхания путем подсчета оперкулярных сокращений за 20 секунд. Первоначальную анестезию проводили путем погружения в 0,02% забуференный MS-222 (Tricane-S, Western Chemical, Fisher) не более чем на пять минут (188,4 с ± 74,0, среднее значение ± стандартное отклонение), пока движение не прекратится и рыба не перестанет реагировать.У должным образом успокоенных рыб: 1) хвост не двигался, 2) замедленное, но регулярное дыхание (биение оперкулы), 3) останавливалась на дне емкости для замачивания и 4) не реагировала на прикосновение и не двигалась при извлечении из ванны. .

Время анестезии не коррелировало с какими-либо физиологическими показателями (рис. S1). Рыб ополаскивали в пресной воде (растворимая морская соль 5 частей на миллион) для удаления остаточного анестетика, а затем перемещали в хирургическую установку. В установке оральная канюля обеспечивала постоянный поток воды с 0.Поддерживающая анестезия 01% MS-222 над жабрами на время хирургической процедуры (233 с ± 79, среднее значение ± стандартное отклонение). Скорость подачи воды регулировали для каждой рыбы, чтобы обеспечить постоянный низкий расход через жабры.

Оптимизация нейрохирургии для прямых инъекций в мозг

Рыба была аккуратно зажата в хирургическом аппарате за глазами, удерживая череп на месте. Промежуточный мозг колюшки визуализируется через череп (рис. 2), что позволяет выбирать места инъекций с умеренно высокой точностью.В пилотных исследованиях мы нацеливались либо на конечный, либо на передний промежуточный мозг. Как ни странно, мы наблюдали лучшие показатели успеха при поражении большого промежуточного мозга, а не маленького и более окклюзированного конечного мозга. Следовательно, для работы с поведенческим геном-кандидатом все инъекции были нацелены на переднюю часть промежуточного мозга.

Рис. 2. Дорсальная визуализация головного мозга колюшки.

A и B) Пример визуализации мозга колюшки через череп. Обведена более светлая область, соответствующая промежуточному мозгу.C) Мозг колюшки с обонятельными луковицами (передняя, ​​крайняя слева, окрашена в красный цвет), конечный мозг (слева, окрашен в синий цвет), промежуточный и средний мозг (в центре, естественный цвет), мозжечок (справа, окрашен в зеленый цвет) и ствол мозга ( сзади, крайний справа, окрашен в фиолетовый цвет). Узлы сети принятия социальных решений присутствуют в конечном мозге (миндалевидное тело, гиппокамп и т. д.) и промежуточном мозге (преоптическая область (POA), гипоталамус и периакведуктальный серый/центральный серый (PAG)), как описано в O’Connell and Hofmann [3]. 50].

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0251653.g002

При каждой инъекции игла 33G (0,210 мм OD) присоединена к боросиликатному шприцу на 5 мкл (Hamilton Neuros модель 75, #65460–02, Reno , NV) вводили транскраниально через самую тонкую часть черепа кзади от лобной кости [78], т. е. там, где мозг можно визуализировать (рис. 2). В пилотных исследованиях мы также изучили использование инсулинового шприца (BD 328431, Franklin Lakes, NJ) с иглой 30G (0,337 мм OD).У более тонкой иглы 33G упор был установлен на 2,5 мм. Каждая транскраниальная инъекция доставляла в общей сложности ~ 300 нл жидкости на одну-три глубины, чтобы смягчить трансфицированную область, причем одна глубина была наиболее ограничительной. Глубина инъекции варьировалась от максимум 2,5 мм ниже поверхности головы до 0,3 мм ниже поверхности черепа, с разницей в высоте ~ 0,7 мм для многократных инъекций глубины. Двусторонние транскраниальные инъекции доставили в общей сложности ~ 600 нл. Любое заметное скопление крови было связано с плохим исходом.

После процедуры рыб возвращали в их отдельные аквариумы и непрерывно контролировали до появления отчетливого дыхания (глазного движения), обычно в течение 30 секунд. В случае поверхностного дыхания принудительное движение пресной воды через жабры использовалось для содействия выживанию путем ручного «плавания» рыбы в подводной восьмерке, используя только движение вперед. Частоту дыхания и положение рыбы в толще воды регистрировали каждые 15 минут в течение двух часов после инъекции.Дополнительные проверки проводили для всех рыб через три часа и через один день после инъекции. Из 183 рыб, получивших инъекции в мозг, 19 не пережили этот первоначальный трехчасовой период восстановления; девять не пережили анестезию и десять были подвергнуты эвтаназии.

Изменения в процедуре прямой инъекции в мозг, характерные для эксперимента по трансгенезу, опосредованному вирусом

Чтобы соответствовать ограничениям уровня биобезопасности животных 2 (ABSL-2) на использование ВПГ-1, рыбу, используемую в протоколах трансгенеза, опосредованного вирусом, переносили в новый резервуар в операционной утром перед инъекцией.Чтобы максимизировать вероятность возникновения обнаруживаемых поведенческих изменений, мы стремились к широкой экспрессии в обоих полушариях промежуточного мозга (рис. 2C). Таким образом, каждая рыба получила две двусторонние транскраниальные инъекции в передний промежуточный мозг одной из вирусных конструкций, доставив в общей сложности ~ 600 нл конструкции на несколько глубин из боросиликатного шприца на 5 мкл с иглой 33G. Через двое суток рыб из операционной АБСЛ-2 пересадили в индивидуальные емкости.

Фармакологическое лечение

Экзогенный [Arg8]-вазотоцин (Genscript RP10061, Пискатауэй, Нью-Джерси) вводили либо непосредственно в промежуточный мозг головного мозга посредством инъекции с использованием нейрохирургического протокола, описанного выше, либо системно посредством внутрибрюшинной (IP) инъекции, что уже хорошо зарекомендовало себя у колюшек. , используя 30G (0.312 мм) инсулиновая игла. Поскольку сообщалось, что поведенческая реакция у костистых рыб различается в зависимости от дозы [60, 61], была протестирована кривая доза-реакция (0,5, 5 и 10 мкг на грамм массы тела). Соединение Мэннинга (Bachem H-5350.0001, VWR), мощный антагонист рецептора V1 (антивазопрессор), вводили системно посредством интраперитонеальной инъекции в дозе 3 мкг на грамм массы тела. Оба фармакологических агента были свежеразведены в день инъекции предварительно суспендированным концентрированным исходным раствором, так что все внутрибрюшинные инъекции доставляли 10 мкл на грамм массы тела.Поведенческие анализы проводили за 48 часов до фармакологической манипуляции для исходных измерений, а затем через 30 минут после внутрибрюшинной инъекции или через 2 часа после инъекции в мозг. Предварительные инъекции физиологического раствора показали, что 30 минут было достаточно как для физиологического, так и для поведенческого восстановления после внутрибрюшинной инъекции (полные данные: https://osf.io/v56zt).

Вирус-опосредованные конструкции для трансгенеза

Мы решили использовать Herpes Simplex 1 (HSV-1) в качестве вирусного вектора, так как уже было показано, что он эффективен при трансфекции костистых рыб, где аденоассоциированные вирусы (AAV) ранее не удавались [33].Модифицированный вирус имеет дефицит репликации, что означает, что он больше не несет генома HSV-1. Вместо этого он несет генетическую нагрузку ДНК, упакованную в виде плазмиды, с геном и промотором по нашему выбору. Эта генетическая конструкция доставляется в клетки животных посредством трансфекции вирионами, а затем экспрессируется эписомально, при этом уровни и продолжительность экспрессии определяются выбором промотора, используемого на плазмиде. Поскольку HSV-1 не является ретровирусным вектором, плазмида остается в цитоплазме и не интегрируется в геном и не реплицируется с ним.Таким образом, он преходящ, хотя в некоторых клетках может сохраняться в течение длительного периода времени [79]. Кроме того, ВПГ-1 обычно обладает низкой генотоксичностью и не поддается обнаружению выделения [80], что снижает опасения по поводу биологической опасности. Наконец, HSV-1 поддерживает полезные плазмиды большего размера, чем AAV или ретровирусные векторы, такие как лентивирус [8, 81].

Три промотора в репликационно-дефицитном HSV-1 были опробованы для управления экспрессией генов на основе работы с рыбками данио [33] — долгосрочный промотор (hCMV, N = 43, рис. 3), приводящий к флуоресцентному сигналу через 2–5 недель после инъекции, краткосрочный промотор (mCMV, N = 10) с экспрессией между 4 и 7 днями после инъекции и ретроградный промотор (hEF1a, N = 7), который не приводил к обнаруживаемому флуоресцентному сигналу.Промоторы тестировали на их способность управлять флуоресцентным белком (EGFP, EYFP, GCaMP6f или mCherry). Долгосрочный промотор (hCMV) был выбран как наиболее полезный из-за его более длительного окна действия и использовался в эксперименте по трансгенезу, опосредованному вирусами.

Рис. 3. Экспрессия флуоресценции в результате трансгенеза, опосредованного вирусом.

Более точное нацеливание на области мозга возможно за счет ограничения количества инъекций. А) Однократная инъекция, приводящая к местному выражению, ограниченному участком одного полушария переднего конечного мозга.Б) Широкая экспрессия на всем протяжении левого полушария промежуточного мозга, характерная для инъекций с доставкой на несколько глубин. Никакой флуоресценции не наблюдалось ни в одном контроле, которому вводили физиологический раствор. C и D) Успешная трансфекция клеток долговременной конструкцией hCMV-EYFP в латеральном левом промежуточном мозге, показанная на B, через три недели после инъекции. E-G) Профиль флуоресцентной экспрессии промотора hCMV с течением времени. В течение 10 дней после инъекции флуоресценции не наблюдалось. Слабый, но все более сильный сигнал наблюдался через 10–12 дней (не показано) после инъекций независимо от флуоресцентного белка, mCherry (E и G) или EYFP (F).Пиковая экспрессия наблюдалась примерно через 13 или 14 дней после инъекции. Не было качественной разницы в интенсивности флуоресценции между двумя и четырьмя неделями, максимальным исследуемым моментом времени, после инъекции. Поведение оценивали через 14 и 16 дней после инъекции.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0251653.g003

клонов ORF кДНК млекопитающих использовали для AVP (человек, HG17671-UT, NCBI Ref Seq: NM_000490.4, Sino Biological, Пекин, Китай) ) и MAOA (мышь, MG57436-U, NCBI Ref Seq: NM_173740.3, китайско-биологический). Они были клонированы в основу pDONR221 (Epoch Life Science, Миссури-Сити, Техас), а затем упакованы (Gene Delivery Technology Core, Массачусетская больница общего профиля, Бостон, Массачусетс) с основой IRES-GFP в репликационно-дефицитном HSV-1 (собственность Rachael Неве). Для контрольных инъекций использовали запас hCMV-EYFP (RN12). Все мужчины были случайным образом распределены по одной из трех конструкций. Конечные вирусные растворы использовали неразбавленными, за исключением добавления следовых количеств пигмента (бриллиантовый синий FCF или тартразин, т.е. FD&C Синий № 1 и Желтый № 5), ≤2% об./об. во время экспериментов, чтобы позволить визуализировать раствор по градациям шприца.

Поведенческие анализы

Все поведенческие данные были собраны двойным слепым методом в отношении лечения (физиологический раствор, фармакологический агент или трансфекция гена). Частоту дыхания определяли до территориальной провокации путем усреднения двух отдельных непрерывных подсчетов оперкулярных сокращений за 20 секунд, проведенных в течение 5-минутного периода. Это гарантировало минимизацию индивидуальных вариаций из-за стресса от исследовательской деятельности.Территориальную агрессию измеряли, регистрируя реакцию человека на злоумышленника, заключенного в стеклянную колбу (получено из Wootton, 1971 [39]). Фиксировалось время ориентации и первого укуса нападающего (TTO и TTB в наших файлах данных соответственно), а также общее количество укусов, атак (выпадов) и спотыканий (подходов) в течение пяти минут после начальная ориентация (поведение, определенное в Wootton, 1971 [39]). Злоумышленники ( N = 9) были на 5–10% меньше самцов своего вида.

Во время эксперимента по трансгенезу, опосредованному вирусом, частота дыхания и поведенческая реакция самцов на территориальную проблему регистрировались четыре раза (рис. 4): дважды до и дважды после инъекции, соответственно считались исходными и трансфицированными. Каждый фокальный самец, кроме одного, сталкивался с одним и тем же злоумышленником во время всех четырех территориальных испытаний. В виде исключения первоначально спаренный злоумышленник умер между вторым и третьим испытаниями и был заменен новым самцом такой же длины.

Рис. 4. Экспериментальная временная шкала с инъекцией конструкций в день 0.

Рыбам вводили случайно выбранную конструкцию либо гена, связанного с агрессией (AVP или MAOA), либо контрольного флуоресцентного белка (EYFP). Все испытания проводились двойным слепым методом в отношении трансфицированного гена. В каждом испытании было два измерения частоты дыхания, за которыми следовала территориальная проблема.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0251653.g004

Гистология

Рыбу забивали обезглавливанием острыми ножницами без анестезии.Обезглавливание использовали для скорейшего прекращения мозговой активности, а также потому, что кровь также собирали для дополнительного гормонального анализа (не показан), который чувствителен к анестезии. Мозги сразу вырезали. Мозг помещали в глицериновую среду на предметные стекла с помощью iSpacers с четырьмя лунками (SunJin Lab IS018, город Синьчжу, Тайвань). Визуализация была выполнена в тот же день, что и препарирование на Zeiss LSM 710 на основных объектах Института геномной биологии Карла Р. Вёзе. Никакой флуоресценции не наблюдалось ни в одном контроле, которому вводили физиологический раствор.

R Статистический анализ и доступность данных

Блочные диаграммы нарисованы с жирным штрихом по медиане и усиками до 1,5 IQR за пределами верхнего и нижнего квартилей. Весь анализ данных проводился в RStudio (v1.1.383) с R версии 3.5.1. Все сценарии и данные общедоступны в Open Science Framework (https://osf.io/v56zt) как «Скрипты нейрохирургического протокола.R» для нейрохирургической оптимизации, «Поведение при лечении AVP pharma.R» и как «Скрипты поведенческих экспериментов». для выпуска.R» для вирусоопосредованного трансгенеза. Каждая особь считалась экспериментальной единицей, и ни одно животное не исключалось из анализа.

Различия в показателях выживаемости для нейрохирургической оптимизации были рассчитаны с использованием функции хи-квадрат с поправкой на непрерывность. Непараметрически-совместимый дисперсионный анализ с повторными измерениями был выполнен с помощью пакета MANOVA.RM (v0.3.2) со статистикой типа дисперсионного анализа (ATS), поскольку допущение о сферичности не могло быть выполнено для частоты дыхания с течением времени (критерии Мочли для сферичности = 0.02, p-значение = 1,65e-74). Мы сообщаем статистику типа ANOVA (ATS) и скорректированные степени свободы, последние из которых основаны на количестве уровней лечения, количестве наблюдений и дисперсии рангов в каждом лечении [82]. Для эффектов взаимодействия мы сообщаем рекомендуемые вместо [83]. Апостериорный расчет по моменту времени был выполнен с помощью критерия суммы рангов Уилкоксона с коррекцией непрерывности и функцией rcompanion (v2.2.1) wilcoxonR. Затем значения P были скорректированы с учетом частоты ложных открытий (метод fdr).

Повторяемость представлена ​​как ICC3,1, рассчитанная с помощью Desctool (v0.99.25) и подтвержденная с помощью пакета непараметрического согласования nopaco (v1.0.6). Значимость была одинаковой между ICC и тестами на соответствие. Корреляции Спирмена были рассчитаны с использованием Hmisc (v4.1–1). Тесты Уилкоксона и Манна-Уитни были выполнены с помощью пакета базовой статистики, а величина эффекта была рассчитана с помощью пакета rcompanion (v2.2.1). Наконец, при расчете размера выборки использовался пакет WMWssp (0.3.7) со значением по умолчанию 0.05% для двусторонней частоты ошибок типа I и мощности 0,8.

Результаты

Оптимизация нейрохирургии для прямых инъекций в мозг

Прямая транскраниальная инъекция ультратонкой иглой без фаски оказалась проще и эффективнее других апробированных методик, включая трепанацию черепа. Обычно рыба возвращалась к нормальному плаванию и использованию водяного столба в течение 15 минут после снятия анестезии. Начальное пилотирование ( N = 62) показало, что частота дыхания соответствовала типичной картине после операции, которую мы назвали кривой восстановления (рис. 5).Частота дыхания достигла пика примерно через 30 минут после операции и вернулась к исходному уровню через два часа после нейрохирургической процедуры.

Рис. 5. Средняя кривая восстановления частоты дыхания после транскраниальных инъекций в головной мозг ( N = 62).

Частота дыхания (оперкулярных сокращений за 20 секунд) вернулась к исходному уровню через два часа после инъекции и оставалась стабильной после операции. Среднее ± SE * p ≤ 0,05; ** р ≤ 0,01; *** р ≤ 0,001.

https://дои.org/10.1371/journal.pone.0251653.g005

Через два часа после инъекции в мозг у контрольной группы, получавшей физиологический раствор, не было различий в территориальной агрессии ( N = 10) по сравнению с днем ​​до операции при любом агрессивном поведении (укусы: Z = -1,22, p-значение = 0,21, заряды: Z = -0,62, p-значение = 0,54, время до первого укуса: Z = -1,22, p-значение = 0,22, рис. 6). Полное брачное поведение происходило в течение трех дней у самцов, определяемых гнездовым поведением, и девяти дней у самок, определяемых наличием яиц.

Рис. 6. Агрессивное поведение контрольной рыбы за день до нейрохирургии и после прямой инъекции в мозг физиологического раствора ( N = 10).

Каждая линия представляет человека, демонстрирующего изменение поведения после инъекции физиологического раствора. Выбросы за пределами 1,5 IQR показаны как отдельные точки данных. Никаких существенных изменений в агрессии не наблюдалось ни в одном поведении.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0251653.g006

Диаметр иглы влиял на частоту выживаемости ( χ 3 2 6 (1, N 30G = 43, N 33G = 183) = 23.9, p-значение = 1,02e-6) с коэффициентом выживаемости 54% при использовании иглы большего размера 30G по сравнению с коэффициентом выживаемости 87% при использовании более тонкой иглы 33G. Кроме того, более тонкая игла 33G приводила к постоянно более низкой частоте дыхания ( ATS 1, 2613 = 6,54, p-значение = 0,01) в течение шестичасового окна после нейрохирургии, чем игла большего диаметра 30G. Дополнительная оксигенация в течение двух дней после операции не улучшала выживаемость ( х 2 (1, N Extra O2 = 94, N Нормальный = 0,89)02, p-значение = 0,89) ни восстановления ( ATS 1, 7465 = 0,94, p-значение = 0,33, S3 рис.).

Множественные транскраниальные инъекции не влияют на выживаемость или выздоровление

Для широкой экспрессии потребовалось несколько транскраниальных инъекций — по одной в каждое полушарие целевой области мозга. Двусторонние транскраниальные инъекции не изменили показатели выживаемости ( х 2 (1, N Одностороннее = 64, N Двустороннее = 119) = 046, p-значение = 0,50) по сравнению с односторонней инъекцией. В целом частота дыхания во время восстановления была выше у рыб с двусторонними инъекциями ( ATS 1, 4874 = 11,61, p-значение = 0,001) в течение трех часов после операции. Однако это сравнение было в значительной степени искажено годом отлова: рыба, пойманная в 2018 году, получила две транскраниальные инъекции и в целом показала плохое здоровье. При анализе только тех лет (2017 и 2019), когда проводились как односторонние, так и двусторонние инъекции, что позволяет провести прямое сравнение, нет никакой разницы в частоте дыхания во время восстановления между односторонними и двусторонними инъекциями ( ATS 1, 312 = 0.92, p-значение = 0,34). Это говорит о том, что различия в выздоровлении по годам перевешивают любой эффект, который могли бы иметь множественные инъекции.

Инъекционный материал не влияет на выживаемость или выздоровление

Рыба была сопоставима показатели выживаемости независимо от инъекционных материалов ( χ 3 2 3 (3, N 9 HSV-1 0 = 113, N 9 Pharma 0 = 22, N Солевой раствор = 48) = 2.30, p-значение = 0,32). После усовершенствования хирургической техники выживаемость процедуры составила примерно 90%. Из 113 рыб, которым инъецировали одну из трех конструкций, использующих дефицитный по репликации HSV-1 для трансфекции, 101 выжила. Рыбы, которым вводили фармацевтические препараты, вели себя так же: 20 из 22 рыб выжили. Контрольные рыбы, которым вводили физиологический раствор, чувствовали себя наименее хорошо, поскольку они использовались для первоначального тестирования и усовершенствования хирургической техники; они насчитали 39 выживших среди 48 рыб, что составляет 81% выживаемости.

Время восстановления у рыб, которым инъецировали дефицитный по репликации HSV-1, не отличалось от такового у контрольных рыб, которым инъецировали физиологический раствор ( ATS 3,7, ∞ = 1,83, p-значение = 0,12). Кроме того, выбор промотора (hCMV, mCMV или hEF1a) не повлиял на выживаемость ( х 2 (2) = 1,38, p-значение = 0,50), а также не было основного эффекта промоутер ( ATS 2, 143 = 0,33, p-значение = 0.70) на кривой восстановления. Наконец, экспрессируемый специфический ген не оказывал влияния ( х 2 (3) = 2,16, р = 0,54) на показатели выживаемости по сравнению с контролями, которым вводили физиологический раствор. На скорость восстановления также не влиял экспрессируемый ген ( ATS 2, 267 = 1,19, p-значение = 0,31).

Фармакологическое лечение вазотоцином

Экзогенная инъекция вазотоцина в мозг быстро увеличивала частоту дыхания по сравнению с контролем, которому вводили физиологический раствор ( ATS 1, 599 = 8.74, p-значение = 0,003, рис. 7). Этот эффект начинался в течение 15 минут и сохранялся более двух часов после инъекции. Наиболее выраженная разница в частоте дыхания была между 0,75-1,5 часа после инъекции. Внутрибрюшинная инъекция экзогенного вазотоцина также приводила к быстрому увеличению частоты дыхания (рис. S3). Поведенческие инъекции экзогенного вазотоцина в мозг и внутрибрюшинно давали параллельные результаты (таблица S1), в которых только самая высокая доза (10 мкг на грамм массы тела) изменяла количество зарядов, направленных на злоумышленника.

Рис. 7. Различия в частоте дыхания после инъекции между инъекцией в головной мозг экзогенного вазотоцина ( N = 15) и инъекцией физиологического раствора ( N = 39).

Рыбы, которым вводили вазотоцин, имели повышенную частоту дыхания по сравнению с контрольными рыбами, которым вводили физиологический раствор, в течение более чем двух часов после инъекции. Среднее ± SE * p ≤ 0,05; ** р ≤ 0,01; *** р ≤ 0,001.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0251653.g007

Поведенческая повторяемость и взаимосвязи

Повторяемость была проанализирована для двух исходных и двух трансфицированных испытаний.Заряды, укусы и время до первого укуса постоянно повторялись, то есть как на исходном уровне, так и после трансфекции, но не обязательно между исходным уровнем и трансфекцией (таблица S2). Показатели агрессии, как правило, были одинаково воспроизводимы по сравнению с физиологическим показателем частоты дыхания. Общее количество укусов и зарядов сильно коррелировали ( r = 0,69) в контрольной группе ( N = 16) и после трансфекции либо AVP ( r = 0.83, N = 18) или МАОА ( r = 0,75, N = 20). Время до первого укуса также отрицательно коррелировало с общим количеством укусов и зарядов, т.е. рыба, которая клюнула раньше, в целом и атаковала больше. Учитывая его высокую повторяемость и корреляцию с другими видами поведения, мы сосредоточимся на обвинениях как на мере агрессивного поведения в последующем анализе.

Повышенная агрессия в результате трансфекции MAOA или AVP, но не в контроле

Агрессивное поведение (заряды, рис. 8) увеличилось у рыб, трансфицированных либо AVP ( N = 18), либо MAOA ( N = 20) по сравнению с исходными измерениями у этих рыб, т.е.е. в индивидуальных повторных сравнениях измерений. Введение контрольной конструкции ( EYFP , N = 16) существенно не изменило количество зарядов (парный знаковый ранговый критерий Уилкоксона: Z = -0,01, p-значение = 0,50) по сравнению с исходным уровнем. Из-за высокой междидельской вариации (Σ 2 EYFP = 103, Σ 2 AVP = 113, Σ 2 Maoa = 100), не было значимых разница между рыбой, инъецированной AVP- или MAOA-, по сравнению с контрольной рыбой, инъецированной EYFP , в зарядах после трансфекции (критерий Манна-Уитни: AVP EYFP : Z = -0.41, p-value = 0,34, MAOA EYFP : Z = -0,7, p-value = 0,48), т.е. при сравнении между группами. В экспериментах по нейрохирургической оптимизации контрольной группы с инъекцией физиологического раствора не наблюдалось увеличения агрессии (рис. 6). Таким образом, только инъекция любого из двух генов-кандидатов, связанных с агрессией, приводила к изменению поведения и только конкретно к обвинениям (S4 Fig).

Рис. 8. Количество зарядов (усредненное по двум испытаниям) до и после трансфекции для каждой конструкции.

Каждая линия представляет индивидуума, демонстрирующего изменение поведения после трансфекции интересующего гена. Трансфекция с помощью AVP приводила к существенному и последовательному увеличению количества зарядов; обратите внимание, что только один человек продемонстрировал сниженное зарядное поведение. Трансфекция МАОА приводила к значительному увеличению величины эффекта в зарядах, хотя индивидуальный ответ отличался большей вариабельностью. * р ≤ 0,05; ** р ≤ 0,01; *** р ≤ 0,001.

https://дои.org/10.1371/journal.pone.0251653.g008

AVP оказал большое влияние на количество зарядов (парный ранговый критерий Уилкоксона: rs = 0,79, Z = -3,07, p-07, p-07) = 0,001), при этом 16 из 18 человек увеличили среднее количество зарядов по сравнению с исходным уровнем. По величине это представляло почти 100% увеличение среднего количества зарядов с 9,7 (стандартное отклонение = 5,1) в начале исследования до 18,8 (стандартное отклонение = 10,6) после трансфекции.

Трансфекция MAOA также вызвала значительное увеличение среднего количества зарядов (парный знаковый ранговый критерий Уилкоксона: rs = 0.53, Z = -2,10, p-значение = 0,018) относительно исходного уровня. Однако эффект MAOA был менее резким, чем эффект AVP , и имел большую вариабельность индивидуальной реакции (рис. 8): у 13 из 20 человек увеличилось среднее количество зарядов. Несмотря на это, MAOA по-прежнему приводил к примерно 50% увеличению заряда с 12,1 (стандартное отклонение = 9,7) на исходном уровне до 19,1 (стандартное отклонение = 10,0) после трансфекции.

МАОА снижение частоты дыхания

Только конструкция MAOA изменила частоту дыхания (рис. 9).По сравнению с исходным уровнем, MAOA сильно и значительно ( N = 20, rs = 0,85, Z = -3,62, p-значение = 0,0001) снижали частоту дыхания, при этом 19 из 20 человек испытывали снижение частоты дыхания в покое. Они снизились в среднем с 40,8 (SD = 1,9) до 38,1 (SD = 2,0) вдохов за 20 секунд. Кроме того, при сравнении частоты дыхания между рыбами, трансфицированными MAOA , и контрольными EYFP ( N = 16, означает = 40.8, с.д. = 3,9), снижение все еще было значительным, хотя и уменьшилось до умеренного размера эффекта (критерий Манна-Уитни: rs = 0,44, Z = -2,65, p-значение = 0,009). Не было значительного изменения частоты дыхания по сравнению с исходным уровнем ни из-за контроля EYFP ( Z = -1,11, p-значение = 0,13), ни из-за AVP ( Z = -0,92, p- значение = 0,18) конструкций.

Рис. 9. Частота дыхания (оперкулярные удары за 20 секунд) для трех конструкций.

Каждая линия представляет человека, показывающего его частоту дыхания (усредненную по двум испытаниям) до и после трансфекции. Только МАОА изменял частоту дыхания; резкое снижение по сравнению как с исходным уровнем (внутрисубъектное сравнение, N = 20), так и с контрольной группой (N = 16). * р ≤ 0,05; ** р ≤ 0,01; *** р ≤ 0,001.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0251653.g009

Обсуждение

Оптимизация нейрохирургии для минимально инвазивных прямых инъекций в мозг

Мы представляем новый метод прямой инъекции трансгенного или фармацевтического материала в мозг небольшой костистой рыбы трехиглой колюшки.Разработка минимально инвазивного нейрохирургического протокола требовала 1) уточнения процесса анестезии, 2) создания индивидуальной хирургической установки и 3) определения нормального режима восстановления, что позволило бы нам четко определить предупреждающие признаки задержки развития. Наша хирургическая установка и оптимизированные методы анестезии [34, 35] привели к высокой (90%) выживаемости и быстрому восстановлению поведения. Брачное поведение также быстро восстановилось: самцы завершили гнезда через три дня после операции, а самки забеременели через девять дней, что предполагает почти отсутствие задержки во времени развития яиц [84] после потери созревших яиц из-за зажима во время операции.

Создание типичной кривой восстановления (рис. 5) позволило нам определить послеоперационные предупредительные признаки задержки развития. Поведенческие проявления дискомфорта или проблем включали крен (>45° от центральной оси), принятие положения с поднятым носом и потерю контроля над положением (вращение). Присутствие любого из этих маркеров в течение более часа свидетельствует о плохом прогнозе, поэтому мы рекомендуем эвтаназию. Выживание до 24 часов указывало на успешную процедуру, так как 23 из 24 рыб, которым инъецировали большую иглу 30G, и 159 из 160 рыб, которым инъецировали меньшую иглу 33G, дожили до одной недели.Таким образом, этот малоинвазивный нейрохирургический метод достаточно надежен.

Фармакологическая манипуляция: обход гематоэнцефалического барьера

Экзогенный вазотоцин, вводимый непосредственно в головной мозг, вызывал физиологические и поведенческие реакции, зеркально отражающиеся у рыб, получавших вазотоцин посредством внутрибрюшинных инъекций (рис. 7, рис. S3 и таблица S1). Эти фармакологические результаты были аналогичны результатам, наблюдаемым у других рыб [56, 61, 85]. Это указывает на то, что инъекция в мозг в настоящее время является возможным путем доставки лекарств, которые не проходят через гематоэнцефалический барьер [86] у колюшек.В конечном счете, сходные изменения в дыхании и агрессии позволяют предположить, что период восстановления после инъекции в мозг не маскирует даже быстро наступающие фармацевтические эффекты, подобные эффектам вазопрессина [87].

В этом эксперименте сходные физиологические эффекты наблюдались на всей кривой доза-реакция (S3, рис.). В совокупности, хотя поведенческие эффекты были получены только при самой высокой дозировке, они были одинаковыми для обоих путей введения (таблица S1). Эти последовательности предполагают, что фармакологическая манипуляция действительно работала.

Трансгенез, опосредованный вирусами: генетические основы территориальной агрессии

Чтобы продемонстрировать практичность опосредованного вирусом трансгенеза для изучения вклада генов-кандидатов в поведение, мы искали поведенческие изменения двух генов-кандидатов, связанных с агрессией. Точно установлено, что на агрессию влияют как вазопрессин ( АВП ), так и моноаминоксидаза ( МАОА ) [48]. Использование вездесущего промотора приводило к изменению территориальной агрессии, особенно у рыб, получивших один из генов-кандидатов, связанных с агрессией (рис. 8), но не флуоресцентного белка (рис. 8), или после инъекции в головной мозг физиологического раствора (рис. 6).Эффект после трансфекции AVP был последовательным: у 16 ​​из 18 рыб наблюдалось усиление агрессии, у одной оставалась постоянной и только у одной снижалась агрессия.

Эффект трансфекции AVP был более сильной величиной ( RS = 0,79), чем эффект фармакологической манипулирования Vasotocin ( R мозга = 0,66, R IP = 0,67).Вероятно, это связано с широкой экспрессией по всему промежуточному мозгу. Весьма вероятно, что наша трансгенная процедура привела к эктопической экспрессии, поскольку вазотоцин обычно продуцируется только в преоптической области (POA) и вентральном гипоталамусе (VH) [31, 57]. Желательна максимальная экспрессия для повышения вероятности трансфекции и изменения поведения за счет супрафизиологических уровней передачи сигналов вазотоцина. Для будущих исследований будет полезно изучить последствия измененной экспрессии в ключевых областях мозга и типах клеток, как обсуждается ниже.

Многочисленные доказательства указывают на то, что мы достигли успешного трансгенеза, в дополнение к последовательным изменениям как поведенческих (рис. 8), так и физиологических (рис. 9) фенотипов после трансфекции. Наиболее заметным в буквальном смысле является присутствие новых флуоресцентных белков (рис. 3). Кроме того, транскрипты конкретно инъецированного гомолога MAOA млекопитающих оставались обнаруживаемыми с помощью количественной ПЦР в течение до 4 недель после трансфекции (результаты не показаны).

Наш вывод о том, что трансфекция MAOA повышает агрессивность, согласуется со снижением уровня серотонина, который ферментативно расщепляется моноаминоксидазой.Действительно, наблюдаемое нами явное и недвусмысленное снижение частоты дыхания (рис. 9) является убедительным доказательством физиологического функционирования MAOA , как и ожидалось. Частота дыхания положительно коррелирует с концентрацией серотонина и норадреналина [88, 89]; моноаминоксидаза ферментативно снижает уровни обоих нейротрансмиттеров. Кроме того, было обнаружено, что моноаминоксидаза форели эквивалентна эффективности моноаминоксидазы человека в метаболизме 5-HT и PEA [68], что делает маловероятным то, что увеличение агрессии является нецелевым эффектом использования MAOA млекопитающих .Дальнейшая характеристика уровней тревожности после трансфекции, фармакологическая помощь [90] и количественная оценка нижестоящих нейротрансмиттеров остаются потенциальными путями к лучшему механистическому пониманию этого результата.

Мы обнаружили, что отбор конструкций не ограничивается нативными генами; широко доступные плазмиды млекопитающих успешно изменили поведение. Поэтому этот метод доступен широкому кругу пользователей [91], что особенно важно в системе, уходящей корнями в этологию.Кроме того, это применение опосредованной вирусом трансфекции позволяет планировать эксперименты внутри субъекта, уменьшая размеры выборки, необходимые для той же статистической мощности, и делая поведенческие эксперименты жизнеспособными, как подробно описано ниже. Наконец, быстрое восстановление поведения делает трансгенез, опосредованный вирусами, жизнеспособным методом прямого манипулирования генами-кандидатами.

Будущие применения вирусно-опосредованного трансгенеза у колюшки

Хотя колюшки представляют собой нетрадиционную генетическую модельную систему, они представляют собой одну из наиболее изученных поведенческих систем с хорошо описанными внутривидовыми вариациями агрессии, поведения против хищников и родительской заботы [7, 14, 92].Предыдущие исследования выявили сотни генов, которые по-разному экспрессируются в мозге в ответ на социальное взаимодействие [21–27]. Однако большинство этих исследований носят корреляционный характер, и, таким образом, направление причинно-следственной связи, а тем более механизмы, с помощью которых изменения в экспрессии генов лежат в основе поведения, до сих пор не ясны. Этот метод позволит в будущих исследованиях тщательно проверить, как эти гены влияют на поведение, от детального механистического анализа на уровне белка до изучения индивидуального поведения на уровне организма.

Более подробное межпопуляционное исследование вазотоцина у колюшки могло бы предоставить идеальную возможность исследовать эволюционные ограничения или компромиссы между поведением и физиологией плейотропных генов. Вазотоцин не только связан с поведением, но и играет ключевую роль в осморегуляции через рецепторы AVP V2. Анатомия вазотоцина и агрессия у куколки различались в соответствии с проблемами солености и осморегуляции [93]. Более детальное исследование возможно в отношении колюшки, поскольку существует множество пресноводных и несколько анадромных популяций, которые независимо произошли от предковой морской популяции.Кроме того, у колюшек уже отмечены популяционные различия в агрессии [37, 94, 95] и осморегуляции [96]. Однако изучение интеграции этих двух эволюционных проблем еще не проводилось, несмотря на то, что связь между агрессией и размером почек уже была обнаружена у колюшек, выведенных для крайних проявлений территориальной агрессии [97]. Это делает колюшку уникально подходящей системой для изучения взаимосвязи физиологической экологии, анатомии и социального поведения [48].Были предложены и другие возможные физиологические сигнальные пути, поддающиеся редактированию генома у колюшек [13, 98–101].

Поведенческая реакция на вазопрессин/вазотоцин

В каждом испытанном нами случае манипулирования сигналами вазотоцина — фармакологического ингибирования IP (соединение Мэннинга) или добавок, экзогенной инъекции в мозг и трансфекции — количество зарядов у злоумышленника было основным ответным агрессивным поведением (рис. 8 и таблица S2). Заряды как основное ответное поведение соответствуют эффектам вазотоцина, наблюдаемым у куколок [85].Это представляет интерес, поскольку нападение означает добровольное начало агрессии, в то время как укусы — это эскалация, основанная на реакции злоумышленника [28]. Однако в зависимости от типа манипуляции мы наблюдали противоположное влияние на количество зарядов: фармакологическая добавка экзогенного вазотоцина приводила к уменьшению, а трансфекция с помощью AVP приводила к увеличению. Как обсуждалось ранее, есть основания с высокой степенью уверенности относиться как к фармакологическим методам лечения, так и к методу трансфекции, несмотря на различные направления действия.

Эти методы имеют совершенно разные сроки и продолжительность увеличения вазотоцина, что потенциально объясняет разные направления поведенческих изменений. Фармакологическая манипуляция включала однократную дозу и поведенческий анализ через два часа, в то время как эксперимент по трансгенезу включал увеличение экспозиции в течение двухнедельного инкубационного периода с двумя поведенческими анализами в течение трех дней (рис. 4). Вазопрессин имеет чрезвычайно короткий период полураспада, менее минуты [87], что делает фармакологические манипуляции быстрыми, но эфемерными.Напротив, трансфекция длится гораздо дольше, что позволяет обеспечить долгосрочную стабилизацию оси HPA и соразмерно изменить поведенческий ответ.

Кроме того, передача сигналов вазотоцина в основном ограничена типом и расположением рецепторов [48, 49, 58], что еще больше подчеркивает потенциал долгосрочного гомеостаза для влияния на поведенческие результаты. Чтобы имитировать это с помощью фармакологических манипуляций, в будущей работе следует использовать имплантированную канюлю в мозг для повторной доставки низких доз экзогенного вазотоцина.Это позволило бы провести более прямое сравнение между методами лечения, чтобы выяснить, связаны ли противоположные эффекты фармакологических манипуляций и трансгенеза с гомеостатическим балансом от длительного воздействия или с потенциальным побочным эффектом от иммунного ответа на инъекцию малых молекул.

Вирус-опосредованный трансгенез позволяет проводить статистически достоверные повторные измерения

Сложные фенотипы, проявляющиеся на уровне всего организма, такие как агрессивное поведение, трудно оценить из-за их тонкости и длительной проверки.На социальное поведение влияют многие гены с малым эффектом [3, 4], а социальная психология обычно имеет меньшую величину эффекта ( r ) по сравнению с другими психологическими субдисциплинами [102]. Действительно, нейробиология, психиатрия, психология и поведенческая экология изобилуют сообщениями о завышенных оценках величины эффекта [102–105]. Кроме того, поведение в естественных популяциях, как правило, имеет высокие межиндивидуальные вариации, что еще больше снижает статистическую мощность [106]. Для колюшек, время генерации которых составляет примерно один год, традиционный подход к выведению стабильной трансгенной линии не всегда практичен.Здесь, используя внутрисубъектный дизайн, мы успешно исследовали два поведенчески значимых гена на предмет влияния на агрессию у выловленной в дикой природе рыбы.

Используя повторные измерения на одной и той же рыбе до и после трансфекции, мы смогли резко уменьшить необходимый размер выборки, необходимый для обнаружения существенных изменений в поведении (таблица 1). В этом исследовании мы обнаружили большие размеры эффекта как для поведения, так и для частоты дыхания, что является типичной физиологической мерой. Однако вариация после трансфекции MAOA была примерно в 25 раз больше для зарядного поведения ( σ 2 = 99.9) по сравнению с частотой дыхания ( σ 2 = 3,9). Сравнение между группами потребовало бы нецелесообразного размера выборки целых 300 рыб, чтобы обнаружить разницу в зарядах, даже несмотря на то, что эти гены имеют большую величину ( rs > 0,5) влияния на поведение. Однако, используя эти методы, мы смогли уменьшить размер выборки всего до 20 рыб, что является гораздо более приемлемым числом. Таким образом, трансгенез, опосредованный вирусами, позволяет изучать генетические эффекты естественного поведения выловленных в дикой природе животных, поскольку он делает возможным сравнение дизайна повторных измерений в пределах одних и тех же особей, повышая чувствительность.

Выводы

Вирус-опосредованный трансгенез — это метод изменения экспрессии гена в определенном месте или в течение контролируемого периода времени. Усовершенствования как стереотаксической процедуры, так и дизайна конструкций обещают улучшение специфичности целевых областей мозга и типов клеток, что позволяет с большой точностью манипулировать экспрессией генов. Мы успешно использовали несколько вездесущих промоутеров для управления экспрессией, адаптируя профили экспрессии во времени.Локализация экспрессии в определенных областях мозга является приоритетом для будущей работы, но ограничение количества инъекций и мест может привести к неудаче трансфекции. Следовательно, мы намерены отдать приоритет клеточно- и регионально-специфичному нацеливанию с помощью альтернативных промоторов (см. Ingusci et al., 2019 [12]). Существует также огромный потенциал для использования этого метода в сочетании со специфическими для типа клеток промоторами, которые, например, нацелены на астроциты ( GFAP ), глутаматергические ( vGLUT ), ГАМКергические ( GAD ), дофаминергические ( TH ) или пролактиновые ( PRL ) нейроны.

В сочетании с фармакологическими манипуляциями DREDD (дизайнерские рецепторы, активируемые исключительно дизайнерскими лекарствами, обзор Roth, 2016 [107]) могут нацеливаться на передачу нервных сигналов с чрезвычайно точным временем. Этот метод уже используется для идентификации нейронных цепей посредством химического подавления или активации рецепторов, в том числе серотонинергических [12]. Наконец, трансгенез, опосредованный вирусами, также закладывает основу для оптогенетики, хотя все еще существуют инженерные проблемы, связанные с созданием легких, свободных от привязи устройств, которые не мешают сложному поведению рыб весом менее 2 граммов.

Здесь мы представляем минимально инвазивную нейрохирургическую процедуру для колюшек, которая позволяет проводить вирусопосредованный трансгенез в головном мозге, а также доставлять фармацевтические препараты непосредственно в мозг. Этот метод трансгенеза, опосредованного вирусами, позволяет более непосредственно изучить генетические механизмы, лежащие в основе поведения выловленных в природе животных из природных популяций. Он гибкий, быстрый и позволяет нам сравнивать индивидуальное поведение до и после трансгенеза, максимизируя статистическую мощность.Это еще больше расширяет растущий молекулярный инструментарий трехиглой колюшки, классической этологической системы. Используя систему с тщательно оптимизированными поведенческими тестами, мы получили хорошую чувствительность к различным воздействиям на агрессию, поскольку было изменено только начало агрессии (нападения), а не эскалация агрессивных взаимодействий (укусы). В целом, наши экспериментальные результаты показывают, что трансгенез, опосредованный вирусами, является многообещающим методом проверки функции генов-кандидатов в этой системе.Этот подход уже оказался важным при функциональном тестировании генов, связанных с поведением [5, 8, 9], и при рассечении нейронных цепей [10] у других организмов.

Что такое кетамин? Как это работает и помогает при тяжелой депрессии

Джефф Виноград не знал взрослой жизни без депрессии. С 20 лет он перепробовал практически все антидепрессанты, представленные на рынке. Но он говорит: «Депрессия была просто постоянной».

К тому времени, когда ему исполнилось 45 лет, к тому времени Виноград был отцом двоих маленьких детей и малоимущим кино- и видеопродюсером в Портленде, штат Орегон.Депрессия была настолько тяжелой, что он чувствовал себя парализованным.

«Весь день просидел на диване, не мог пошевелиться, не мог пошевелить ногами, — говорит он. «И я был самоубийцей. Я сидел и пытался понять, как я собираюсь это сделать, не причинив вреда своим детям».

Примерно в то же время друг-врач рассказал ему о кетамине для лечения резистентной депрессии.

Что такое кетамин?

Кетамин появился в Бельгии в 1960-х годах как лекарство для анестезии животных.FDA одобрило его в качестве анестетика для людей в 1970 году. Он использовался для лечения раненых солдат на полях сражений во время войны во Вьетнаме. В отличие от других анестетиков, кетамин не замедляет дыхание или частоту сердечных сокращений, поэтому пациентам не нужно подключаться к аппарату искусственной вентиляции легких, чтобы получить его.

Аварийно-спасательные службы могут дать его возбужденному пациенту, которого они, например, спасли от попытки самоубийства. Именно так Кен Стюарт, доктор медицины, говорит, что врачи начали понимать, что препарат обладает мощным действием против депрессии и суицидальных мыслей.

«Кто-то пытается спрыгнуть с моста, ему в машине скорой помощи дают кетамин, чтобы успокоить, а через 9 месяцев он говорит: «У меня не было суицидальных мыслей уже 9 месяцев».

«Когда хватит историй вроде которые начали накапливаться, врачи сказали: «Может быть, здесь что-то есть», — говорит Стюарт, врач скорой помощи и основатель Insight Ketamine в Санта-Фе, штат Нью-Мексико. Как и само лекарство, Стюарт начал заниматься боевой медициной во время войны во Вьетнаме. Некоторые врачи также используют кетамин для лечения суицидальных мыслей.

Кетамин вызывает то, что врачи называют «диссоциативным опытом» и то, что большинство других людей назвали бы «трипом». Так он стал клубным наркотиком, который назывался, среди прочего, K, Special K, Super K и Vitamin K. Сторонники вводят его, добавляют в напитки, нюхают или добавляют в косяки или сигареты.

«Кетамин может вызывать ощущение нереальности; зрительные и сенсорные искажения; искаженное ощущение собственного тела; временные необычные мысли и убеждения; и эйфория или кайф», — говорит Джон Кристал, доктор медицины, заведующий психиатрией Йельской больницы Нью-Хейвен и Йельской школы медицины в Коннектикуте, где он является лидером в изучении антидепрессивных эффектов кетамина.

Поездка длится около 2 часов. Но есть риски случайного использования. Наиболее серьезными из них являются потеря сознания, высокое кровяное давление и опасно замедленное дыхание. Препарат также может вызывать долгосрочные проблемы, такие как язвы и боли в мочевом пузыре; проблемы с почками; боль в животе; депрессия; и плохая память. Кетамин может быть смертельным для людей, злоупотребляющих алкоголем или принимающих его в состоянии алкогольного опьянения.

Но внимание исследователей привлек потенциал препарата как средства от депрессии и противоядия от суицидальных мыслей.Они изучили и применяли его в контролируемых клинических условиях, чтобы помочь с резистентной к лечению депрессией и другими состояниями.

Для ясности: повседневное использование не является средством от депрессии. Но врачи разработали протокол для использования под медицинским наблюдением, который может помочь людям, которым не помогают другие лекарства.

«Мы по-новому обращаемся к пациентам, которые не реагировали на другие виды лечения, и помогаем некоторым из них впервые избавиться от депрессии», — говорит Кристал.

Получение кетамина

Кетамин выпускается в нескольких формах. Единственный препарат, одобренный FDA в качестве лекарства от депрессии, — это назальный спрей под названием эскетамин (Spravato). Это для взрослых, которым либо не помогли антидепрессанты, либо у которых большое депрессивное расстройство, либо они склонны к суициду. Они продолжают принимать антидепрессанты и получают эскетамин в кабинете врача или в клинике, где медицинский работник наблюдает за ними в течение 2 часов после приема дозы.

При резистентной к лечению депрессии пациенты обычно получают назальный спрей два раза в неделю в течение 1–4 недель; затем один раз в неделю с 5 по 9 неделю; и затем раз в неделю или 2 после этого.

Спрей имеет «черный ящик», предупреждающий о риске седативного эффекта и проблем с вниманием, суждением и мышлением, а также о риске злоупотребления или неправильного использования препарата и суицидальных мыслей и поведения.

Другие формы кетамина, не одобренные FDA для лечения психических заболеваний, включают внутривенное вливание, инъекцию в руку или леденцы. В большинстве исследований рассматривается кетамин, вводимый внутривенно. Вы можете получить его только внутривенно или сделать укол в кабинете врача. Некоторые врачи прописывают леденцы для домашнего использования — часто для предотвращения депрессии между вливаниями.

В своей клинике Стюарт принимает только пациентов, имеющих направление от врача, который диагностировал у них резистентную к лечению депрессию. Стюарт не ставит эти диагнозы. Он начинает пациентов с основанных на исследованиях шести инфузий с интервалом в 3 недели.

«Вот как люди начинают, — говорит Кристал. «Две инфузии в неделю, а затем они снижаются до одной инфузии в неделю, а затем большинство людей в конечном итоге переходят на одну инфузию каждые 2–4 недели».

В большинстве исследований первоначальное лечение прекращается через 6 недель.Нет никаких исследований, чтобы предположить, что более 6 недель подряд приносят больше пользы, хотя люди возвращаются к бустерам, если симптомы возвращаются.

В/в инфузия длится около 40 минут. Диссоциативный опыт начинается быстро и проходит через 15–20 минут после окончания капельницы. Врач всегда находится на месте в течение всего процесса. Врач не обязательно находится в палате с человеком, которого лечат, но он доступен, если ему что-то нужно, или если он встревожен или сбит с толку.

Пока пациент находится под капельницей, говорит Стюарт, они выглядят спящими.Большинство не двигаются и не разговаривают. Хотя некоторые, по его словам, могут говорить или комментировать музыку, играющую в их наушниках, или какую-то часть своего опыта, или, возможно, спрашивать, где они находятся. Если им что-то не нужно, говорит Стюарт, никто не вмешивается.

Криста Коултер-Скотт, педиатрическая медсестра из Афин, Джорджия, проходила лечение в аналогичном учреждении в Гейнсвилле, Джорджия. Она говорит, что не хотела просыпаться. «Это было похоже на духовное путешествие. Я чувствовал тепло, безопасность и уверенность. По мере того, как лечение продолжалось, весь груз стресса постепенно снимался с меня.Я чувствовал, что сила вселенной на кончиках моих пальцев».

Это смелое заявление от 51-летнего мужчины, который с детства чувствовал себя беспомощным перед депрессией и тревогой. Во взрослом возрасте у нее также диагностировали посттравматическое стрессовое расстройство и хроническую боль. Коултер-Скотт перепробовал 10 различных антидепрессантов за эти годы. Но темное облако депрессии не сдвинулось с места.

Тем не менее, после кетаминовой терапии она говорит: «В голове стало легче, и у меня нет этого мрачного, темного, тяжелого ощущения в голове.И все вокруг меня выглядит ярче — солнце, свет в моем офисе».

Вернувшись на работу на следующий день после инфузии, она спросила коллегу, не меняли ли освещение. Это не так. «Я не знаю, является ли это побочным эффектом кетамина или побочным эффектом снижения депрессии».

Виноград описывает его аналогично. Он говорит об ощущении, будто он плавает в цвете. «Это был первый раз, когда я понял выражение «счастливое место». Это было то место, где исчезло все, что имело отношение к моей реальной жизни, и у меня не было того веса, который я ношу с собой, куда бы я ни пошел.

Антидепрессивное действие кетамина проходит через часы, дни или пару недель у людей, которые получают только одну инфузию. Серия инфузий имеет более продолжительный эффект.

Возвращение к реальной жизни

В клинике Стюарта, после того, как часть эксперимента с кетамином, изменяющая сознание, закончилась, медицинский работник садится и разговаривает с пациентом в рамках процесса, называемого интеграцией. Другие клиники могут порекомендовать пациентам продолжить разговорную терапию в другом месте.

«Я чувствую, что это важно, — говорит Стюарт.«Когда люди выходят из этого действительно глубокого опыта, им есть что сказать, и это люди, у которых много багажа и много переживаний. Во многих случаях кетамин приводит к распаковке этого багажа».

Кристал, которая предоставляет кетамин внутривенно и интраназально для лечения резистентных расстройств настроения в системе здравоохранения штата Коннектикут и больнице Йель-Нью-Хейвен, призывает пациентов продолжать психотерапию после лечения кетамином.

Врачи, которые вводят внутривенно кетамин, как правило, рекомендуют пациентам также продолжать их обычный режим приема антидепрессантов.Что касается назального спрея, он одобрен только для использования вместе с пероральным антидепрессантом.

«Кетамин — это вмешательство, но понятие «лечение» гораздо шире», — говорит он.

Через несколько недель, месяцев или лет после первой серии из шести-восьми доз пациенты могут вернуться для повторной вакцинации. Стандартных рекомендаций относительно того, когда и нужна ли людям бустерная терапия, не существует. Они обсуждают это со своим врачом, если симптомы депрессии начинают появляться снова.

«Примерно для 30% людей, прошедших всю серию, все.Они никогда не возвращаются», — говорит Стюарт. «Для тех, кто возвращается за бустерами, кажется, что бустеры становятся все дальше и дальше друг от друга, пока в конце концов они им снова не понадобятся».

Как это работает

Как для Winograd, так и для Coulter-Scott, а также примерно для 70% людей, которые принимают кетамин под медицинским наблюдением в связи с психическим расстройством, польза от кетамина сохраняется и после окончания поездки. Исследователи изучают, почему это может быть.

Вот что они знают на данный момент: у некоторых людей, страдающих депрессией, не будет наркотического трипа, который обычно вызывает кетамин, но они все равно сообщают об облегчении депрессии, которое начинается через несколько дней после приема дозы.

«Когда кетамин находится в вашем организме, у вас, вероятно, будут диссоциативные эффекты, но это не лечение», — говорит Кристал. «Это просто то, через что вы проходите, чтобы получить лечение. Лечение кетамином — это реакция вашего мозга на кетамин, то, как ваш мозг реагирует на воздействие кетамина».

Мозг может реагировать по-разному, в зависимости от того, в каком состоянии он был изначально. Например, некоторые люди с длительной депрессией теряют некоторые важные соединения в мозгу (называемые синапсами), которые позволяют нервным клеткам общаться.

«Мы думаем, что количество синапсов уменьшается, потому что депрессия вызывает такой стресс, что вы фактически обрезаете или теряете некоторые синаптические связи в мозгу», — говорит Кристал.

Но исследования показывают, что в течение 24 часов после приема первой дозы кетамина под медицинским наблюдением утраченные связи начинают восстанавливаться. Чем больше у них синапсов, тем лучше для них антидепрессивное действие кетамина.

Другие эффекты на мозг

Кетамин может воздействовать и на мозг другими способами.

Некоторые нервные клетки (нейроны) в головном мозге, отвечающие за настроение, используют химическое вещество (нейротрансмиттер) под названием глутамат для связи друг с другом. Нервным клеткам нужны рецепторы глутамата — думайте о них как о ловчих рукавицах для глутамата — чтобы присоединиться к этой коммуникации.

В мозгу некоторых людей, страдающих депрессией, эти нервные клетки больше не так возбуждаются глутаматом. Как будто рецепторы глутамата — рукавицы ловца — деактивированы или ослаблены.

Но после того, как люди с этой конкретной проблемой получают кетамин, эти соединения нервных клеток пополняются новыми рецепторами глутамата.Как будто кетамин помогает сделать новые ловчие рукавицы для глутамата, чтобы нервные клетки могли снова реагировать на него.

Исследования показывают, что, хотя основное действие кетамина направлено на глутаматные рецепторы, ему также нужны опиоидные рецепторы, чтобы оказывать антидепрессивное действие. Для психиатра Алана Шатцберга, доктора медицины, который провел некоторые исследования, которые выявили это, это вызывает беспокойство.

«Возможно, это не имеет значения, но лично меня беспокоит, что кетамин действует через опиоидный механизм», — говорит он.Беспокойство, о котором упоминали другие исследователи в исследованиях кетамина, заключается в том, что людям могут требоваться все большие и большие дозы кетамина с течением времени, чтобы почувствовать его эффекты — как в случае с опиоидными болеутоляющими средствами. Распространение и сужение лечения с течением времени должно помочь снизить этот риск.

Конечно, любое сравнение с опиоидами поднимает вопрос о риске зависимости.

«Я думаю, что он, вероятно, вызывает меньше привыкания, чем опиоиды, но он не лишен рисков», — говорит Шацберг, директор Центра расстройств настроения Стэнфордского университета.Действительно, в тематических исследованиях описывались люди, которые проявляли признаки зависимости или злоупотребляли наркотиками.

Поскольку это лечение не по прямому назначению, возможно, еще слишком рано говорить о том, перевешивают ли риск привыкания или толерантности возможные преимущества. Однако важно отметить, что некоторые рекомендации предполагают, что это может быть небезопасно для людей, которые в прошлом злоупотребляли психоактивными веществами. Многие клинические испытания не допускали к участию людей с проблемами, связанными с употреблением психоактивных веществ.

Это также может быть небезопасно для людей, страдающих шизофренией.«В дозе антидепрессанта кетамин временно ухудшает симптомы психоза», — говорит Кристал.

Изменение формы мозга

Что касается действия препарата на рецепторы глутамата: восстановление и реактивация синапсов помогает мозгу изменяться, что может помочь ему выйти из депрессии. Это также может объяснить, почему антидепрессанты или психотерапия, которые не помогали до кетамина, могут помочь после.

Виноград говорит, что до кетамина он ходил на терапию только потому, что его умоляла семья.«После того, как я стал чувствовать себя лучше, — говорит Виноград, — мой терапевт начал обретать смысл».

Что касается Коултер-Скотт, ей сделали всего четыре вливания из шести доз, и она уже говорит, что лучше спит ночью. Проблемы со сном — распространенный симптом депрессии. По ее словам, одна воспитывая свою 4-летнюю внучку, она все еще испытывает стресс, но он не приходит вместе с темнотой и тревогой, с которыми она жила до сих пор.

Расходы и страховка

Как правило, единственным средством лечения депрессии кетамином, которое покрывает страховка, является одобренный FDA назальный спрей под названием эскетамин (Spravato).

Поскольку FDA не одобрило внутривенное введение кетамина для лечения депрессии, большая часть страховки не покрывает его. Без страховки инфузия стоит около 450 долларов. Это составляет от 3000 до 4000 долларов за основанные на исследованиях шесть инфузий в течение 3 недель. Это не включает бустеры, когда симптомы появляются снова.

«Некоторые пациенты и некоторые практикующие врачи предпочитают внутривенное введение интраназальному введению. Но нет убедительных данных, чтобы сделать вывод, что один лучше другого, или предсказать, кто выиграет от одного по сравнению с другим», — говорит Кристал.

Некоторые люди могут не успевать за своим лечением, особенно если они не могут себе это позволить или если их страховка не покрывает это. Стюарт говорит, что когда люди не возвращаются в его клинику для продолжения лечения, он не знает, потому ли это, что они все еще чувствуют себя хорошо, или потому, что они не могут позволить себе вернуться.

Страховые споры не позволили Винограду получить бустер, даже с назальным спреем, хотя он и его медицинские работники считают, что он получит от этого пользу.Тем не менее, по его словам, большие изменения, вызванные первой серией процедур, сохранились.

«Это не было временным изменением, — говорит он. «Это был сдвиг в том, кто я есть, в том, как я отношусь к миру, и в моих чувствах к собственным эмоциям».

Гибкие иглы, разработанные для доставки стволовых клеток в мозг

Пока бригада хирургов готовила инструменты, на пластиковом подносе лежала отрубленная человеческая голова, лицо которой было закрыто синей тканью. Он оттаял за последние 24 часа, и около верхней части его черепа было проделано трепанационное отверстие размером с мизинец.Скальп покрыт щетиной цвета соли и перца, морщинистой сверху и снизу от розовой полоски гладкой кости.

В течение следующих двух часов голова будет сканироваться на аппарате магнитно-резонансной томографии (МРТ), пока исследователи под руководством Даниэля Лима, нейрохирурга и исследователя стволовых клеток из Калифорнийского университета в Сан-Франциско, тестировали гибкую иглу для доставки клеток в головной мозг.

Несколько лабораторий изучают способы лечения неврологических заболеваний путем введения клеток в мозг пациентов, проводятся клинические испытания болезни Паркинсона, инсульта и других нейродегенеративных заболеваний.Эти исследования последовали за экспериментами, показывающими значительные улучшения на крысах и мышах. Но по мере того, как работа над потенциально терапевтическими клетками продвигалась вперед, необходимые хирургические методы отставали, говорит Лим.

В 2008 году исследователи под руководством Стивена Голдмана из Университета Рочестера в Нью-Йорке показали, что они могут заставить мышей с тяжелой степенью инвалидности ходить, вводя глиальные клетки-предшественники человека в пять участков мозга грызунов.

Эти результаты обнадеживают, но человеческий мозг более чем в 1000 раз больше, чем мозг мыши, и доставить клетки в нужные места гораздо сложнее.«Люди знают, как получить клетки у животных, но забывают о проблеме увеличения масштабов у людей», — говорит Лим.

Необходимые инструменты
Работая с биоинженерами и нейрохирургами, Лим разработал иглу, которая сгибается. Сначала в мозг вводят прямую тонкую трубку, через которую проталкивают гибкий нейлоновый катетер. Дефлектор внутри трубки выгибает катетер вверх и в сторону от входного канала, а еще более узкий поршень выбрасывает клетки из катетера. За одну инъекцию устройство может вводить клетки в любом месте в радиусе 2 сантиметров вдоль дорожки, что превышает объем всего мозга мыши.

Несколько исследователей надеются использовать устройство Лима для клинических испытаний при раке головного мозга и нейродегенеративных заболеваниях. Сяньминь Цзэн, специалист по стволовым клеткам из Института Бака в Новато, Калифорния, которая работала с Лим над испытанием устройства на свиньях, говорит, что надеется подать заявку на использование устройства в клинических испытаниях для лечения болезни Паркинсона до конца 2014 года.

Группа ученых из Калифорнийского университета в Сан-Франциско и StemCells, биотехнологической компании, базирующейся в Ньюарке, штат Калифорния, хочет использовать устройство для лечения болезни Пелизеуса-Мерцбахера, смертельного нейродегенеративного расстройства.В прошлом году компания сообщила об обнадеживающих результатах первой фазы клинических испытаний трансплантатов нейральных стволовых клеток для лечения этого заболевания.

Путь к улучшению
По словам Зенга, устройство Лима может сократить количество инъекций, необходимых для лечения клеток. Это может обеспечить более точный контроль объема доставляемых клеток и гарантировать, что клетки, доставленные в мозг, останутся в мозге, избегая проблемы рефлюкса, при котором клетки, введенные с помощью прямых игл, вытекают обратно на поверхность мозга по пути иглы. .

«Каждый раз, когда вы втыкаете иглу в мозг, вы рискуете кровоизлиянием и повышаете риск нежелательных эффектов», — говорит Ян Дункан, нейробиолог из Университета Висконсин-Мэдисон, не участвующий в проекте Лим.

Кроме того, в отличие от других игл, используемых для клеточной терапии, устройство Лима не содержит ферромагнитных металлов и поэтому совместимо с МРТ. Визуализация позволит исследователям отслеживать пациентов на наличие признаков кровоизлияния и сочетать клеточную терапию с другими методами, такими как размещение электродов для глубокой стимуляции мозга, экспериментальная терапия болезни Паркинсона.

Но эти потенциальные преимущества требуют, чтобы игла работала должным образом. Лим и его коллеги экспериментировали с иглой в агарозных формах и на живых свиньях, но на прошлой неделе они начали тестировать устройство и хирургический процесс на реальных человеческих тканях.

Испытания в основном прошли успешно. Исследователи подтвердили, что устройство можно устойчиво закрепить на черепе, а инъекции занимают всего несколько минут и попадают в ожидаемое место. Была одна загвоздка: когда устройство было установлено на черепе, некоторые из его калибровочных отметок было трудно прочитать, но Лим говорит, что это будет легко исправить.

Несмотря на это, Голдман ожидает, что простые прямые иглы все еще будут использоваться для лечения в ближайшие несколько лет. Он является членом Empire State Stem Cell Board, консорциума, который в прошлом году получил 12 миллионов долларов США на проведение клинических испытаний терапии рассеянного склероза стволовыми клетками. Голдман считает, что тип клеток, с которым он работает, может перемещаться далеко за пределы того места, куда их вводят с помощью иглы. «Они действительно быстро проносятся вперед», — говорит он.

Игла Лима — не единственное новое устройство для инъекций мозга, которое тестируется на людях.Ивар Мендес, нейрохирург из Университета Далхаузи в Галифаксе, Канада, создал Halifax Injector, который доставляет клетки не с помощью шприца с ручным управлением, а с помощью крошечных двигателей, управляемых компьютером. До сих пор Мендес говорит: «Инъекция делалась с помощью очень примитивных систем».

Несомненно, доставка будет важна, но решение этой проблемы потребует лучшего понимания того, как работает клеточная терапия в мозге, говорит Гэри Стейнберг, заведующий кафедрой нейрохирургии в Стэнфордском университете в Пало-Альто, Калифорния.«Мы до сих пор не знаем, какой тип клеток», — говорит он. «Мы даже не знаем, является ли прямой путь введения в мозг правильным». По его словам, каждое заболевание, травма и тип клеток создают новые проблемы.

Но Лим беспокоится, что усилия, подобные его, уже позади, учитывая прогресс в разработке новых методов лечения. «Если мы не сделаем работу сейчас, прежде чем мы посчитаем, что она нам нужна, то она никогда не будет готова».

Уточнено: В более ранней версии статьи в отношении использования устройства для лечения болезни Пелизеуса-Мерцбахера говорилось, что ученые UCSF и StemCells «надеются получить на это разрешение регулирующих органов к концу года».StemCells в настоящее время не участвует в клинических испытаниях, необходимых для одобрения устройства, но устройство может быть включено в будущие испытания в ожидании разрешения Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США, известного как 510(k).

Эта статья воспроизведена с разрешения журнала Nature . Статья была впервые опубликована 4 марта 2013 г. и уточнена 6 марта 2013 г.

Игла размером с человеческий волос делает возможными инъекции в мозг области мозга размером до одного кубического миллиметра.Используя иглу размером с человеческий волос, система может позволить лечить заболевания, поражающие мозг, напрямую через определенные цепи или области, не повреждая и не взаимодействуя с другими близлежащими областями. Исследование было опубликовано в журнале

Science Translational Medicine .

Ультратонкая игла содержит трубки, которые могут доставлять лекарства глубоко в мозг. Все используемые компоненты очень тонкие, что дает врачу, проводящему процедуру, максимальный контроль с точки зрения размещения и глубины иглы, а также количества дозируемого лекарства.Исследователи протестировали технологию на крысах и успешно смогли доставить дозу лекарства в определенную область мозга, которая влияла на двигательную функцию крысы.

Эта миниатюрная система может значительно улучшить лечение заболеваний головного мозга. Изображение предоставлено: Канан Дагдевирен / Массачусетский технологический институт

«Мы можем вводить очень небольшие количества нескольких лекарств по сравнению с тем, что мы можем делать внутривенно или перорально, а также управлять изменениями поведения посредством введения лекарств», — Канан Дагдевирен, доцент Массачусетского технологического института и ведущий автор статьи, говорится в пресс-релизе Массачусетского технологического института.

Огромный эффект

Исследователи из Массачусетского технологического института смогли не только успешно вводить лекарства в строго определенные места, но и вводить отдельную дозу физиологического раствора, чтобы вымыть лекарство, что давало им максимальный контроль при дозировании .

Возможность прямого введения лекарств в мозг может не только привести к новым методам лечения, но и заметно улучшить существующие. Многие лекарства, используемые в настоящее время для лечения расстройств и болезней головного мозга, часто имеют множество побочных эффектов, в основном потому, что лекарства могут воздействовать на области мозга, отличные от тех, для лечения которых они были разработаны.

«Мы считаем, что это крошечное микротехнологическое устройство может оказать огромное влияние на понимание заболеваний головного мозга, — сказал Роберт Лангер, профессор Массачусетского технологического института и один из ведущих авторов статьи, — а также предоставить новые способы доставки биофармацевтических препаратов и проведения биосенсорных исследований в мозг.»

Заботитесь о поддержке внедрения чистой энергии? Узнайте, сколько денег (и планеты!) вы могли бы сэкономить, перейдя на солнечную энергию, на UnderstandSolar.com. Зарегистрировавшись по этой ссылке, Futurism.com может получить небольшую комиссию.

Нервные стволовые клетки впервые в мире введены в мозг пациента, перенесшего инсульт | Стволовые клетки

Врачи ввели нервные стволовые клетки в мозг мужчины в рамках первого в мире клинического испытания этого типа стволовых клеток у пациентов, перенесших инсульт.

Бывший водитель грузовика, которому за 60, 18 месяцев назад получил серьезную инвалидность в результате инсульта и нуждается в постоянном уходе со стороны жены.

Врачи ввели около двух миллионов нервных стволовых клеток в здоровую область его мозга, называемую скорлупой, недалеко от того места, где нейроны были повреждены в результате инсульта.Они надеются, что введенные клетки будут выделять химические вещества, которые стимулируют рост новых клеток мозга и кровеносных сосудов, заживляя рубцовую ткань и уменьшая воспаление.

Команда под руководством профессора Кейта Мьюира из Института неврологии и психологии Университета Глазго планирует вылечить в ходе испытания еще 11 пациентов мужского пола в возрасте от 60 до 85 лет, используя все более высокие дозы пяти миллионов, 10 млн и 20 млн клеток.

Инъекции делают пациентам, перенесшим ишемический инсульт, наиболее распространенный тип, вызванный закупоркой кровеносного сосуда в головном мозге.Операция требует общей анестезии, и пациенты будут находиться под наблюдением в течение двух лет, чтобы убедиться, что процедура безопасна и оказывает какое-либо положительное влияние на качество их жизни.

Джон Синден, главный научный сотрудник ReNeuron, компании из Суррея, разработавшей клетки, сказал о первом пациенте, получившем экспериментальную инъекцию: «Он действительно ищет какой-то уровень независимости».

Исследования на животных показали, что клетки безопасны и эффективны при лечении травм головного мозга.«Мы наблюдаем возобновление роста кровеносных сосудов, образование новых нейронов, уменьшение рубцов и воспаления в головном мозге», — сказал Синден. «Происходит ряд вещей, которые лучше всего описать как то, что мозг в какой-то степени исцеляет себя».

Одна из проблем терапии стволовыми клетками заключалась в том, могут ли они вызвать рак, но Синден сказал, что нейральные стволовые клетки, использованные в последнем испытании, по-видимому, не образуют опухоли. Они получены из клеток головного мозга, взятых у 12-недельного плода в США.На этой стадии своего развития клетки стремятся стать клетками мозга.

Испытание, известное как Пилотное исследование стволовых клеток при инсульте (PISCES), в первую очередь направлено на оценку безопасности инъекций стволовых клеток, но врачи будут использовать изображения мозга и видеозаписи ходьбы пациентов, чтобы оценить эффективность терапии. помогает им восстановиться после инсульта.

Исследование PISCES не является первым, в котором стволовые клетки вводятся в мозг пациентов; разница в том, что он использует нервные стволовые клетки.Например, в 2006 году врачи из Орегона пересадили фетальные стволовые клетки в мозг детей с неизлечимым и смертельным заболеванием, называемым болезнью Баттена. Первая фаза испытаний показала, что лечение было безопасным.

Энтони Холландер, профессор ревматологии и тканевой инженерии Бристольского университета, сказал: «Успешная терапия стволовыми клетками станет результатом кропотливых исследований и тщательно спланированных клинических испытаний.


Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

*
*