Белок а: Ассоциированный с беременностью плазменный белок А (РАРР-А)
Ассоциированный с беременностью плазменный белок А (РАРР-А)
Что такое РАРР-А (Ассоциированный с беременностью протеин плазмы A, ПАПП-А)?
Это белок плазмы крови, содержание которого повышается при нормально протекающей беременности. В норме РАРР-А в тех или иных количествах содержится в крови не только беременных, но и других женщин, а также мужчин. Во время беременности PAPP-A вырабатывается синцитиотрофобластом (тканью, являющейся наружным слоем плаценты) и экстраворсинным цитотрофобластом (островками клеток плода в толще слизистой оболочки матки) и поступает в кровоток матери.
Уровень РАРР-А в плазме крови зависит от срока беременности и состояния внутриутробного плода. Проведение анализа РАРР-А позволяет определить группу риска по замершей беременности, угрозе прерывания беременности, хромосомным болезням плода. Определение уровня РАРР-А используется в комплексной диагностике синдромов Дауна, Эдвардса, Корнелии де Ланге. Все эти хромосомные болезни являются неподдающейся коррекции патологией развития и сопровождаются выраженной умственной отсталостью, нарушениями развития внутренних органов и физическими уродствами.
Уровень этого маркера в конце первого триместра беременности (8-14 недель) значительно снижен при наличии у плода трисомии 21 или трисомии 18 (синдром Эдвардса). Уникальностью этого показателя является то, что значимость его как маркера синдрома Дауна исчезает после 14 недель беременности. Во втором триместре уровни его в материнской крови при наличии у плода синдрома Дауна не отличаются от таковых у беременных со здоровым плодом.
Изолированное определение уровня PAPP-A в качестве маркера риска синдрома Дауна имеет диагностическое значение, начиная с 8–9 недели.
Наиболее часто PAPP-A применяется в качестве одного из трех маркеров риска трисомии 21 (синдром Дауна) (вместе с бета — ХГЧ и толщиной воротникового пространства). Оптимальным сроком сдачи крови для двойного теста первого триместра беременности (PAPP-A и бета – ХГЧ) – 11–13 недель.
Если в результатах исследования РАРР-А выявляются отклонения, это не говорит на 100% о наличии у плода патологии, но дает веское основание для проведения более серьезных исследований на выявление аномалий развития плода, таких как дородовое изучение хромосом плода.
Показания к назначению анализа:
- Скрининговое обследование беременных женщин для оценки риска хромосомных аномалий плода в I – ом триместре и начале II – го триместра;
- Оценка угрозы самопроизвольного аборта и остановки развития беременности на малых сроках;
- Возраст беременной женщины старше 35 лет;
- Наличие в семье ребенка (или в анамнезе – плода прерванной беременности) с синдромом Дауна или другими хромосомными болезнями, врожденными пороками развития;
- Наследственное заболевание у ближайших родственников;
Когда уровень РАРР-А понижен?
При обследовании в I — ом триместре беременности:
- Повышенный риск хромосомных аномалий плода: синдром Дауна, синдром Эдвадрса, синдром Корнелии де Ланге;
- Угроза самопроизвольного аборта и самопроизвольной остановки беременности на малых сроках.
Повышенное значение диагностического значения не имеет.
Необходимо воздержаться от приема пищи в течение 2-3 часов!ВАЖНО для установления соответствующих норм указывать срок беременности (при наличии).
Антитела к Ассоциированный с беременностью белок-А плазмы (РАРР-А) в Москве
Историческая справка и описание РАРР-А
Человеческая плацента является источником большого разнообразия специфичных белков, которые в нормальной сыворотке не встречаются совсем, либо встречаются в незначительном количестве. Во время беременности они могут быть обнаружены в материнской системе кровообращения. К таким белкам относятся как гормоны (человеческий хорионический гонадотропин, человеческий плацентарный лактоген), так и другие белки плацентарного происхождения. Одним из них является ассоциированный с беременностью протеин-А (pregnancy-associated plasma protein A, PAPP-A).
В 1974 году Lin и др. выделили из ретроплацентарной сыворотки крови группу белков, получивших названия: белки, ассоциированные с беременностью А, В, C и D. PAPP-A продуцируется плацентой, и с увеличением срока беременности его секреция растет. PAPP-A детектируется только в материнской системе кровообращения [1].
В последнее время PAPP-A вызывает интерес как перспективный маркер целого ряда патологических состояний, возникающих во время беременности, таких как угроза преждевременного прекращения беременности, эктопическая беременность. Было установлено, что PAPP-A является наиболее специфичным из самых ранних биохимических маркеров трисомии по хромосоме 21 — синдрома Дауна [2]. Кроме того, данные последних лет указывают на возможность использования PAPP-A в кардиологии для диагностики таких патологических состояний как нестабильная стенокардия [3].
Строение РАРР-A
Активная форма РАРР-А, обладающая протеолитической активностью, представляет собой гомодимер массой ~ 400 кДа. В плазме крови лишь менее 1% от общего количества РАРР-А является гомодимером и проявляет активность [4]. Вся остальная, большая часть РАРР-А в кровотоке обнаруживается в виде неактивного гетеротетрамерного комплекса с предшественником главного щелочного белка эозинофилов (the proform of eosinophil major basic protein, proMBP). Комплекс состоит из двух молекул РАРР-А и двух молекул proMBP и имеет массу ~500 кДа (рис.1). При этом РАРР-А в составе комплекса не проявляет протеолитической активности [5]. Молекула PAPP-A состоит из двух субъединиц c молекулярной массой около 200 кДа каждая и секретируется в кровь клетками трофобласта в виде димера. Димеризация субъединиц PAPP-A происходит за счет образования дисульфидной связи по Cys-1130, а proMBP субъединицы — с помощью двух дисульфидных связей [6]. Между каждой РАРР-А и proMBP субъединицами также имеется по две дисульфидных связи [5].
Рис. 1. Схематическое изображение гетеротетрамерного комплекса PAPP-A/proMBP и гомодимерной формы РАРР-А.
PAPP-A и proMBP субъединицы являются сильно гликозилированными [5], и общее содержание углеводов составляет 13,4% и 38,6% от общего веса, соответственно, а в полном комплексе — 17,4%. Углеводные компоненты обоих белков сильно различаются. PAPP-A содержит углеводные компоненты, связанные с пептидом N-гликозидной связью. ProMBP содержит компоненты, связанные с пептидом как О-, так и N-гликозидными связями.
Каждая субъединица содержит 1547 аминокислотных остатков и образуется из более крупного предшественника. В аминокислотной последовательности РАРР-А выделяют несколько повторов. Во-первых, это так называемые lin-notch-повторы 1-3 (lin-notch repeats, LNR1-3), которые регулируют раннюю дифференцировку тканей, длиной 26-27 а.о., два из которых расположены недалеко от активного центра, а третий — недалеко от С-конца полипептида. Во-вторых, это короткие консенсусные повторы 1-5 (short consensus repeats, SCR1-5) длиной 57-77 а.о. каждый, следующие друг за другом в С-концевой области аминокислотной последовательности РАРР-А [5]. Активный центр включает в себя остаток Glu483 и расположенный рядом удлиненный цинк-связывающий мотив HEXXHXXGXXH (остатки 482 — 492), а также высококонсервативный остаток Met556. Активный центр лежит в щели, расположенной между двумя половинами каталитического домена [7]. Схема строения РАРР-А приведена на рисунке 2.
Рис. 2. Схема строения полипептидной цепи РАРР-А.
Находящийся в плазме крови димер РАРР-А активно связывается с поверхностью клеток. Адгезия РАРР-А осуществляется за счет нековалентного взаимодействия аминокислотных остатков, находящихся в повторах SCR-3 и SCR-4, с экпонированными на поверхности клеток гепарином и гепарансульфатом. При связывании димера РАРР-А с клеточной поверхностью фермент не теряет своей протеолитической активности [8].
В то же время комплекс РАРР-А и proMBP не обнаруживает способность к клеточной адгезии. Предполагают, что гепарансульфат молекулы proMBP конкурирует с полисахаридами поверхности клеток за связывание с участками SCR-3 и SCR-4 на молекуле РАРР-А. В результате РАРР-А, находящийся в комплексе с proMBP, не имеет свободных участков SCR-3 и −4 и не может удерживаться у поверхности клетки [8].
Клиническое использованиеУровень РАРР-А в крови в норме и при патологии
Невысокий постоянный уровень экспрессии протеиназы РАРР-А обнаруживается с использованием mRNA-гибридизационных методов во многих типах тканей (как репродуктивных, так и нерепродуктивных), в том числе в почках, в толстом кишечнике и в клетках костного мозга [4, 9], причем уровень РАРР-А в плазме крови не зависит от пола и возраста [3]. Значительное повышение уровня РАРР-А в плазме крови наблюдается у женщин во время беременности: к концу шестого месяца он достигает 50 мг/л [4].
Известно, что низкий уровень РАРР-А в плазме крови матери во время беременности связан с повышенной вероятностью обнаружения у плода синдрома Дауна [4] или рождения ребенка с маленькой массой тела [10].
В 2001 году Bayes-Genisetal. обнаружили, что в плазме крови пациентов, страдающих атеросклеротическим поражением сосудов сердца, наблюдается повышенный уровень белка РАРР-А. При этом повышение содержания РАРР-А было зафиксировано у пациентов с нестабильными атеросклеротическими бляшками и/или недавно перенесших инфаркт миокарда. В то же время у пациентов со стабильными бляшками или со стабильной стенокардией повышение уровня РАРР-А не отмечали [3].
Интересно, что обнаруживаемый при атеросклерозе РАРР-А не образует гетеротетрамерный комплекс с proMBP, а содержится в активном димерном состоянии. Возможно, это связано с тем, что клетки атеросклеротической бляшки в связи с воспалительными процессами находятся в состоянии окислительного стресса. Образование же комплекса РАРР-А/proMBP, по-видимому, зависит от окислительно-восстановительного потенциала микроокружения клеток [9].
Повышение уровня РАРР-А в плазме крови выше ~12,6 mIU/L (4,4 нг/мл) – сигнал об увеличении риска развития острого коронарного синдрома (ОКС) примерно в два раза [11]. Определение повышенного уровня РАРР-А у пациента позволяет диагностировать ОКС на той стадии, на которой возможно избежать повреждений миокарда. При этом уровни тропонина I и креатинкиназы МВ не коррелируют с уровнем РАРР-А, а уровень CRP коррелирует с РАРР-А довольно слабо. Таким образом, до недавнего времени РАРР-А представлялся как ранний и высокочувствительный маркер нестабильных атеросклеротических бляшек и ОКС [3].
Последние исследования [12-14] показывают, что РАРР-А должен использоваться в качестве маркера ОКС с большой осторожностью. Показано, что после внутривенного применения гепарина в качестве тромболитика у пациентов отмечается резкое (в 25 раз) повышение уровня димерного активного РАРР-А в плазме крови уже в первые 5 минут. Таким образом, повышение уровня РАРР-А может быть вызвано не увеличением его экспрессии в атеросклеротических бляшках, а взаимодействием введенного свободного гепарина с РАРР-А, связанного на поверхности клеток эндотелия сосудов. При этом свободный гепарин конкурирует с полисахаридами, экспонированными на клеточной поверхности, и увлекает РАРР-А в кровоток [12]. В связи с этим в последнее время ведется поиск нового, более чувствительного маркера наличия нестабильных атеросклеротических бляшек. Было предположено, что им может стать другой участник IGF/PAPP-A паракринной системы – IGFBP4 [13].
Использование PAPP-A в пренатальной диагностике хромосомных заболеваний плода
Частота рождения детей с синдромом Дауна с каждым десятилетием нарастает и в настоящее время в разных странах составляет 1:700 – 1:600 родов. Популяционная частота хромосомных аберраций у новорожденных с врожденными пороками развития возрастает до 40%. Данная патология вызывает различные аномалии развития у носителей и может быть связана с множественными врожденными пороками развития, с умственной и физической отсталостью, нарушениями полового развития, бесплодием и невынашиванием беременности. Лечение большинства таких пациентов пока малоэффективно.
В настоящее время интенсивно развиваются как инвазивные, так и неинвазивные методы пренатальной диагностики синдрома Дауна и других анеуплоидий. Последние методы предназначены, главным образом, для выявления беременных женщин, принадлежащих к группам высокого риска рождения детей с хромосомными заболеваниями и пороками развития. Наиболее часто с этой целью применяются такие биохимические маркеры, как α-фетопротеин (АФП), хорионический гонадотропин (ХГЧ) и неконъюгированный эстриол. Сканирующие программы, основанные на определении их концентраций в сыворотке крови на 16-20-й неделе беременности и учете возраста матери, позволяют обнаружить СД примерно в 60% случаев [2].
В 1995 году K. Farra и J. Grudzinskas пришли к заключению о целесообразности использования PAPP-A для ранней пренатальной диагностики синдрома Дауна и других хромосомных заболеваний плода. Предложено использовать PAPP-A как самостоятельно, так и в комбинации со свободной β-цепью ХГЧ и данными ультразвукового исследования [15]. При хромосомных аномалиях плода уровень PAPP-A снижен, по сравнению с нормально протекающей беременностью, и это различие наиболее выражено на 10-11-й неделе беременности. Поскольку этот белок имеет спектр иммунорегуляторных свойств и играет важную роль в обеспечении иммунологической толерантности плода при беременности, его дефицит следует рассматривать как одно из проявлений плацентарной недостаточности [16].
Диагностика синдрома Дауна, основанная на иммунохимическом определении PAPP-A в сочетании с другими общепринятыми методами, позволяет выявлять патологию плода с вероятностью 85% в первом триместре беременности.
Динамика изменения концентрации PAPP-A в крови при нормально развивающейся беременности
В сыворотке крови концентрация комплекса PAPP-A увеличивается в течение беременности и концу третьего триместра составляет приблизительно 45 мг/л. Динамика изменения концентрации PAPP-A на ранних этапах беременности представлена в Таблице 1.
| Срок беременности (недели) | Среднее значение концентрации PAPP-A (мг/л) | Диапазон значений |
| 8 | 1,86 | 0,89-3,15 |
| 9 | 3,07 | 1,66-6,33 |
| 10 | 5,56 | 2,98-10,1 |
| 11 | 9,86 | 5,74-15,0 |
| 12 | 14,5 | 9,90-27,5 |
| 13 | 23,4 | 14,1-34,6 |
| 14 | 29,1 | 19,5-38,4 |
У небеременных женщин небольшие количества PAPP-A обнаруживали с помощью иммунохимических методов в гранулезных клетках и в жидкости фолликулов яичников, а также в слизистых оболочках маточных труб, шейки матки и эндометрия [17]. Экспрессия PAPP-A и proMBP осуществляется также и в нерепродуктивных тканях: толстой кишке, почках, печени, поджелудочной железе, миокарде, селезенке, костном мозге, гладкомышечных клетках стенок сосудов, остеобластах, предстательной железе, молочной железе [18], [19]. Но в большинстве случаев специфичной мРНК PAPP-A содержится в сотни, а то и в тысячи раз меньше, чем в плаценте в период третьего триместра. Не вызывает сомнения то, что сывороточный пул PAPP-A имеет преимущественно плацентарное происхождение [20].
Иммунохимические системы для определения уровня PAPP-A при беременности
Возможность клинического применения PAPP-A для оценки риска синдрома Дауна плода побудила к производству иммунореагентов для специфичного определения низких концентраций PAPP-A в материнской сыворотке в первом триместре.
Для измерения уровня PAPP-A было разработано большое количество методов, таких как различные виды иммуноэлектрофореза, радиоиммунный анализ, иммунорадиометрический анализ, иммунофлуоресцентный анализ, иммуноферментные анализы.
Один из наиболее чувствительных анализов – радиоиммунный – разработал в 1982 году Sinosich. Чувствительность метода составляла 5 нг/мл (14,25 mIU/L) [21]. Однако, данный метод имеет ряд недостатков, одним из которых является короткое время полужизни используемой радиоактивной метки.
В 2002 году была создана тест-система для определения уровня PAPP-A, основанная на иммунофлуоресцентном методе (point-of-care assay). Чувствительность метода, при использовании данной системы, составляла 0,5 mIU/L (1,4 нг/мл). Процедура проведения такого анализа полностью автоматизирована и требует минимальных временных затрат – 30 минут с момента получения образца крови. Данный анализ является одним из наиболее чувствительных методов определения уровня PAPP-A, существующих на сегодняшний день [22].
Скачать описание продукта в формате pdf
Рекомбинантный dPAPP-A человека
Мышиные моноклональные антитела к белку, ассоциированному с беременностью (PAPP-A)
С-реактивный белок и цитокины при политравме | Гуманенко
1. Галкина Е. В. Взаимодействие между С-reactive protein, сывороточным амилоидом Р и интерлейкином-8 и их роль в регуляторной функции нейтрофилов: автореф. дис…. канд. мед. наук. СПб.; 1998.
2. Cunha J., Gloria C., Vilela H., Lopes V. C-reactive protein: a good parameter for sepsis diagnosis. Intens. Care Med. 1997; 23 (509): 27—34.
3. Исаков Д. В. Влияние С-реактивного белка на передачу сигналов от интерлейкина-4: автореф. дис….канд. мед. наук. СПб.; 2001.
4. Вoeken U., Feindt P.,Mohan E., Gams E. The effect of an increased preoperative CRP-value on septic complications after extracorporeal circulation. Shock 1997; 7 (Suppl.): 11.
5. Flores J., Jimenez P., Rincon D. et al. C-reactive protein as marker of infection among patients with severe closed trauma. Enferm. Infec. Microbiol. Clin. 2001; 5 (2): 61—65.
6. Fujimi S., Ogura H., Tanaka H. et al. Activated polymorphonuclear leucocytes enhance production of leukocyte microparticles with increased adhesion molecules in patients with sepsis. Trauma 2002; 52 (3): 443—448.
7. Ogura H., Kawasaki T., Tanaka H. et al. Activated platelets enhance microparticle formation and platelet-leukocyte interaction in severe trauma and sepsis. Trauma 2001; 50 (5): 801—809.
8. Sobieska M., Mikstacki A., Wiktorowicz K. Selected acute phase proteins in patients with polytrauma. Shock 1997; 7(Suppl.): 15.
9. Lasson A., Gorransson J., Jonson S. High preoperative acute phase proteins indicate an increased risk of postoperative complications. Shock 1997; 7 (Suppl.): 11.
10. Luiking Y., Steens N., Ramsay G., Deutz N. In vivo nitric oxide production is elevated both in moderate and severe inflammatory states. Shock 2004; 21 (Suppl.): 96.
11. Takala A., Jousela L., Olkkola K. et al. Levels of CD 11b expression and plasma interleukin-6 predict organ failure in sepsis. Shock 1997; 7 (Suppl.): 12.
Не объект благоустройства, а охотресурс. Как «Фонтанка» потерпела крах в поиске белок из отчета Беглова — Город — Новости Санкт-Петербурга
автор фото Наталья Гончарова / «Фонтанка.ру» / архивПоделитьсяАлександр Беглов 13 мая во время ежегодного отчета об итогах года перед Законодательным собранием в число достижений включил пополнение петербургских парков фауной — «в пруды запустили рыб, а в парки — белок». «Фонтанка» заинтересовалась вопросом, сколько пушистых, если не считать естественного прироста, прибыло в зеленые зоны города. На первый взгляд простой вопрос обернулся блужданием по комитетам и инстанциям.
По итогам двух дней поисков удалось найти только трех белок, но и их в ЦПКиО им. Кирова выпустили сотрудники центра помощи дикой природе «Велес». Хотя в целом городская популяция за год выросла более чем в 2,5 раза.
Чтобы узнать, куда и сколько белок в 2019-м году запустили в городские сады и парки, редакция обратилась в ряд профильных структур. В комитете по благоустройству, под ведомством которого зеленеют более 2 тысяч пространств, поспешили откреститься: белки — это не к ним, а к коллегам из комитета по природопользованию. «У нас только флора. Фауна не к нам», — пояснили в пресс-службе. Единственное, чего удалось добиться в ходе первого раунда, это подтверждения, что комблаг не закупал белок в 2019 году. Но комитет следит не за всеми зелеными пространствами: часть из них федеральные, часть находятся в ведении муниципалитетов или районов.
Комитет по природопользованию помог «Фонтанке» ценными знаниями. В частности, разрешил внутриредакционную дискуссию — являются ли обитающие в черте города обладатели пушистых хвостов объектами благоустройства. Выяснилось, что нет, белки в данном случае, как дикие животные, имеют статус охотресурса. К счастью, промысловая охота не осуществляется, поэтому зверьки чувствуют себя на территории города в относительной безопасности.
Комитет следит за общей численностью белок в городе. И тут чиновникам есть чем порадовать горожан. «Белки на территории Санкт-Петербурга размножаются естественным путем, по данным мониторинга, численность популяции белок увеличивается с каждым годом», — говорится в ответе на запрос «Фонтанки». Согласно данным государственного мониторинга охотничьих ресурсов и среды их обитания на территории городских лесничеств, если в 2018 году было зарегистрировано всего 199 зверьков, то в 2019 их насчитывалось уже 513, а в 2020 — более 550. Но вот просьба вычислить, сколько белок появилось в городе озвученным в отчете губернатора путем, поставила чиновников в тупик.
Если спросить горожан, куда можно отправиться покормить белок, самым распространенным ответом, скорее всего, будет ЦПКиО им. Кирова. На Елагином острове распространены белка обыкновенная, среднерусская и алтайская. Но с ростом популяции в этом парке и так нет проблем. Несколько лет назад, указано на сайте парка, животных закупили, с тех пор условия проживания и забота способствуют росту численности грызунов.
В ЦПКиО пояснили, что самостоятельно точно не закупали и не выпускали белок — уже живущие на территории острова зверьки чувствуют себя вольготно. Сейчас в условиях коронавируса, когда посетителей в парке нет, о животных заботятся сотрудники парка.
Все же трех «выпущенных» зверьков удалось идентифицировать благодаря все тому же комитету по природопользованию. В 2019 году бельчат спас из дикой природы и вырастил центр реабилитации диких животных «Велес». Когда животные подросли и окрепли, их выпустили на Елагин остров.
В поиске ответственных за выпуск белок «Фонтанка» обратилась в городское управление ветеринарии. И снова мимо: там рассказали, что ведомство отвечает за домашних животных, а белки — дикие. Кроме того, был направлен запрос и в управление Росприроднадзора. Надзорное ведомство пояснило, что осуществляет надзор за редкими и находящимися под угрозой исчезновения видами, занесёнными в Красную книгу, статистику по белкам не ведут.
Открытые источники не помогли прояснить ситуацию. Зато стало понятно, что губернатор Петербурга уже не впервые рассказывает о запуске хвостатых в парки. В октябре 2019 года на совещании с на тот момент строительным вице-премьером Виталием Мутко Беглов похвастался — в городе до конца года полностью реконструируют 144 парка и сквера. И отдельно подчеркнул, что создаются благоприятные условия не только для людей, но и о животных не забывают: «Мы выпускаем белок, рыб, подкармливаем уток, создаем укрытия для них». Как раз за несколько дней до совещания губернатор принял участие в установке кормушек для белок в колпинском парке Чухонка.
В августе того же года градоначальник, тогда еще врио, распорядился не распугать живущих в парке академика Сахарова белок во время работ по благоустройству и соорудить для животных кормушки.
В сентябре поспособствовать росту популяции петербургских белок Александра Беглова попросил депутат Госдумы Виталий Милонов. Как пояснял тогда парламентарий: городу не мешает встать «в авангард науки «белкотерапия».
В разговоре с корреспондентом «Фонтанки» член нижней палаты парламента РФ был рад, что его инициатива была всецело поддержана. «Наш губернатор очень любит животных и всецело помогает и содействует увеличению популяции этих маленьких пушистых зверьков в наших парках и садах. Потому что наш губернатор — самый лучший», — сказал он и добавил, что «маленькие зверьки в наших парках — это радость для детей».
Казалось, поиск зашел в тупик. С просьбой раскрыть количество запущенных в парки в прошлом году белок «Фонтанка» обратилась напрямую в пресс-службу губернатора. Там пояснили, что за этой информацией стоит пойти непосредственно в районы (что «Фонтанка» и сделала). Но позднее нас перенаправили все в тот же комитет по благоустройству.
Пресс-служба комблага оперативно отписалась: «Информация по белкам обязательно будет завтра». То есть 15 мая. Но «Фонтанку» постигло разочарование. На уточняющий вопрос: «Ну когда же?» — пресс-служба привычно уже перевела стрелки на комитет по природопользованию, который должен «скоро все прислать». Но у последнего таких данных нет, на что в ответственном за благоустройство комитете развели руками: «Возможно, у вас слишком завышенные требования».
Тем временем поднакопились ответы наиболее оперативных представителей районных администраций. Василеостровский район сообщил, что в 2019 году на территории парков и скверов, расположенных в границах района, белок не выпускали.
Пресс-служба администрации Кронштадтского района также оперативно связалась с редакцией и сообщила — белок на острове Котлин нет вообще. Нет их, к сожалению, и на территории Красногвардейского района. В Пушкинском районе белки обитают только в федеральных Екатерининском, Александровском и Павловском парках. И райадминистрация, уточнил ее представитель, точно не принимала участие в запуске животных в прошлом году.
На территории Кировского района лишь один крупный парк, где есть белки, — парк Александрино (находится в ведении комитета по благоустройству Санкт-Петербурга). У района нет сведений об организованном запуске туда белок, возможно, информацией располагает комитет. Пушистиков в парки и скверы Петродворцового района не выпускали, сообщили в райадминистрации, пояснив — «их у нас и так много»
Представитель администрации Фрунзенского района пояснил — у них белки пока не живут. Потенциальные места обитания пушистых еще слишком молоды, и деревья не доросли до пригодности для проживания зверьков. Калининский тоже оказался не тем районом, где появились зверьки: «У нас белок в парки не запускали. Для этого в районе подходит только Пискаревский лесопарк, но там готовимся к реконструкции, не до белок».
В Центральном районе рассказали, что, по последним данным, в 2019 году в сады и парки на их территории белок не выпускали.
Московский район уточнил, что вся «зелень» в ведении комблага, и отправил узнавать про белок к ним. Впечатлил уровень информированности пресс-службы Выборгского района, который ответил кратко: все вопросы в КБ (комитет по благоустройству. — Прим. ред.). На уточнение, значит ли это, что представитель не обладает нужной информацией, сообщили: «Пока то, что написала».
«Фонтанка» с нетерпением ждет ответов оставшихся районов. Поиск выпущенных белок продолжается.
Ирина Корбат,
«Фонтанка.ру»
ИИ Google разобрался в проблеме синтеза белков: болезни отступят
Компания DeepMind, принадлежащая компании Alphabet (Google), сообщила о существенном прорыве в предсказании фолдинга (сворачивания) белков. Белки собираются из линейных последовательностей аминокислот, которые после синтеза принимают уникальную пространственную форму и таких форм неисчислимое множество. Это задача не для экспериментатора, а для ИИ, с чем платформа DeepMind справилась на ура. Открытие ведёт к новым лекарствам и многому другому.
Из сотен миллионов белков (комбинаций аминокислот) изучено только 0,1 % соединений, чья пространственная форма также хорошо известна. Неизвестные белки, а также соединения, которые ещё не были подтверждены экспериментальным путём, учёные пытаются предсказать с помощью компьютеров. Но до сих пор никто не мог с достаточной степенью точности вычислить, какую 3D-форму примет белок из заданных набора и последовательностей аминокислот.
Для определения эффективности алгоритмов (ИИ) в деле предсказания сворачивания белка раз в два года проводится конкурс CASP (Critical Asessement of techniques for protein Structure Prediction). Алгоритмы «сворачивают» неизвестные белки, структуру которых изучают позже и сравнивают с результатами предсказания. В конкурсе этого года, сообщает DeepMind, алгоритм AlphaFold предсказал пространственную структуру белка со средней оценкой 92,4 балла по метрике Global Distance Test (GDT). Отметим, 90 баллов GDT считаются достоверным результатом для экспериментального подтверждения. Это означает, что алгоритм справился с работой лучше экспериментаторов, не говоря о значительно меньше потраченном времени на предсказание.
Проблема предсказания сворачивания белка считается одной из 125 важнейших для решения задач современности, а также одной из величайших проблем биологии за последние 50 лет. Если алгоритм DeepMind настолько хорош в этом, как заявляет компания, то нас может ждать прорыв в открытии новых лекарств, вакцин и в понимании возникновения и течения многих болезней.
Если вы заметили ошибку — выделите ее мышью и нажмите CTRL+ENTER.
СЕРДЕЧНЫЙ БЕЛОК, СВЯЗЫВАЮЩИЙ ЖИРНЫЕ КИСЛОТЫ, ПРИ ОСТРОМ КОРОНАРНОМ СИНДРОМЕ | Каштанова
1. Gafarov V.V., Blaginina M.Yu. Mortality from acute myocardial infarction. (Epidemiological study on the basis of WHO programs “Register of Acute Myocardial Infarction”, MONICA). Cardiology, 2005; 5: 49–51. Russian (Гафаров В.В., Благинина М.Ю. Смертность от острого инфаркта миокарда. (Эпидемиологическое исследование на основе программ ВОЗ «Регистр острого инфаркта миокарда», МОНИКА). Кардиология, 2005; 5: 49–51).
2. Oschepkova E.V. Mortality from cardiovascular diseases in the Russian Federation in 2001–2006 and ways to reduce it. Cardiology, 2009; 2: 67–72. Russian (Ощепкова Е.В. Смертность населения от сердечно-сосудистых заболеваний в Российской Федерации в 2001–2006 гг. и пути по ее снижению. Кардиология, 2009; 2: 67–72).
3. McCann C.J., Glover B.M., Menown I.B. et al. Novel biomarkers in early diagnosis of acute myocardial infarction compared with cardiac troponin T. Eur. Heart J., 2008; 29 (23): 2827–2828.
4. Morrow D. A., Cannon C. P., Jesse R. L. et al. National Academy of Clinical Biochemistry. National Academy of Clinical Biochemistry Laboratory Medicine Practice Guidelines: Clinical Characteristics and Utilization of Biochemical Markers in Acute Coronary Syndromes. Circulation, 2007; 115: 356–375.
5. Orak M., Ustundag M., Guloglu C. et al. The role of the heart-type fatty acid binding protein in the early diagnosis of acute coronary syndrome and its comparison with troponin I and creatine kinase-MB isoform. Am.J. Emerg. Med., 2010; 28 (8): 891–896.
6. Erlikh A.D., Katrukha A.G., Trifonov I.F. et al. Acute coronary syndrome without ST segment elevation on ECG. Prognostic value of determination of cardiac form of the fatty acid binding protein. The results of the 12-month follow-up. Cardiology, 2005; 5: 13–21. Russian (Эрлих А.Д., Катруха А.Г., Трифонов И.Ф. и др. Острый коронарный синдром без подъемов сегмента ST на ЭКГ. Прогностическое значение определения сердечной формы белка, связывающего жирные кислоты. Результаты 12-месячного наблюдения. Кардиология, 2005; 5: 13–21).
7. Storch J., McDermott L. Structural and functional analysis of fatty acid-binding proteins. J. Lipid Res., 2009; 50: 126–131.
8. Andryukov B. G., Gelman E. A., Gabasova T. V. et al. Blood level of fatty acid binding protein in the first hours after acute myocardial ischemia after a successful thrombolysis: prediction and riskometriya complications. Basic Research, 2008; 2: 15–17. Russian (Андрюков Б. Г., Гельман Е. А., Габасова Т.В и др. Уровень в крови белка, связывающего жирные кислоты, в первые часы после острой ишемии миокарда после проведения успешного тромболизиса: прогноз и рискометрия осложнений. Фундаментальные исследования, 2008; 2: 15–17).
9. Bruins Slot M.H., Reitsma J.B., Rutten F.H. et al. Heart-type fatty acid-binding protein in the early diagnosis of acute myocardial infarction: a systematic review and metaanalysis. Heart, 2010; 96 (24): 1957–1963.
10. Glatz J.F.C., Van der Voort D., Hermens W.T. Fatty Acid-binding protein as the Earliest Available Plasma Marker of Acute Myocardial Injury. J. Clinical Ligand Assay, 2002; 25: 167–177.
11. Gururajan P., Gurumurthy P., Nayar P. et al. Heart fatty acid binding protein (H-FABP) as a diagnostic biomarker in patients with acute coronary syndrome. Heart Lung Circ., 2010; 19 (11): 660–664.
12. Zyryanova A. V., Yarokhno N. N., Nikolaev K.Yu. Efficiency of immunochromatographic method for cardiac fatty acid binding protein determination in the early differential diagnostic of acute coronary syndrome. Blood circulation pathology and cardial surgery, 2010; 4: 12–16. Russian (Зырянова А. В., Ярохно Н. Н., Николаев К.Ю. Эффективность иммунохроматографического метода определения сердечного белка, связывающего жирные кислоты, при ранней дифференциальной диагностике острого коронарного синдрома. Патология кровообращения и кардиохирургия, 2010; 4: 12–16).
Эозинофильный катионный белок как неинвазивный маркер характера воспалительного ответа у больных хронической обструктивной болезнью легких | Карнаушкина
1. Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease (GOLD). Global strategy for the diagnosis, management and prevention of COPD. 2018. Report. URL: http://www.goldcopd.
2. Barnes P.J. Inflammatory mechanisms in patients with chronic obstructive pulmonary disease. J. Allergy Clin. Immunol. 2016; 138 (1): 16–27. DOI:10.1016/j.jaci.2016.05.011.
3. Barnes P.J. Cellular and molecular mechanisms of chronic obstructive pulmonary disease. Clin. Chest. Med. 2014; 35 (1): 71–86. DOI: 10.1016/j.ccm.2013.10.004.
4. Jahnz-Rozyk K., Plusa T., Mierzejewska J. Eotaxin in serum of patients with asthma or chronic obstructive pulmonary disease: relationship with eosinophil cationic protein and lung function. Mediators of Inflammation. 2000; 9 (3–4): 175–179. DOI: 10.1080/09629350020008691.
5. Saetta M., Di Stefano A., Maestrelli P., Turato G., Ruggieri M.P., Roggeri A., Calcagni P., Mapp C.E., Ciaccia A., Fabbri L.M. Airway eosinophilia in chronic bronchitis during exacerbations. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1994; 150 (6): 1646–1652. DOI: 10.1164/ajrccm.150.6.7952628.
6. Paone G., Leone V., Conti V., Marchis L., Ialleni E., Graziani C., Salducci M., Ramaccia M., Munafò G. Blood and sputum biomarkers in COPD and asthma: a review. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 2016; 20 (4): 698–708.
7. Singh D., Kolsum U., Brightling C.E., Locantore N., Agusti A., Tal-Singer R. Eosinophilic inflammation in COPD: prevalence and clinical characteristics. Eur. Respir. J. 2014; 44 (6): 1697–1700. DOI: 10.1183/09031936.00162414
8. Leigh R., Pizzichini M.M., Morris M.M., Maltais F., Hargreave F.E., Pizzichini E. Stable COPD: predicting benefit from high-dose inhaled corticosteroid treatment. Eur. Respir. J. 2006; 27 (5): 964–971. DOI: 10.1183/09031936.06.00072105.
9. Bafadhel M., McKenna S., Terry S., Mistry V., Venge M.P.P., Lomas D.A., Barer M.R., Johnston S.L., Pavord I.D., Brightling C.E. Blood eosinophils to direct corticosteroid treatment of exacerbations of chronic obstructive pulmonary disease: a randomized placebo-controlled trial. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2012; 186 (1): 48–55. DOI: 10.1164/rccm.201108-1553oc.
10. Pellegrino R., Viegi G., Brusasco V. et al. Interpretative strategies for lung function tests. Eur. Respir. J. 2005; 26 (5): 948–968. DOI: 10.1183/18106838.0201.9.
11. Schleich F., Corhay J.L., Louis R. Blood eosinophil count to predict bronchial eosinophilic inflammation in COPD. Eur. Respir. J. 2016; 47 (5): 1562–1564. DOI: 10.1183/13993003.01659-2015.
12. Papi A., Luppi F., Franco F., Fabbri L.M. Pathophysiology of exacerbations of chronic obstructive pulmonary disease. Proc. Am. Thorac. Soc. 2006; 3 (3): 245–251. DOI: 10.1513/pats.200512-125sf.
13. Bafadhel M., McKenna S., Terry S. et al. Acute exacerbations of COPD: identification of biological clusters and their biomarkers. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2011; 184 (6): 662–671. DOI: 10.1164/rccm.201104-0597oc/
14. Rutgers S.R., Timens W., Kaufmann H.F., van der Mark T.W., Koëter G.H., Postma D.S. Comparison of induced sputum with bronchial wash, bronchoalveolar lavage and bronchial biopsies in COPD. Eur. Respir. J. 2000; 15 (1): 109–115. DOI: 10.1183/09031936.00.15110900.
15. Hastie A.T., Martinez F.J., Curtis J.L. et al. Association of sputum and blood eosinophil concentrations with clinical measures of COPD severity: an analysis of the SPIROMICS cohort. Lancet Respir. Med. 2017; 5 (12): 956–967. DOI: 10.1016/s2213-2600(17)30432-0.
16. Siva R., Green R.H., Brightling C.E., Shelley M., Hargadon B., McKenna S., Monteiro W., Berry M., Parker D., Wardlaw A.J., Pavord I.D. Eosinophilic airway inflammation and exacerbations of COPD: a randomised controlled trial. Eur. Respir. J. 2007; 29 (5): 906–913. DOI:10.1183/09031936.00146306.
Protein A — обзор
1 Выщелачиваемые продукты с помощью аффинной хроматографии
Белок А хроматография — это наиболее часто используемая аффинная хроматография для очистки терапевтических mAb и Fc-содержащих гибридных белков. 140 Это один из наиболее эффективных и дорогостоящих методов хроматографической очистки в процессе производства биопрепаратов. 141,142 Несмотря на высокую стоимость, скорость и эффективность хроматографии на протеине А в удалении примесей (обычно> 95%) поистине замечательны.В сочетании с другими подходящими хроматографическими режимами лекарственные вещества, очищенные хроматографией на протеине А, часто достигают фармацевтически приемлемых уровней чистоты. 143 Действительно, универсальность и эффективность хроматографии на протеине А, улавливающей продукт из бульона клеточного дебриса и культуральных добавок, делают его методом очистки, который предпочитают в промышленности. 144
Белок A, компонент клеточной стенки Staphylococcus aureus (рекомбинантные формы или нативные), специфически и плотно связывается с Fc-областью mAb и часто ковалентно иммобилизуется в качестве лиганда на различных поддерживающих матрицах (сефароза или другие эквивалентные небелковые матрицы сорбентов). 145,146 Белок А-лиганд, несмотря на его ковалентную иммобилизацию и стабильность в условиях низкого pH, чувствителен к протеолизу из-за неспецифической деградации протеаз (из клеточной культуры) и отщепления матрикса в результате низкоуровневого кислотного гидролиза (от воздействия высвобождения с низким pH захваченного Fc-содержащего биологического вещества или высокий pH во время процедуры очистки на месте) или хаотропы. 147 Высвободившиеся фрагменты протеина А рассматриваются как примеси, связанные с технологическим процессом, и их необходимо удалить.
Влияние на здоровье протеина А как примеси и потенциальных иммунокомплексов, возникающих в результате индуцированной протеином А агрегации IgG у людей, полностью не изучено или хорошо документировано, хотя в прошлых отчетах указывалось, что протеин А может иметь иммуногенные 148 и митогенные эффекты. 149 Текущие руководящие принципы FDA (Пункты, которые следует учитывать при производстве и тестировании продуктов моноклональных антител для использования человеком, 1997) требуют, чтобы мониторинг лекарственной субстанции mAb проводился с использованием высокочувствительного аналитического метода для обеспечения безопасного уровня загрязнения рекомбинантного белка A.Кроме того, необходимы эффективные методы для демонстрации удаления протеина А во время разработки процесса. Метод тестирования должен быть прямым, высокочувствительным, относительно быстрым и надежным.
Белок А, в силу его меньшего размера и заряда, может быть обнаружен обычным электрофоретическим или гидродинамическим разделением. Однако методы обнаружения часто нечувствительны к очень низким уровням примеси протеина А. Действительно, фрагмент (ы) протеина A или целая молекула могут быть скрыты от разделения и последующего обнаружения за счет его специфического взаимодействия с Fc (или вариабельной областью). 150,151 Наиболее часто используемый метод измерения протеина А — это обычный иммуноферментный анализ, такой как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), при котором с надежной точностью можно определить менее 1 ppm (1 нг / мг белкового продукта). 152 Метод обнаружения может быть колориметрическим или флуороспектрометрическим. Для обеспечения точности метод должен включать этап подготовки образца, на котором белок А отделяется от продукта. Для достижения этого разделения тестируемое изделие подвергают инкубации при низком pH (обычно pH <4) с детергентами или без них или с термообработкой для удаления IgG.По большей части, присутствие SDS низкого уровня оказывается достаточным для отделения белка A от Fc-содержащего продукта. 153 Еще одним соображением является источник лиганда протеина А и его множество фрагментов в качестве надежного контроля, и антитело способно с хорошей специфичностью распознавать спектр выщелоченных фрагментов протеина А. Как правило, поликлональные антитела (IgY) к куриному антибелку часто используют в ELISA, 154 , где куриные антитела иммобилизованы в лунках планшетов для микротитрования. 155,156 Незараженный куриный IgY из сыворотки не связывается неспецифически с белком A. Контрольный рекомбинантный белок A используется для построения стандартной кривой анализа, а тестируемые образцы, содержащие выщелоченный белок A, предварительно инкубируют в буфере с низким pH для отделения остаточного / выщелоченного белка A, который может быть связан с продуктом, содержащим Fc. После инкубации при низком pH образцы затем помещают на микротитровальный планшет ELISA, покрытый антителом к белку А. Затем белок А обнаруживается путем последующего добавления биотинилированного куриного антибелкового антитела А и может быть обнаружен конъюгированным авидином с пероксидазой хрена или флуоресцентными метками с последующим подходящим режимом обнаружения.Сообщалось о высокочувствительных методах для обнаружения следовых уровней (уровень ниже нг / мл) протеина А в лекарственном веществе, и методы часто оптимизируются в соответствии с потребностями производимого Fc-содержащего гликопротеина. 152
Что такое белок А?
Protein A — это белок клеточной поверхности размером 42 кДа, который обнаружен на клеточных стенках 90% штаммов бактерий Staphylococcus aureus . Он кодируется полиморфной X-областью гена SpA и функционирует как иммуноглобулин-связывающий белок, который, как правило, способен связываться с «Fc-областью» IgG (иммуноглобулин G).Этот белок является неотъемлемой частью эволюции Staphylococcus aureus , поскольку он может упростить передачу бактерий и позволяет им овладеть хозяином за более короткий промежуток времени.
Чашка Петри с бактериями Staphylococcus Aureus, Moraxella Catarrhalis. Кредит изображения: Моника Вишневска / Shutterstock
Что делает белок А?
Основная функция протеина А в клеточной стенке бактерий S. aureus связана с иммунной системой хозяина.Это детерминанта вирулентности (молекула, которая определяет, насколько легко патоген может вызвать заболевание у хозяина) и играет роль в подавлении ответов В-клеток хозяина, что, таким образом, помогает предотвратить повреждение бактерий иммунным ответом хозяина.
Белок А также связывается с «областью Fc» IgG, а также с «областями Fab» В-клеток, запуская процессы, которые в конечном итоге блокируют опсонофагоцитоз и убивают В-клетки, с которыми он контактирует.
Эксперимент, проведенный в 2015 году, показал, что морские свинки, намеренно зараженные вирусом S.aureus , бактериальный штамм SpAKKAA, показал повышенный уровень анти-S. aureus иммунный ответ. Иммунизация штаммом SpAKKAA может использоваться для индукции выработки нейтрализующих антител, что позволяет морским свинкам развить достаточный защитный иммунитет.
Что такое протеин А и почему он так важен? — Ханс Вуист Играть
Как протеин А влияет на человека?
S. aureus — грамположительная бактерия, имеющая форму кокков, что означает, что она имеет фиолетовый цвет с «окраской по Граму», и эти бактерии видны как скопления маленьких сферических клеток. S. aureus является частью микробиома человека и в основном обнаруживается на поверхности кожи и всех слизистых оболочках (например, глаз, рта и ушей). Это условно-патогенные бактерии, а это означает, что если происходит разрыв кожи или если хозяин каким-либо образом становится иммунодефицитным, S. aureus может в конечном итоге вызвать инфекцию.
Когда S. aureus действительно заражает человека-хозяина, это может привести к множеству различных заболеваний, но очень часто он вызывает рецидивирующие инфекции мягких тканей и кожи.Эти инфекции стали более распространенными в последние годы, в основном как нозокомиальные формы, поскольку метициллин-резистентные штаммы S. aureus (MRSA) появились в больницах по всему западному миру.
У людей протеин A (как только он попадает во внеклеточную среду) может связываться с фрагментом Fc иммуноглобулина G (IgG) и, как было обнаружено, обладает антифагоцитарным действием in vitro, что согласуется с его способностями связывания IgG , поскольку связывание с IgG может препятствовать прикреплению бактерий антителом.Это означает, что он может предотвратить саморазрушение некоторыми элементами иммунной системы человека (что также наблюдалось в эксперименте с морской свинкой в 2013 году). S. aureus Инфекции, такие как эндокардит, обычно лечат сильным курсом антибиотиков.
Таким образом, протеинA может функционировать немного по-разному у разных видов, но всегда преследует одну и ту же цель: он вмешивается в B-клетки хозяина в их иммунной системе, предотвращая появление S.aureus от фагоцитоза и уничтожения. Это идеальная адаптация в сочетании с известной склонностью S . aureus легче передается, чем другие коагулаза-положительные бактерии, это указывает на более быструю и более широкую бактериальную передачу.
Распространенность мутантов белка A Staphylococcus aureus (spa) в сообществе и больницах в Оксфордшире | BMC Microbiology
Идентификация перестроек в гене
spaВ рамках двух крупных продольных исследований S.aureus в сообществе (3905 изолятов) [25] и в больнице (2205 изолятов) [26] несколько нетипируемых штаммов S. aureus были идентифицированы с использованием стандартных праймеров spa (1095 F / 1517R) [14] . Изоляты из обоих исследований были spa -типированы с использованием поэтапного протокола, разработанного для устранения колонизации одним или несколькими штаммами [27]. Согласно протоколу spa -последовательности были классифицированы следующим образом: (i) чистые следы последовательности были интерпретированы как колонизация одного штамма, (ii) следы смешанных последовательностей, характеризующиеся отдельными двойными пиками, были интерпретированы как предполагаемая колонизация нескольких штаммов и (iii) нечитаемые следы последовательности представляют собой неудачные образцы, которые были перепечатаны.Образцы со смешанными следами последовательностей были дополнительно разделены путем выделения 12 отдельных колоний; если типирование отдельных колоний не удавалось, штаммы считались нетипируемыми со стандартными праймерами.
Следы последовательностей нетипируемых образцов показали либо полное отсутствие амплификации, либо смешанные следы последовательностей как из билатов ДНК смешанного глицеринового исходного материала, так и из 12 отдельных колоний. Как было показано ранее [14], нетипируемость штаммов S. aureus может быть объяснена делециями в гене spa , что объясняет отсутствие амплификации в некоторых из наших образцов.Однако наличие следов смешанных последовательностей, которые не могли быть разрешены путем типирования отдельных колоний, указывало на присутствие других типов перегруппировок гена spa и .
Чтобы определить природу перегруппировок во всех наших нетипируемых штаммах, мы разработали новый прямой праймер spaT3-F и объединили его с обратным праймером 1517R, используемым для рутинного типирования spa [29]. Праймер spaT3-F имеет сайт связывания в каждом из пяти IgG-связывающих доменов гена spa перед повторяющейся областью Xr (рис. 1) и дает до пяти ступенчатых продуктов ПЦР на образец, в зависимости от типа. перестроек в области связывания IgG (рис. 2).Благодаря многосайтовому связыванию с геном spa , праймер spaT3-F можно использовать для типирования образцов с делециями до четырех IgG-доменов гена spa , а также для обнаружения и типирования образцов со смесями Штаммы S. aureus с делециями и без них.
Рисунок 2Амплификация локуса spa с новыми праймерами spaT3-F / 1517R из образцов с перегруппировкой в spa -гене. Контрольный образец не имеет никаких перегруппировок в гене spa и показывает пять полос ПЦР в соответствии с пятью сайтами отжига праймера spaT3-F, включая слабую полосу в районе 500 п.н. DelH показывает одну толстую полосу, которая, скорее всего, состоит из двух объединенных полос двух участков отжига spaT3-F, которые были сближены в результате делеции. InsC2 имеет яркую полосу (600 п.н.), скорее всего, состоящую из двух продуктов ПЦР из-за вставки дополнительного сайта отжига spaT3-F.Остальные образцы отображают количество полос в соответствии с типами перегруппировок (рисунок 3). Амплификация этих образцов стандартными праймерами spa 1095 F / 1517R не даст полос для образцов с delE и delG, которые влияют на положение стандартного праймера 1095 F. Для остальной части образца ПЦР будет генерировать одну полосу (двойную полосу для insC2), расположенную в переменной позиции на лестнице, в зависимости от количества повторов в области Xr каждого образца.
С новым набором праймеров spaT3-F / 1517R мы смогли типировать 100% образцов, которые не могли быть типированы spa , с использованием стандартного текущего набора праймеров (обозначенных как «ранее не типовые»).
Всего мы обнаружили восемь полностью новых делеций / вставок в области связывания IgG гена spa плюс одну делецию, о которой сообщалось ранее [14], в 6110 сообществе и в стационарных штаммах S. aureus из Оксфордшир (рис. 3). Мы никогда не наблюдали делецию всей или части повторяющейся области Xr в S.aureus , в отличие от Баума и др., который описал частичные или полные делеции области Xr в трех изолятах бактериемии [14]: наше большое исследование показывает, что это происходит крайне редко при носительстве. Одно из объяснений различия может заключаться в том, что Baum et al. считались болезнетворными изолятами, в то время как большинство изолятов в нашем сообществе и больницах были носителями.
Рисунок 3Схема перегруппировок, идентифицированных в IgG-связывающих доменах гена spa в образцах из Оксфордшира. Примечания: Вставки обозначены серыми прямоугольниками. Удаления обозначены тонкими пунктирными линиями. Черные стрелки указывают участки отжига для нового праймера spaT3-F; серые стрелки указывают место отжига для стандартной грунтовки 1095 F; белая стрелка указывает место отжига для стандартного праймера 1517R. Серые прямоугольники со стрелками указывают на вставки с дополнительными сайтами связывания для праймеров. Панель (a) указывает делеции, обнаруженные только в образцах сообщества, панель (b) указывает делеции, обнаруженные только в образцах стационарных пациентов, а панель (c) указывает делеции, обнаруженные как в образцах сообщества, так и в стационарных условиях. Spa ген: s — сигнальная последовательность, последовательности E, D, A, B, C, кодирующие IgG-связывающие домены, X — область, которая лишена IgG-связывающей активности и состоит из повторяющейся области (Xr) и C-концевой области (Xc). ). Звездочка указывает на делецию, ранее описанную Baum et al., 2009. Кинжал указывает на делеции / вставки, приводящие к тому, что штаммы считаются нетипируемыми с использованием стандартных праймеров.
Как и ожидалось, нетипируемые образцы, которые не амплифицировались со стандартным набором праймеров, имели делеции одного из двух типов, влияющих на сайт связывания для исходного прямого праймера.Делеция E (174 п.н.) была ранее описана Baum с соавт. в клиническом штамме S. aureus [14]. Делеция G (63 п.н.) — это новая делеция, всегда связанная с вставкой B (63 п.н.) (рис. 3). Нетипируемые образцы со стойкими следами смешанных последовательностей выявили наличие вставки C2 (174 п.н.) (рис. 3). Эта вставка содержит дополнительные сайты связывания для spaT3-F и исходного праймера spa -forward, что дает два продукта ПЦР и отдельные двойные пики в следах последовательности при секвенировании с использованием исходного праймера spa -forward.Секвенирование с обратным праймером (1517R) давало чистые следы последовательности без двойных пиков.
Неожиданно, в некоторых образцах, которые не амплифицировались со стандартным набором праймеров, мы обнаружили перестройки, представленные делецией A (357 п.н.) и делецией D / вставкой A (174 п.н. / 10 п.н.), которые не влияют на положение стандартного прямого праймера. грунтовка. Чтобы исследовать наличие делеций, которые не влияют на типирование spa и, следовательно, могут оставаться незамеченными, мы секвенировали весь ген spa из 32 изолятов местного носительства и 67 изолятов бактериемии, выбранных случайным образом из ранее использованной коллекции spa . .Мы обнаружили четыре новые делеции: делеция D (174 п.н.) как в бактериемических, так и в общественных штаммах, делеция L (183 п.н.) только в общественных штаммах, делеция H (705 п.н.) и делеция I / вставка C1 (531 п.н. / 174 п.н.) только в изолятах бактериемии (рис. 3). Наибольшие делеции трех-четырех IgG-связывающих доменов были обнаружены только у штаммов бактериемии S. aureus .
Таким образом, наличие различных типов делеций и вставок в гене spa , идентифицированном с помощью праймеров spaT3-F / 1517R, демонстрирует, что S.aureus колонизация / инфицирование очень сложна. У людей может быть один штамм без перегруппировок, с делециями, которые не влияют на тип spa , или с перегруппировками, которые действительно влияют на тип spa . Альтернативно, они могут нести несколько штаммов без делеций в любом штамме, со «скрытыми» делециями, которые не влияют на типирование spa в одном или нескольких штаммах, или с перестройками, которые действительно влияют на типирование spa в одном или нескольких штаммах.
Распространенность
spa -генных перестроек в общественных и больничных штаммахSpa — тип 3905 община S.aureus и 2205 больничных изолятов с использованием протокола поэтапного типирования spa показали, что 1,8% (n = 72) образцов от 1,8% местных носителей и 0,6% (n = 14) образцов от 0,7% стационарных пациентов ранее не использовались. типизируемый (таблица 1). Значительно больше штаммов от отдельных лиц в сообществе ранее не были типируемыми по сравнению с стационарными пациентами в больницах (p <0,0001), а также наблюдалась тенденция к увеличению числа лиц, несущих ранее нетипируемые штаммы в сообществе, чем в больницах (p = 0.053). Одно из объяснений может заключаться в том, что на одного человека в сообществе было собрано больше лонгитюдных образцов по сравнению с стационарным исследованием (максимум 20 против 4 образцов соответственно), что дает больше возможностей встретить нетипируемые штаммы у людей в исследовании сообщества.
Таблица 1 S. aureus изолятов с различными типами перегруппировки и без них в спа -ген в образцах, взятых у населения и в стационаре: ранее нетипируемые изолятыДоля S.aureus со «скрытыми» делециями в области IgG-binging гена spa , которые не влияют на типирование spa , оценивали с использованием праймеров spaT3-F / 1517R на случайном подмножестве ранее типизированных образцов. Эти скрытые делеции spa -гена были обнаружены в 11% (6-19%) из штаммов S. aureus у 11% (6-19%) индивидуумов (Таблица 2).
Таблица 2 S. aureus изолятов с различными типами перегруппировки и без них в спа -ген в образцах сообщества и стационара: изоляты со скрытыми делециямиТаким образом, до 13% от S.В какой-то момент носители aureus могут быть колонизированы штаммом, который имеет делеции / вставки в области связывания IgG гена spa , 2% из которых несут полностью «нетипируемые» штаммы.
Spa -генные перестройки приводят к недооценке колонизации S. aureus у людейПоэтапный протокол spa -типирования позволил нам обнаружить одновременное присутствие двух или более штаммов в 11% из S. aureus перевозчики.Однако наличие делеций, влияющих на типирование spa в одном или нескольких штаммах в составе смеси, усложняет процесс типирования и приводит к недооценке распространенности множественной колонизации и количества вовлеченных штаммов.
Проблема проиллюстрирована на девяти образцах, полученных в течение 14 месяцев у одного местного носителя AE (Таблица 3). Spa -тип со стандартными наборами праймеров (1095 F / 1517R) продемонстрировал, что AE когда-либо несла только один штамм, который был типом t230 в большинстве временных точек, spa -type t008 в одном случае и один нетипируемый штамм. .Повторное типирование тех же экстрактов ДНК с помощью наших альтернативных новых праймеров (spaT3-F / 1517R) показало, что все образцы имели следы смешанных последовательностей, за исключением ранее нетипируемого штамма, у которого была делеция E, связанная с spa -типа t012. Таким образом, для каждого образца было выделено 12 одиночных колоний и повторно типизировано с альтернативными праймерами. Это идентифицировало пять spa -типов, переносимых AE в различные моменты времени, и колонизацию смешанного штамма двумя-тремя spa -типами в четырех случаях, включая два штамма с делецией E.Мы не смогли разделить все образцы, набрав 12 отдельных колоний, даже если они показали наличие следов смешанной последовательности (временные точки 4, 10, 12 и 14), что можно объяснить низкой частотой одного из колонизирующих штаммов.
Таблица 3 Спа — тип S. aureus штаммов из одного индивидуального AE с двумя наборами праймеров: стандартные праймеры 1095 F / 1517R и новые праймеры spaT3-F / 1517RОграничения обычного протокола набора spa делают невозможным идентификацию и тип S.aureus с перестройками в гене spa у лиц с множественной колонизацией штаммов. Поэтапный протокол spa -typing позволяет нам разрешить случаи колонизации смешанных штаммов с делециями в одном или нескольких штаммах. Даже 12 выбранных одиночных колоний не всегда могли идентифицировать присутствие низкочастотных штаммов с делециями, что иллюстрирует еще большую проблему оценки доли нетипируемых штаммов в смешанной колонизации. Таким образом, разнообразие колонизирующих и заражающих штаммов неизбежно недооценивается.
Штаммы стационарных пациентов могут приобретать делеции в гене
spaМы также обнаружили, что штаммы S. aureus могут приобретать делеции в гене spa во время госпитализации пациентов. Такое приобретение делеций никогда не наблюдалось для штаммов с продольным носительством от людей в сообществе, причем эти делеции наблюдались с первого раза, когда штамм, несущий делецию, был идентифицирован (дополнительный файл 1: таблица S1).
Среди шести больничных пациентов с делециями, которые влияют на spa -тип, три человека (BA, BB и BF) уже несли штамм с делецией при поступлении. Три других пациента (BC, BD и BE) приобрели делецию во время пребывания в больнице на фоне spa -типа, перенесенного при поступлении (Таблица 4). Прошло восемь, четыре и шесть дней между последним мазком без и первым мазком с приобретенной делецией для BC, BD и BE соответственно.Все три пациента с делециями во время госпитализации либо имели длительные заболевания, либо принимали несколько антибиотиков (BC: тейкопланин; BD: доксициклин; BD: флуклоксациллин, пенициллин, ципрофлоксацин, ванкомицин, эритромицин, гентамицин, тетрациклин).
Таблица 4 Лица, которые приобрели делецию в S. aureus spa -ген во время их госпитализацииПовторяющаяся природа гена spa делает его нестабильным и очень склонным к внутренним перестройкам, которые у бактерий происходят посредством RecA-зависимой или RecA-независимой рекомбинации [31–33].Эти перестройки могут иметь положительные или отрицательные эффекты, поскольку белок А является важным фактором вирулентности, который играет центральную роль в защите S. aureus от иммунного ответа хозяина. Появились новые доказательства того, что антибиотик ципрофлоксацин увеличивает скорость внутрихромосомной рекомбинации ДНК у Escherichia coli [34]. Другие антибиотики потенциально могут иметь аналогичные эффекты, но пока не обнаружены. Принимая во внимание, что три стационарных пациента, которые приобрели делеции во время их пребывания в больнице, принимали определенные антибиотики в течение длительного времени или широкий спектр антибиотиков в течение короткого периода времени, включая ципрофлоксацин, возможно, что давление антибиотиков могло быть одним из факторов, которые управляет генетическими перестройками в S.aureus ген протеина А. Однако мы также не можем исключить возможность того, что эти делеции, возможно, уже присутствовали с низкой частотой и не были обнаружены, прежде чем увеличиваться, чтобы стать мажоритарным вариантом (а не приобретенными de novo). Тем не менее, этот сценарий также поддержал бы антибиотики, играющие роль в возникновении делеций до обнаруживаемых уровней.
В сообществе большинство людей, колонизированных штаммами S. aureus , несут их без каких-либо симптомов.Однако, когда некоторые из них стали инвазивными, изменение среды обитания, например, на фоне давления антибиотиков, может способствовать приобретению перестроек в гене spa , что может быть выгодным в новой среде, даже если они приводят к потере или изменению. функции белка. Как было показано ранее, прогрессирование инфекционного заболевания обычно связано с приобретением мутаций или перестроек в патогене, многие из которых приводят к потере функции ряда генов [35].
Делеции, по-видимому, чрезмерно представлены в клональных линиях, связанных с домашним скотом
Всего мы обнаружили 20 spa -типов у 33 особей, связанных с девятью типами реаранжировок в гене spa (дополнительный файл 2: Таблица S2). Все типы делеций были связаны со смесью родственных и неродственных spa -типов, только вставка C2 была связана с группой из 3 тесно связанных spa -типов: t021, t012 и t10173. 20 spa -типов с перегруппировками были сгруппированы в пять групп близкородственных вариантов и пять неродственных синглетонов (таблица 5).
Таблица 5 Спа -типы и группы, в которых делеции / вставки в спа -ген наблюдалисьЛюбые кластеры родственных типов spa с более высокой распространенностью перегруппировок, влияющих на тип spa (delE, delG-insB или insC2), вероятно, будут недостаточно представлены или даже отсутствовать в большинстве исследований, основанных на рутинной spa — типовые протоколы.Чтобы проверить эту гипотезу, мы сравнили долю людей с перестройками, влияющими на spa -тип, и без них, в четырех группах spa -типов, и обнаруженный нами синглтон имел одну или несколько перегруппировок, влияющих на spa -тип (5 × 2 точный тест, таблица 5). В группе 1 35% штаммов были затронуты этими перестройками, что значительно выше по сравнению с 1-4% в других группах или одноэлементным t530 (p <0,0001). Следовательно, spa -тип t571 и его близкие варианты, такие как t3085, вполне могут быть недостаточно представлены в большинстве S.aureus основаны на типировании spa , поскольку они не могут быть типированы с помощью стандартного набора праймеров при наличии общих делеций.
Интересно, что spa -типа t571 принадлежит клональной линии ST398, которая содержит штаммы MRSA и MSSA, распространенные среди домашнего скота. Spa -тип t571 тесно связан с типами t011 и t034, все чаще всего связаны со свиньями [36-40]. Эти spa -типы реже обнаруживаются у собак, кошек и лошадей, а иногда и у крупного рогатого скота и птицы [41, 42].Масштабный скрининг свиней [36] показал, что 60% из них носили t034, 14% t1255 и 1,5% t571. Хотя ST398-ассоциированные spa -типы редко встречаются среди населения в целом, они чаще встречаются у фермеров, работающих со свиньями [36, 37]. Ветеринарный персонал и владельцы домашних животных также чаще являются носителями этих видов, связанных с животными [43]. Недавние исследования также сообщили о появлении связанных с домашним скотом клонов MRSA S. aureus ST398, вызывающих бактериемии у людей, что подтверждает независимую от животных передачу таких штаммов между людьми [44, 45].
Неясно, почему у штаммов ST398 S. aureus , обычно обнаруживаемых у домашнего скота, часто возникают делеции в IgG-связывающей части гена протеина A после передачи человеку. Одно из возможных объяснений состоит в том, что это могло быть частью адаптации штамма S. aureus к другому иммунному фону, где протеин А играет главную роль [7, 8, 12]. Другое объяснение может заключаться в том, что связанные с домашним скотом штаммы имеют больше перегруппировок в гене spa до передачи человеку из-за высокого уровня воздействия антибиотиков при производстве пищевых продуктов животноводства [46–48].Тем не менее, наши результаты подчеркивают возможность того, что эти штаммы на сегодняшний день в значительной степени недостаточно представлены в эпидемиологических исследованиях, а штаммы, ранее не поддающиеся типированию с использованием стандартных методов, могут быть источником систематической ошибки.
Гранулы протеина А, смола и столбцы протеина А
Мы предлагаем как исследовательские, так и технологические гранулы протеина A с выбором матрицы: агароза с протеином A или макропористая сшитая матрица с эпоксидно-связанным протеином A. Все наши смолы протеина A устойчивы к денатурантам и стабильны в обоих случаях. высокий и низкий pH.
Среда с белком А — для очистки антител
Расфасованные картриджи с протеином А — для разработки методов
Колонки с предварительно упакованным протеином А — для быстрой очистки антител
Колонки с белком А и среда
Белок А представляет собой белок клеточной стенки Staphylococcus aureus , который может связывать иммуноглобулины многих видов.Бактерия использует протеин А как часть своей защиты от иммунной системы хозяина. Рекомбинантный белок A продуцируется в E. coli для использования в исследованиях и производства сред для аффинной хроматографии.
Колонки с белком А используются для очистки антител от сложных смесей, таких как сыворотка, асцит и культуральная среда гибридомы. Доступны несколько форматов колонок и картриджей с протеином А. Картриджи с протеином A предлагаются с двумя типами сред с протеином A, и доступны наборы, содержащие колонки с протеином A, буферы и колонки для обессоливания для полного рабочего процесса очистки антител.
Ассортимент гранул с протеином А (смола с протеином А)
Высокая емкость гранул протеина А делает их пригодными для промышленного использования. Среда с протеином A широко используется в биофармацевтическом производстве и смежных отраслях из-за высокой авидности протеина A для человеческих IgG. Ряд человеческих или гуманизированных моноклональных IgG используется в терапевтических целях для лечения ряда заболеваний, особенно аутоиммунных нарушений и рака.
Не все типы антител связываются с гранулами протеина А.Большинство IgG будет удерживаться колонкой с протеином А, тогда как другие типы иммуноглобулинов часто связываются слабо или совсем не связываются. Поскольку IgG являются классом антител, наиболее часто используемым в исследованиях, такая селективность в отношении IgG часто является преимуществом.
Протеин А агароза в гранулах
В большинстве случаев аффинная хроматография проводится под действием силы тяжести или в системе низкого или среднего давления. Гранулы агарозы с белком А являются наиболее распространенной матрицей, хотя также используются полиакриламид и другие полимеры.Белок А связан с гранулами поперечно сшитой агарозы через химически стабильные амидные связи. Этот тип среды также иногда обычно называют сефарозой, хотя это относится к конкретному бренду сшитых гранул агарозы.
Помимо высокой способности к антителам, гранулы протеина А очень устойчивы к денатурирующим агентам, таким как мочевина, хаотропные агенты, такие как тиоцианат калия и гидрохлорид гуанидина, а также к широкому диапазону pH от 2 до 11. Следовательно, в жестких условиях элюирования которые часто требуются для удаления связанных антител, колонка с протеином А не повреждается.
Помимо использования в аффинной хроматографии, гранулы агарозы с протеином А используются для иммунопреципитации. Гранулы протеина А можно использовать либо для осаждения антител из сложных смесей, либо для очистки белков, комплексов или других антигенных молекул с использованием очищенных антител в формате сэндвича.
Рекомбинантный белок A | SinoBiological
| Чистота | > 95% по SDS-PAGE | |
| Система выражений: | E. coli. | |
| Молекулярная масса: | 34кД | |
| Форма: | Жидкий или лиофилизированный | |
| Хранение: | -20 ℃ или ниже | |
| Концентрация: | См. Этикетку на флаконе | |
| Примечание. Рекомендуется разделить белок на аликвоты и использовать его как можно скорее.Избегайте повторяющихся циклов замораживания-оттаивания. | ||
Свойства протеина А позволяют использовать его в качестве мощного аффинного лиганда для нескольких иммунологических и очистных применений. Высокая селективность и хорошая физико-химическая стабильность сделали белок А предпочтительным универсальным лигандом для аффинной очистки антител и молекул, меченных Fc-областью антитела.Белок A также можно использовать в различных иммунохимических анализах, включая вестерн-блоттинг, иммуногистохимию и ELISA, путем конъюгации с различными репортерными молекулами, такими как флуоресцентные красители (FITC), маркеры ферментов (пероксидаза, β-галактозидаза, щелочная фосфатаза), биотин и коллоидное золото. Исследования иммунопреципитации с белком А, конъюгированным с гранулами, также обычно используются для очистки белков или белковых комплексов косвенно через антитела против интересующего белка или белкового комплекса.
Связывание IgG с белками A, G и L| Виды | Белок А | Белок G | Белок L | |
Человек | IgG | +++ | +++ | +++ |
IgG1 | ++++ | ++++ | ++++ | |
IgG2 | ++++ | ++++ | ++++ | |
IgG3 | – | +++ | +++ | |
IgG4 | ++++ | ++++ | ++++ | |
IgA | + | – | +++ | |
IgA1 | + | – | +++ | |
IgA2 | + | – | +++ | |
IgD | – | – | +++ | |
IgE | ++ | – | +++ | |
IgM | + | – | +++ | |
Кролик | IgG | +++ | +++ | + |
Корова | IgG | + | +++ | – |
IgG1 | + | +++ | – | |
IgG2 | +++ | +++ | – | |
Кот | IgG | +++ | + | ? |
Лошадь | IgG | ++ | ++++ | ? |
Коза | IgG | + | ++ | – |
IgG1 | + | +++ | – | |
IgG2 | +++ | +++ | – | |
Морская свинка | IgG1 | ++ | + | ? |
IgG2 | ++ | + | ? | |
Овца | IgG | + | ++ | – |
IgG1 | + | ++ | – | |
IgG2 | +++ | +++ | – | |
Собака | ++ | + | ? | |
Свинья | +++ | ++ | +++ | |
Крыса | IgG | + | ++ | +++ |
IgG1 | – | + | +++ | |
IgG2a | – | ++++ | +++ | |
IgG2b | – | ++ | +++ | |
IgG2c | ++ | ++ | +++ | |
IgG3 | + | ++ | ? | |
Мышь | IgG | ++ | ++ | +++ |
IgG1 | + | ++++ | +++ | |
IgG2a | ++++ | ++++ | +++ | |
IgG2b | +++ | +++ | +++ | |
IgG3 | ++ | +++ | +++ | |
IgM | – | – | +++ | |
Цыпленок | IgY | – | – | – |
Обезьяна (резус) | IgG | ++++ | ++++ | ? |
Хомяк | + | ++ | +++ | |
Коала | – | + | ? | |
Лама | – | + | ? | |
Сильное связывание ＋＋, среднее взаимодействие ＋, слабое взаимодействие или отсутствие взаимодействия
| Штаммы i | ›4072 › 4074 ›5601 › 6850 ›8095 Подробнее» ›80s-2 | 3 NCTC 10443 ›NCTC 9789 / PS80, 27530, NCTC 9789 › NN1 ›NU3-1 › Новый ›Нью-Джерси › Ньюман ›Норвегия 1018 › P1 ›PC1 › PC3 ›RIMD 310925 › RN2677 ›RN4850 › RN6607 ›RN6734 › RN8465 ›Reynolds › S30 S6 ›SA137 / 935A2015 › SG2 / 93511 955 SMh22248 ›SMh24017 › SMh27487 ›SMh27608 › SMh28000 ›SMh28034 › SMh28037 ›SMh3 › SMH8997 ›SRM551 › SW1 ›SW415 SW1 9155 915 ›Св.Лука, Сент-Лука ›Sweden307 › Sweden309 ›TY114 › US6610 ›USA1100, USA 1100 › VBI-159227 ›VBI-160099 › VBI-M0894 ›WCUh39 / NCIMB 407739 / NCIMB 4077391, NCIMB 407739 / NCIMB 407739 / NCIMB msh22 «Меньше |
Промывка щелочными растворами в протеине Очистка A улучшает физико-химические свойства моноклональных антител
Влияние щелочной промывки на выходы очистки протеина A
Процедура очистки протеина A с помощью щелочной промывки заключается в следующем. изображенный на рис.1. Дополнительная промывка щелочным буфером (pH 9,0–11,0, обычно pH 11,0) и последующая стадия нейтрализующей промывки были включены в типичный протокол протеина А. Чтобы продемонстрировать преимущества стадии щелочной промывки, 19 клонов человеческих моноклональных антител IgG 1 (легкая цепь 17 λ, легкая цепь 2 k) очищали из 21 партии среды стандартным методом или методом щелочной промывки с буфером с pH 11,0. Каждую партию среды разделили на 2 группы для очистки по 2 протоколам. Чтобы оценить влияние щелочного метода на извлечение IgG (количество очищенного IgG / количество IgG в среде), коэффициенты увеличения извлечения (восстановление щелочного метода / восстановление стандартного метода) были рассчитаны для каждой партии среды (рис.2, дополнительная таблица 2). Удивительно, но 14 из 21 партии четко показали улучшенные выходы (коэффициенты усиления> 1,2, то есть увеличение выхода более чем на 20%). Фактически, коэффициенты усиления более 3 наблюдались для 5 из 21 партии, с самым высоким значением 21,1 (IgG-S на рис. 2). Хотя выход IgG-S в стандартном методе был чрезвычайно низким (3,0 мг / л, дополнительная таблица 2) из-за осаждения в элюате (дополнительный рисунок 1), метод щелочной промывки значительно улучшил извлечение труднодоступных -очистить белок.Напротив, только 2 партии (IgG-A и IgG-B) показали коэффициенты усиления ниже 0,9. Таким образом, включение щелочной промывки в обычную очистку протеина А улучшило процент извлечения большинства антител, протестированных в этом исследовании.
Рисунок 2Коэффициент извлечения во время очистки протеина А. 21 среднюю партию (19 IgG) очищали методом щелочной промывки и стандартным методом.
Влияние щелочной промывки на агрегацию и чистоту
Эксклюзионную хроматографию (SEC) и электрофорез на микрочипах (MCE-SDS) очищенных антител проводили, чтобы определить, влияет ли щелочная промывка на уровень разложения, агрегации или примесей.Данные SEC и MCE-SDS 6 антител (IgG-A, B, C, D, E и F) суммированы в таблице 1. Обработка щелочной промывкой не повлияла на агрегацию или разложение.
Таблица 1 Влияние щелочной промывки на чистоту антител.Необратимая агрегация
Очищенные материалы были дополнительно проанализированы, чтобы определить, влияет ли щелочная промывка на другие параметры или нет. Сначала оценивалась способность концентрировать антитела. Этот параметр рассматривается как важная характеристика во время оценки возможности разработки для выбора одного кандидата для клинических испытаний 14 , поскольку высококонцентрированные составы стали необходимы для определенных терапевтических показаний.Динамическое рассеяние света (DLS) часто используется для оценки поведения раствора моноклональных антител 14,16 . В этом исследовании распределение размеров частиц концентрированных антител (16 антител в таблице 2) и их разбавителей измеряли с помощью DLS с использованием Nanotrac UPA-UT151. В этом приборе используется гетеродинная система обнаружения, которая больше подходит для прямого измерения высококонцентрированных образцов, чем обычная фотонно-коррелированная спектроскопия 26 . Наивысшая концентрация каждого концентрированного образца также указана в таблице 2.Следует отметить, что эти самые высокие концентрации не являются максимальными. Исходная целевая концентрация была установлена на уровне 40–50 мг / мл, а некоторые образцы не были сконцентрированы из-за их плохих физико-химических свойств. Распределение размеров частиц при различных концентрациях IgG-A и IgG-B показано на фиг. 3 в качестве представителей. Образцы IgG-A и IgG-B, очищенные стандартным методом, показали совокупные пики независимо от их концентраций в дополнение к пику мономера около 10 нм.Поскольку эти агрегированные пики наблюдались даже для разбавленных образцов, считалось, что эти пики происходят от необратимых агрегатов. Напротив, IgG-A и IgG-B, очищенные методом щелочной промывки, не показали никакой агрегации независимо от их концентраций, что указывает на то, что обработка щелочной промывкой защищает эти антитела от необратимой агрегации. Переход к более крупным размерам частиц при высоких концентрациях отражает обратимые самовзаимодействия молекул антител, а не агрегатов 16 .Превентивные эффекты щелочной промывки на необратимую агрегацию наблюдались для 9 (IgG-A, B, G, H, I, J, N, P и Q) из 16 антител (таблица 2). Нам не удалось сконцентрировать традиционно очищенные IgG-L, O, P и Q до концентраций> 20 мг / мл из-за плохих физико-химических свойств. Напротив, эти 4 антитела, очищенные методом щелочной промывки, были успешно сконцентрированы до> 30 мг / мл без необратимой агрегации. Таким образом, щелочная промывка защищает антитела от необратимой агрегации.Другие 5 антител (IgG-C, D, E, F и M) показали обратимую ассоциацию при концентрации независимо от методов очистки. Фактически, 16 антител, полученных в результате щелочной промывки, были успешно сконцентрированы без какой-либо обнаруживаемой необратимой агрегации.
Рисунок 3Профили DLS IgG-A и IgG-B в различных концентрациях, очищенных стандартным методом и методом щелочной промывки.
Количественное определение свободных тиоловых групп
Чтобы изучить механизм того, как щелочная промывка предотвращает необратимую агрегацию антител, было проведено количественное определение свободных тиоловых групп с использованием тиол-реактивного агента 4, 4 ‘дитиодипиридина 28 .Как показано в таблице 2, были измерены свободные тиолы 15 IgG. Эти 15 антител включают 8 антител (IgG-A, B, G, H, I, J, N и Q), которые показали необратимую агрегацию при очистке стандартным методом (рис. 3, таблица 2). Среди этих 8 необратимо агрегированных антител 6 антител (IgG-A, B, G, H, I и J), очищенных стандартным методом, показали высокие значения свободных тиолов / молекул антител (таблица 2). Напротив, промытые щелочью образцы IgG-A, B, G, H, I и J явно показали гораздо более низкие значения свободных тиолов / антител.Поскольку высокие уровни свободных тиолов считаются одной из причин необратимой агрегации IgG 29 , защитный эффект щелочной промывки в отношении необратимой агрегации (рис. 3) можно приписать ускоренному образованию тиолат-ионов, выступающих в качестве реактивных частиц. в тиол-дисульфидном обмене и образовании дисульфида при pH выше pKa тиоловых групп 30, 31 . Остальные 7 антител (IgG-C, D, E, F, L, M и O), которые не показали необратимой агрегации при стандартной очистке (Таблица 2), показали гораздо более низкие значения свободных тиолов / молекул антител, чем необратимо агрегированные антитела (IgG-A, B, G, H, I и J), очищенные стандартным методом.Этот факт также поддерживает идею о том, что основным механизмом, с помощью которого щелочная промывка предотвращает необратимую агрегацию, является уменьшение количества свободных тиолов.
Таблица 2 Влияние щелочной промывки на физико-химические характеристики.Самовзаимодействие молекул IgG
Затем оценивали самовзаимодействие антител (таблица 2, рис. 3). Самовзаимодействие молекул IgG считается важным фактором при разработке стабильной высококонцентрированной композиции, поскольку склонность к самовзаимодействию тесно связана с высокой вязкостью и повышенной скоростью агрегации 16,32,33,34 .Анализ DLS, зависящий от концентрации, часто используется для оценки склонности IgG к самовзаимодействию во время оценки способности к развитию. Параметр взаимодействия k D, , который вычисляется из данных DLS, измеренных при различных концентрациях, является ключевым параметром для определения того, является ли межмолекулярное взаимодействие отталкивающим или притягивающим 16,32 . Lehermayr et.al. сообщил, что k D значения ок. — 9 мл / г соответствует отсутствию самовзаимодействия 35 для моноклональных антител, что хорошо согласуется с результатами других групп 16,33,34 .Этот результат показывает, что значение k D , превышающее -9 мл / г, можно считать отталкивающим межмолекулярным взаимодействием. Напротив, значение k D меньше -9 мл / г можно рассматривать как привлекательное взаимодействие. Отталкивающее самовзаимодействие антител предпочтительно для терапевтического использования, поскольку оно может привести к более низкой вязкости и более медленной скорости агрегации 16,32,33,34 .
В этом эксперименте была использована та же процедура, что и в эксперименте для необратимой агрегации (рис.3, таблица 2) для получения значений k D . Сравнение параметров взаимодействия 7 антител (IgG-C, D, E, F, L, O и M), которые не образовывали необратимую агрегацию при концентрировании независимо от методов очистки, ясно показало, что щелочная промывка улучшила k D значений, кроме IgG-L и IgG-M. Таблица 2 показывает, что значения k D IgG-C, D, E, F, O и L, очищенных стандартным методом, были меньше, чем — 9 мл / г, что свидетельствует о том, что эти антитела имеют тенденцию привлекательно связываться. .Напротив, 3 антитела (IgG-C, D и E), очищенные с использованием метода щелочной промывки, показали приведенные выше значения k D — 9 мл / г, что указывает на то, что эти образцы имели слегка отталкивающее самовзаимодействие. . Удивительно, но метод щелочной промывки значительно улучшил тенденцию очищенных от протеина А образцов к самоассоциации. Поскольку количество свободных тиолов IgG-C, D, E также снижалось при промывании щелочным буфером, свободные тиолы могли участвовать в улучшении тенденции к обратимой самоассоциации.Помимо уменьшения количества свободных тиолов, щелочная промывка может удалить другие примеси, которые способствуют самоассоциации, что может быть еще одной причиной этого эффекта. Параметры взаимодействия IgG-A, B, G, H, I, J, N, O, P и Q были рассчитаны только для образцов, очищенных щелочной промывкой, поскольку наличие агрегированных пиков может затруднить анализ (Таблица 2 ).
Элюирование примесей щелочной промывкой
Чтобы исследовать влияние щелочной промывки на удаление примесей, SDS-PAGE анализ IgG-C проводили в невосстанавливающих условиях.Фракции, вымытые из колонки с протеином А во время стадии промывки несколькими щелочными буферами (pH 9,0–11,5), собирали и подвергали SDS PAGE (рис. 4). Буферы с pH 7,2 и 9,0 не элюировали явных примесей, однако буферы с pH выше 9,0 элюировали несколько полос. Буфер с pH 11,5 элюировал целевое антитело, но в других условиях элюированного IgG-C не наблюдалось. Происхождение полос чуть выше 20 кДа и немного ниже 40 и 50 кДа неизвестно, поскольку они не соответствовали легкой цепи и тяжелой цепи IgG-C соответственно (рис.4). Разница в условиях для SDS PAGE (невосстанавливающий или восстанавливающий) часто влияет на электрофоретическую подвижность белков, поэтому мы не могли четко определить происхождение этих полос. Мы еще не смогли сделать вывод, что другие полосы, расположенные в 70–80, 100–120 и 120–160 кДа, представляют собой IgG-C со свободными тиолами или белками клетки-хозяина. Другая группа ранее сообщала, что белок клетки-хозяина хомячка фосфолипаза B-Like 2 показал по крайней мере 3 полосы в диапазоне 20-60 кДа в их SDS PAGE анализе 36 .Поскольку диапазон молекулярной массы белка хомяка очень близок к таковому у IgG, необходимы дальнейшие исследования для определения происхождения этих полос, элюируемых щелочной промывкой. Принимая во внимание, что профили SDS-PAGE и SEC очищенных материалов содержат только виды, связанные с общими IgG (данные не показаны), эти данные убедительно свидетельствуют о том, что щелочная промывка элюировала эти примеси независимо от их происхождения, не влияя на взаимодействие белка A-IgG в диапазон pH 9.5–11.0 (рис. 4).
Фигура 4SDS-PAGE анализ промывной фракции IgG-C. M означает молекулярный маркер. Указаны молекулярные массы.
Тест краткосрочной стабильности
Ускоренные тесты стабильности при 40 ° C часто используются для оценки долгосрочной стабильности антител при целевой температуре хранения, например, 2–8 ° C 32 . Мы провели тест на краткосрочную стабильность, чтобы определить, образуются ли необратимые агрегаты во время хранения.
Добавить комментарий