Вход в личный кабинет | Регистрация
Избранное (0) Список сравнения (0)
Ваши покупки:
0 товаров на 0 Р
Итого: 0 Р Купить

Изолят это в биологии: Изоляты — это… Что такое Изоляты?

Содержание

Изоляты - это... Что такое Изоляты?

  • ИЗОЛЯТЫ — (от франц. isoler отделять), сравнительно небольшие группы людей, к рые в силу своего терр. положения (напр., расселения на небольшом о ве, в горах и др. труднодоступных местах) или иных причин (религиозных, этнических и пр.) оказались… …   Демографический энциклопедический словарь

  • Изоляты — Изолированный язык (язык изолят) язык, который не входит ни в одну известную языковую семью. Таким образом фактически каждый изолированный язык образует отдельную семью, состоящую только из этого языка. Наиболее известные примеры включают… …   Википедия

  • Род Фитофтора (Phytophthora) —         В роде фитофтора насчитывают около 70 видов. По морфологическим, физиологическим и экологическим особенностям этот род занимает промежуточное положение между питиевыми и пероноспоровыми грибами.         Мицелий грибов фитофторы белый,… …   Биологическая энциклопедия

  • Изолированный язык — (язык изолят) язык, который не входит ни в одну известную языковую семью. Таким образом фактически каждый изолированный язык образует отдельную семью, состоящую только из этого языка. Наиболее известные примеры включают бурушаски, шумерский,… …   Википедия

  • Изолированные языки — Не следует путать с изолирующими языками. Изолированный язык (язык изолят)  язык, который не входит ни в одну известную языковую семью. Таким образом фактически каждый изолированный язык образует отдельную семью, состоящую только из этого… …   Википедия

  • Язык-изолят — Изолированный язык (язык изолят) язык, который не входит ни в одну известную языковую семью. Таким образом фактически каждый изолированный язык образует отдельную семью, состоящую только из этого языка. Наиболее известные примеры включают… …   Википедия

  • H5N1 — H5N1 …   Википедия

  • Род Питиум (Pythium) —         Представители рода питиум имеют тонкий, паутинистый мицелий (толщина гиф 3 6 мкм), простирающийся по пищевому субстрату. Большинство водных питиумов обитает в пресной воде, однако Pythium marinum, P. maritimum (рис. 24) и P. reptans… …   Биологическая энциклопедия

  • Инванз — Действующее вещество ›› Эртапенем* (Ertapenem*) Латинское название Invanz АТХ: ›› J01DH03 Эртапенем Фармакологическая группа: Карбапенемы Нозологическая классификация (МКБ 10) ›› A41 Другая септицемия ›› E14.5 Язва диабетическая ›› J18.9… …   Словарь медицинских препаратов

  • Семейство Питиевые (Pythiaceae) —         Питиевые грибы занимают промежуточное положение между водными сапрофитами из семейства сапролегниевых и высокоспециализированными паразитами высших наземных растений из семейства пероноспоровых. Это семейство очень важно для понимания… …   Биологическая энциклопедия

  • Анализ спорадических случаев инвазивного листериоза в мегаполисе | Воронина

    Введение

    В условиях пандемии коронавируса особенно наглядно проявилась роль молекулярных методов диагностики в решении эпидемических задач. За короткий промежуток времени в России было разработано и зарегистрировано 19 наборов для ПЦР и изотермической амплификации SARS-CoV-21, активизирована работа лабораторной службы, позволившая нарастить объем тестирований, результаты лабораторных тестов стали критерием выхода переболевшего из карантина2, полногеномное секвенирование возбудителя послужило источником информации для разработки вакцины и для контроля эпидемической ситуации. 207 геномов SARS-CoV-2 было депонировано в базе данных GISAID

    3 российскими исследователями из 31 998, зарегистрированных по состоянию на 26.05.2020.

    Пандемия ужаснула мир количеством заразившихся, заболевших и летальностью, которая составила 2,7% в России, но гораздо выше была в США (17,2%) и Италии (18,4%), по данным на 28 мая 2020 г.4

    В это время, казалось, другие инфекции отступили на второй план. Однако вопросы безопасности пищевых продуктов, их производства и хранения в условиях изоляции стали особенно актуальны уже весной 2020 г. Федеральное управление по безопасности пищевых продуктов и ветеринарии Швейцарии сообщило в мае 2020 г. о вспышке листериоза, вызванной употреблением полутвёрдых сыров производства «Käserei Vogel AG» (11 заболевших, 2 умерших)5. Управление по контролю за продуктами и лекарствами США 09.06.2020 г. проинформировало о завершении вспышки листериоза, начавшейся в марте 2020 г. и вызванной грибами эноки (опёнок зимний, Flammulina velutipes) производства Республики Корея (36 заболевших в 17 штатах, 4 умерших)6. Расчет летальности при вспышке листериоза в США показал, что она составила 3,8%, тогда как при самой масштабной вспышке в ЮАР в 2017 г. летальность достигла 20,4%

    7 [1], что превышает показатели при текущей пандемии SARS-CoV-2.

    Вместе с тем анализ вспышек и спорадических случаев инвазивного листериоза, а также сопоставление сезонов вирусных и листерийных инфекций показывает, что предшествующие вирусные инфекции способствуют заболеванию листериозом в силу нарушения мукоидного слоя желудочно-кишечного тракта при вирусном гастроэнтерите [2]. Впервые такое исследование было выполнено в сезоне декабрь 1986 г. — март 1987 г. в США [3]. Среди обследованных 89% были взрослыми, их средний возраст — 67 лет.

    В нашем исследовании 44% выявленных случаев составил перинатальный листериоз, подтвердив опасность листериоза для беременных, восприимчивость которых к листериям выше в 10–24 раза [4] в силу существенного снижения количества Т-клеток в периферической крови, особенно во II и III триместрах беременности [5]. Кроме того, у беременных возрастает вероятность инвазии в эпителиальные клетки кишечника поступивших с пищей листерий, поскольку снижается подвижность кишечника, необходимая для секреции мукуса. В норме мукоидный слой физически захватывает бактерии и изгоняет их из тонкого кишечника в толстый, а также закрывает гликопротеиновые рецепторы на поверхности энтероцитов [6]. При доступности энтероцитов эффективность инвазии определяется специфичностью взаимодействия интерналинов листерий и эпителиального трансмембранного белка Е-кадгерина [7], поэтому в нашем исследовании для сравнения клинических изолятов Listeria monocytogenes использовали профиль не только MLST (MultiLocus Sequence Typing), но и интерналинов A, B, C, E [8]. Для доказательства идентичности или близкородственности изолятов применяли полногеномное секвенирование с последующим анализом корового генома в соответствии с действующими стандартами [9].

    В задачу нашего исследования входило молекулярно-генетическое изучение изолятов L. monocytogenes из клинических образцов, полученных при выявлении спорадических случаев инвазивного лиcтериоза в мегаполисе преимущественно в период респираторных вирусных инфекций.

    Материалы и методы

    Изоляты L. monocytogenes были выделены от 18 госпитализированных пациентов в стационарах Москвы с ноября 2018 г. по октябрь 2019 г. В первой группе сравнения были использованы изоляты из продуктов питания, проанализированные ранее [8] и зарегистрированные в базе данных Institut Pasteur MLST and whole genome MLST

    8 под ID 42984-42998, а также добавленный к ним изолят GIMC2035:Lmc7218 из рыбных пресервов, выделенный в октябре 2019 г. Во вторую группу сравнения вошли изоляты из окружающей среды, полученные из коллекции ФГБНУ ФИЦВиМ, исследованные ранее [10][11] и зарегистрированные под ID 5799-5801, 5803-5816.

    Выделение клинических изолятов проводили согласно Методическим указаниям по применению унифицированных микробиологических (бактериологических) методов исследования в клинико-диагностических лабораториях9. Для инкубации культур использовали колумбийский агар с добавлением 5% дефибринированной бараньей крови («БиоМедиа») и атмосферу 5% СО2. Время инкубации составило 18–24 ч. Инкубацию и отбор колоний проводили с помощью системы «BD Kiestra™ WCA» («BD»). Для идентификации культур применяли масс-спектрометр «Bruker microflex MALDI-TOF» («Bruker Daltonik GmbH»).

    Исследование культур с помощью мультилокусного секвенирования, включавшего анализ 7 генов «домашнего хозяйства» и 4 генов вирулентности (MLST; Multi-virulent-locus sequence typing — MvLST), проводили, как описано ранее [8].

    Анализ аллелей MLST и аллельных профилей (ST, Sequence Type) выполняли с помощью ресурсов Bacterial Isolate Genome Sequence Database for L. monocytogenes (BIGSdb-Lm)10 [9]. Проанализированные изоляты и новые аллельные профили депонировали в базе данных сайта (ID 42973–42983, 45724–45731).

    Аллели MvLST и IP (Internalin genes (InlA, InlB, InlC, InlE) Profile) определяли, используя в качестве референсов опубликованные последовательности [8][10][11][12][13]. Новый вариант аллеля InlA, выявленный в ходе данного исследования, зарегистрировали в GenBank (Accession Numbers: MT043268).

    Для расчета индекса разнообразия Шеннона использовали формулу:

    –Σpi × log2pi,

    где pi= ni/N, где n— численность изолятов данного генотипа;
    N — численность всех изолятов выборки.

    Полногеномное секвенирование 4 изолятов L. monocytogenes ST7 (GIMC2009:LmcUh5 и GIMC2010:LmcUH8 — клинических; GIMC2015: Lmc22 и GIMC2016:Lmc547 — из продуктов питания) выполняли на платформе «MiSeq Illumina» (картридж MiSeq Reagent Kit v2). Для приготовления библиотек фрагментов использовали набор «KAPA HyperPlus» («Roche»). Качество и размер библиотек оценивали с помощью электрофореза на чипах «Bioanalyzer» («Agilent»). Результаты секвенирования (Sequence Read Archive) депонировали в GenBank NCBI (BioProject ID: PRJNA605697).

    Для сборки геномов и анализа SNV (Single Nucleotide Variant) использовали CLC Genomics Workbench v.20. CGView Server применяли для проверки результатов сборки [14]. Аннотацию геномов выполняли с помощью сервера RAST (Rapid Annotations using Subsystems Technology) [15][16]. Для поиска последовательностей профагов использовали PHASTER (PHAge Search Tool Enhanced Release) [17]. MLST корового генома (cgMLST) изолятов определяли с помощью ресурсов BIGSdb-Lm [18].

    Результаты

    Разнообразие генотипов клинических изолятов L. monocytogenes в контексте генов MLST

    В стационарах Москвы за период наблюдения с ноября 2018 г. по октябрь 2019 г. было выявлено 18 случаев инвазивного листериоза. Перинатальный листериоз составил 44%, диагноз «менингит» поставлен в 27% случаев. Как видно из таблицы, менингит, пневмония, листериозный сепсис — диагнозы старшей возрастной группы 59–89 лет. Разнообразие генотипов листерий, выделенных при перинатальном листериозе, было не велико: ST6 филогенетической линии I и ST7 филогенетической линии II. Индекс разнообразия Шеннона (H) для этой группы составил 0,95. Преобладал ST7 — 63% (рис. 1, а).

    В старшей возрастной группе разнообразие генотипов было выше (H = 2,65), при этом также преобладали генотипы филогенетической линии II (61%), а превалировал ST7 (рис. 1, б).

    Сравнение выборки клинических изолятов с выборками пищевых изолятов, выделенных из продуктов российского производства, а также изолятов из окружающей среды, полученных из образцов европейской части РФ, показало, что индекс разнообразия выше в последних двух группах (рис. 1, в, г). В этих группах также существенно выше доля изолятов филогенетической линии II. Она составляет 94%.


    Рис. 1
    . Доля L. monocytogenes филогенетических линий I и II в группах клинических изолятов.
    а — перинатальный листериоз; б — менингит, пневмония, сепсис в старшей возрастной группе; в — в пищевых изолятах; г — в изолятах из окружающей среды. В рамке указан индекс разнообразия Шеннона (H). Филогенетическая линия отмечена в скобках. Серым выделением обозначены доли генотипов филогенетической линии II.
    Fig. 1. Proportion of L. monocytogenes of phylogenetic lineages I and II in the groups of clinical isolates.
    a — perinatal listeriosis; b — meningitis, pneumonia, and sepsis in the senior age group; c — in food isolates; d — in environmental isolates. The box shows the Shannon diversity index (H). The phylogenetic lineage is shown in parenthesis. Proportions of genotypes of phylogenetic lineage II are highlighted in grey.

    Общим генотипом для всех групп листерий был ST7. ST6 лидировал в группе клинических изолятов филогенетической линии I, но не встречался в группах изолятов из окружающей среды и пищевых продуктов российского производства. Из генотипов филогенетической линии I, выявленных у изолятов из клинических образцов, только ST5 отмечен у изолята из окружающей среды. В филогенетической линии II еще 2 генотипа группы клинических изолятов были выявлены ранее: ST155 — у изолята из пищевых продуктов, ST14 — у изолята из окружающей среды.

    Рассмотрим группу перинатального листериоза. Причиной листериозного сепсиса у беременных женщин стала L. monocytogenes ST7, что привело как к самым тяжелым последствиям — аборт на 18-й неделе, так и к преждевременным родам (таблица). В одном случае своевременное обнаружение L. monocytogenes и проведенное лечение способствовали выздоровлению беременной и родоразрешению в срок. Из 5 случаев листериоза новорожденных 2 были вызваны L. monocytogenes ST7 и 3 — ST6. Причем у новорожденного из проанализированной пары мать ребенок (LmcUh5, LmcUH8) была диагностирована врожденная пневмония, что, как правило, происходит при аспирации бактерий в инфицированных родовых путях.

    Характеристика изолятов L. monocytogenes, выделенных в стационарах Москвы
    Characteristics of L. monocytogenes isolates from Moscow hospitals

    Сроки выделения L. monocytogenes в 5 случаях перинатального листериоза максимально приближены к пику заболеваемости гриппом и ОРВИ в Москве в сезоне 2018/2019 гг. — с 28.01.2019 г. по 03.02.2019 г.11 и к пику по гриппу в России — с 04.02.2019 г. по 10.02.2019 г.12

    В старшей возрастной группе пациенты с менингитом были младше пациентов с листериозной пневмонией (медиана возраста 62 против 88). Среди возбудителей менингита преобладали L. monocytogenes филогенетической линии II. Из 3 случаев пневмонии 2 были вызваны L. monocytogenes филогенетической линии I.

    Пневмонии пришлись на начало сезона ОРВИ, а менингиты (5 из 6 случаев) — на время высокого уровня заболеваемости гриппом и ОРВИ.

    Анализ корового генома изолятов L. monocytogenes ST7

    Поскольку во всех группах изолятов ST7 составлял существенную долю, мы провели сравнение полных геномов 4 изолятов этого генотипа. Клинические изоляты были выделены от родильницы (GIMC2009:LmcUh5) и новорождённого (GIMC2010:LmcUH8). Пищевой изолят (GIMC2015: Lmc22) из охлажденного мяса соответствовал клиническим по аллельному профилю и по профилю интерналинов, изолят из филе цыпленка (GIMC2016:Lmc547) отличался аллелем интерналина А [8].

    Анализ геномов с помощью ресурсов BIGSdbLm показал, что 2 клинических изолята и изолят из мяса имеют профиль корового генома, близкий к cg-14120, тогда как геном второго пищевого изолята был близок cg-12083. Сопоставление 1748 локусов корового генома изолята новорожденного и пищевых с изолятом родильницы подтвердило, что коровые геномы изолятов матери и ребенка идентичны (рис. 2), изолят из мяса отличался 23 локусами, а изолят из филе цыпленка — 57 локусами. Пищевые изоляты имели 11 общих отличий от клинических изолятов; 12 локусов из 23, отличавших изолят из мяса, были идентичными у клинических изолятов и изолята из филе цыпленка. Следует отметить, что все отличия, за исключением одного локуса, были SNV. В локусе lmo2171, кодирующем MFS (major facilitator superfamily) транспортёр, делеция 3 триплетов была отмечена в клинических изолятах и изоляте из мяса. Эта характерная деталь подчеркивает бóльшее родство изолята GIMC2015:Lmc22 с клиническими изолятами.


    Рис. 2
    . Результаты сравнения 1748 локусов корового генома для геномов 4 изолятов ST7. В скобках указано количество локусов корового генома, отличающихся от клинических образцов.
    Fig. 2. Comparison of 1,748 core genome loci for the genomes of 4 ST7 isolates. The number of loci of the core genome that differ from clinical samples is indicated in parentheses.

    Обсуждение

    Проведенное исследование показало, что за период наблюдения с ноября 2018 г. по октябрь 2019 г. клинические случаи листериоза распределились по диагнозам в соответствии с возрастом пациентов. Перинатальный листериоз в большинстве случаев пришёлся на зимне-весенний период подъёма заболеваемости гриппом, когда уровень заболеваемости населения был выше базовой линии (72,2 на 10 тыс. человек) и выше еженедельного эпидемического порога. В старшей возрастной группе 4 из 5 случаев менингита коррелировали с периодом высокой заболеваемости гриппом, тогда как заболевание листериозной пневмонией совпало по времени с осенним сезоном ОРВИ.

    Особое внимание мы уделили случаям перинатального листериоза, составившим 44% выборки клинических изолятов. Сопоставление наших данных с результатами исследования клинических случаев в Германии периода 2013–2018 гг. показало существенно более низкое количество перинатального листериоза в немецкой выборке: 7% [19]. Разнообразие генотипов изолятов, представленных в немецком исследовании, было минимальным (СС5 и СС7), как в группе перинатального листериоза в нашей выборке, однако доля изолятов филогенетической линии I была значительно выше, чем изолятов филогенетической линии II (8%/16%) [18]. В нашей выборке, напротив, преобладали изоляты филогенетической линии II (77%), доля ST7 составила 39%. Изоляты филогенетической линии I в российской и немецкой выборках различались по составу генотипов. В нашей выборке ST5 был представлен только 1 изолятом, а лидировал ST6. В то же время следует отметить, что штаммы аутохтонного для России ST7 вызывали заболевание и в Германии.

    При исследовании случаев инвазивного листериоза в Австрии в 2017 г. полученные данные по генотипированию были ближе к нашим результатам. Доля изолятов филогенетической линии II составила 58%, I — 39%, III — 3%. Лидировали по встречаемости ST1, 155, 451 и СС7 [18]. Таким образом, в Австрии CC7 также отмечен у клинических изолятов. Заметим, что среди изолятов филогенетической линии I в австрийской выборке ST6 встретился только 1 раз, тогда как в нашей выборке изоляты с ST6 составили 28%.

    На примере выборок клинических изолятов из 3 стран мы видим, что достаточно большой перечень генотипов характеризует изоляты, ставшие причиной инвазивного листериоза, однако каждая территория имеет свои особенности, определяющие преобладание штаммов той или иной филогенетической линии. Вместе с тем изоляты ST7 (СС7) встречались во всех выборках.

    Полногеномное секвенирование изолятов ST7 показало, что можно подтвердить передачу штамма от матери ребенку, поскольку коровые геномы штаммов полностью совпали. В исследовании А. Moura и соавт., предложивших универсальную схему анализа корового генома L. monocytogenes, состоящего из 1748 локусов, также было продемонстрировано, что пары изолятов при вертикальной передаче от матери к новорожденному не имеют аллельных отличий [9].

    Вопрос критерия отнесения изолятов L. monocytogenes к одной вспышке на основе cgMLST рассмотрен в 2 публикациях: в упомянутом исследовании А. Moura и соавт., выполненном на выборке из 957 геномов [9], и в работе W. Ruppitsch и соавт., включившей в анализ 67 геномов из австрийской коллекции [20]. Порог отнесения геномов к одной вспышке составил не более 7 [9] и 10 отличающихся локусов [20]. Опираясь на эти критерии, мы не можем считать пищевой изолят GIMC2015:Lmc22 из охлажденного мяса участником того эпидемического процесса, который повлёк заболевание родильницы, тем более что и выделен он был на 9 мес раньше клинического изолята. Тем не менее наличие общей делеции в геномах клинического и пищевого изолятов при 23 локусах отличий позволяет охарактеризовать эти изоляты как близкородственные.

    Заключение

    Проведенное исследование спорадических случаев листериоза в мегаполисе показало увеличение заболеваемости листериозом, особенно среди беременных, в период превышения эпидемического порога по гриппу и ОРВИ. Своевременная вакцинация от гриппа и ОРВИ, применение индивидуальных средств защиты в общественных местах, ставшее нормой в период эпидемии коронавируса, могут стать дополнительными направлениями профилактики листериоза, наряду с обязательным контролем производства и хранения продуктов питания.

    При анализе клинических случаев инвазивного листериоза возрастает роль молекулярно-генетических методов. Мультилокусное секвенирование 11 генов или экспресс-вариант, включающий 3 локуса, позволяют оперативно проводить эпидемиологическое расследование спорадических случаев, а также уточнять идентификацию L. monocytogenes при микробиологическом обследовании беременных женщин в ходе профилактического мониторинга. При расследовании эпидемической вспышки пищевой инфекции (групповых случаев листериоза) и поиске продукта — источника заражения необходимо полногеномное секвенирование изолятов с анализом корового генома и определением количества локусов, отличающих клинические и пищевые изоляты.

    Для практической реализации данного подхода необходима подготовка новых методических документов национального уровня, регламентирующих комплекс современных молекулярно-генетических и микробиологических методов, обеспечивающих эффективную профилактику и диагностику листериоза.

     

    1. Smith A.M., Tau N.P., Smouse S.L., Allam M., Ismail A., Ramalwa N.R., et al. Outbreak of Listeria monocytogenes in South Africa, 2017–2018: Laboratory activities and experiences associated with wholegenome sequencing analysis of isolates. Foodborne Pathog. Dis. 2019;16(7): 524–30. https://doi.org/10.1089/fpd.2018.2586

    2. Schlech W.F. Epidemiology and clinical manifestations of Listeria monocytogenes infection. Microbiol. Spectr. 2019; 7(3). https://doi.org/10.1128/microbiolspec.GPP3-0014-2018

    3. Schwartz B., Hexter D., Broome C.V., Hightower A.W., Hirschhorn R.B., Porter J.D., at al. Investigation of an outbreak of listeriosis: new hypotheses for the etiology of epidemic Listeria monocytogenes infections. J. Infect. Dis. 1989; 159(4): 680–5. https://doi.org/10.1093/infdis/159.4.680

    4. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Vital signs: Listeria illnesses, deaths, and outbreaks — United States, 20092011. MMWR Morb. Mortal. Wkly Rep. 2013; 62(22): 448–52.

    5. Sridama V., Pacini F., Yang S.L., Moawad A., Reilly M., DeGroot L.J. Decreased levels of helper T cells: a possible cause of immunodeficiency in pregnancy. N. Engl. J. Med. 1982; 307(6): 352–6. https://doi.org/10.1056/NEJM198208053070606

    6. Navaneethan U., Giannella R.A. Mechanisms of infectious diarrhea. Nat. Clin. Pract. Gastroenterol. Hepatol. 2008; 5(11): 637–47. https://doi.org/10.1038/ncpgasthep1264

    7. Madjunkov M., Chaudhry S.., Ito S. Listeriosis during pregnancy. Arch. Gynecol. Obstet. 2017; 296(2): 143–52. https://doi.org/10.1007/s00404-017-4401-1

    8. Воронина О.Л., Кунда М.С., Рыжова Н.Н., Кутузова А.В., Аксенова Е.И., Карпова Т.И. и др. Листериоз. Генотипирование как ключ к выявлению возможного источника заражения. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2019; 21(4): 261–73. https://doi.org/10.36488/cmac.2019.4.261273

    9. Moura A., Criscuolo A., Pouseele H., Maury M.M., Leclercq A., Tarr C., et al. Whole genome-based population biology and epidemiological surveillance of Listeria monocytogenes. Nat. Microbiol. 2016; 2: 16185. https://doi.org/10.1038/nmicrobiol.2016.185

    10. Воронина О.Л., Кунда М.С., Рыжова Н.Н., Аксенова Е.И., Семенов А.Н., Курнаева М.А. и др. Закономерности селекции полигостальных убиквитарных микроорганизмов на примере представителей трех таксонов. Молекулярная биология. 2015; 49(3): 430–41. https://doi.org/10.7868/S0026898415030179

    11. Voronina O.L., Ryzhova N.N., Kunda M.S., Kurnaeva M.A., Semenov A.N., Aksenova E.I., et al. Diversity and pathogenic potential of Listeria monocytogenes isolated from environmental sources in the Russian Federation. International Journal of Modern Engineering Research (IJMER). 2015; 5(3): 5–15.

    12. Adgamov R., Zaytseva E., Thiberge J.M., Brisse S., Ermolaeva S. Genetically related Listeria monocytogenes strains isolated from lethal human cases and wild animals. In: Caliskan M., ed. Genetic Diversity in Microorganisms. Rijeka: InTech; 2012. Ch. 9.

    13. Psareva E.K., Egorova I.Y., Liskova E.A., Razheva I.V., Gladkova N.A., Sokolova E.V., et al. Retrospective Study of Listeria monocytogenes isolated in the territory of inner Eurasia from 1947 to 1999. Pathogens. 2019; 8(4): 184. https://doi.org/10.3390/pathogens8040184

    14. Grant J.R., Stothard P. The CGView Server: a comparative genomics tool for circular genomes. Nucleic Acids Res. 2008; 36(Web Server issue): W181–4. https://doi.org/10.1093/nar/gkn179

    15. Aziz R.K., Bartels D., Best A.A., DeJongh M., Disz T., Edwards R.A., et al. The RAST server: rapid annotations using subsystems technology. BMC Genomics. 2008; 9: 75. https://doi.org/10.1186/1471-2164-9-75

    16. Overbeek R., Begley T., Butler R.M., Choudhuri J.V., Chuang H.Y., Cohoon M., et al. The ubsystems approach to genome annotation and its use in the project to annotate 1000 genomes. Nucleic Acids Res. 2005; 33(17): 5691–702. https://doi.org/10.1093/nar/gki866

    17. Arndt D., Grant J., Marcu A., Sajed T., Pon A., Liang Y., et al. PHASTER: a better, faster version of the PHAST phage search tool. Nucleic Acids Res. 2016; 44(W1): W16–21. https://doi.org/10.1093/nar/gkw387

    18. Cabal A., Pietzka A., Huhulescu S., Allerberger F., Ruppitsch W., Schmid D. Isolate-based surveillance of Listeria monocytogenes by whole genome sequencing in Austria. Front. Microbiol. 2019; 10: 2282. https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.02282

    19. Lüth S., Halbedel S., Rosner B., Wilking H., Holzer A., Roedel A., et al. Backtracking and forward checking of human listeriosis clusters identified a multiclonal outbreak linked to Listeria monocytogenes in meat products of a single producer. Emerg. Microbes Infect. 2020; 9(1): 1600–8. https://doi.org/10.1080/22221751.2020.1784044

    20. Ruppitsch W., Pietzka A., Prior K., Bletz S., Fernandez H.L., Allerberger F., et al. Defining and evaluating a core genome multilocus sequence typing scheme for whole-genome sequence-based typing of Listeria monocytogenes. J. Clin. Microbiol. 2015; 53(9): 2869–76. https://doi.org/10.1128/JCM.01193-15


    Молочные и сывороточные белки (протеины). Преимущества и обзор биологической ценности.

    07.10.2020

    Что значит нативный белок

    Белок – это высокомолекулярный полимер, построенный из остатков аминокислот. Почти все белки формируются двадцатью протеиногенными аминокислотами, соединенными между собой пептидными связями.

    Нативный белок – это белок в исходном виде. Нативная структура белка определяется составом окружающего водного раствора и такими показателями окружения как pH, температура, ионная сила и тд. Незначительные изменения в этих показателях не ведут к радикальным метаморфозам в архитектуре белка, то есть не меняются его функциональные свойства и питательная ценность.

    Процесс денатурации белка

    В противовес процессам, не ведущим к структурным изменениям белков, процессы, значительно изменяющие эту структуру, но без разрушения пептидных связей, называются денатурирующими. Проблема денатурации белка в том, что денатурированный белок теряет часть своих функциональных возможностей и его питательная ценность снижается.

    На производстве денатурация обусловлена необходимостью изменения физических свойств белка. Например, при частичной термической денатурации повышаются эмульгирующие свойства соевого белка. В случае со всеми белками бобовых культур термическая денатурация значительно улучшает их усвоение, так как при высокотемпературной обработке инактивируется ингибитор трипсина.

    Часто полная денатурация требуется при производстве белковых напитков, потому что даже частично денатурированный белок вызывает флокуляцию (хлопьеобразование), в результате в процессе хранения образуется осадок, что недопустимо.

    Температура как денатурирующий фактор

    Наиболее распространенный способ денатурации белков, применяемый при переработке пищевых продуктов и их консервации, это тепловая обработка. В зависимости от температуры, длительности воздействия и типа белка такая обработка может менять свойства белка в разной степени. Поэтому не всегда белок, прошедший термообработку, становится денатурированным и теряет ряд биологических свойств.

    Например, глицинин из соевого белка при 2 °С агрегируется и осаждается, но при нагреве до комнатной температуры снова становится растворимым. Сывороточные глобулярные белки альфа-лактальбумин и бета-лактоглобулин из коровьего молока денатурируются при нагреве до 83 °С. А обезжиренное молоко при 4 °С диссоциирует казеин из казеиновых мицелл (то есть мицеллы распадаются на отдельные молекулы), что меняет их свойства относительно сычужной свертываемости.

    Нутритивные свойства и качество белка

    Белки различаются по биологической ценности. Эти различия определяются двумя факторами – содержание незаменимых (эссенциальных) аминокислот и степень усвояемости. Сочетание этих двух факторов создает понятие «качество белка».

    По современным стандартам высококачественным может считаться только белок, объем эссенциальных аминокислот в котором превышает эталонный уровень, установленный ФАО (Организация ООН по вопросам продовольствия и сельского хозяйства), УООН (Университет ООН) и ВОЗ (Всемирная организация здравоохранения). Также высококачественный белок по степени усвоения должен быть сопоставим или превосходить усвоение яичного или молочного белка. С этой точки зрения качество белков животного происхождения выше, чем качество растительных белков.

    Лимитирующие аминокислоты

    У большинства бобовых и зерновых культур белки лимитированы как минимум одной из незаменимых аминокислот. Например, рис, пшеница, ячмень и кукуруза богаты метионином, зато в них очень мало лизина. У бобовых и масличных наоборот – в их составе много лизина и недостаток метионина. А в арахисе мало и метионина и лизина. Такие аминокислоты, которых в конкретном белке меньше, чем в эталонном, называются лимитирующими. Важно, чтобы рацион содержал достаточное количество всех эссенциальных (незаменимых) аминокислот. В противном случае у взрослых людей могут развиваться патологии, а у детей до 12 лет замедляется рост.

    Лейцин, изолейцин, валин, гистидин и фенилаланин – это незаменимые кислоты, которые почти не бывают лимитирующими, то есть во всех видах белка, вне зависимости от происхождения, содержание этих аминокислот достаточное или даже избыточное. Лизин, треонин, триптофан и все серосодержащие аминокислоты становятся лимитирующими чаще всего. Сегодня достаточно легко исправить проблему лимитированных белков посредством их соединения с другими белками, богатыми аминокислотами, которые для исходного белка выступают лимитирующими. Например, эффективно комбинируются бобовые и зерновые белки. То есть рацион, в котором присутствуют белки обоих типов, будет содержать все незаменимые аминокислоты в объеме достаточном для обеспечения нормального роста и жизнедеятельности организма.

    Эту проблему можно решить не только правильным составлением рациона, но также на производстве посредством сапплементации – обогащения белка аминокислотой, которая для него является лимитирующей. Таким образом можно повысить биологическую ценность низкокачественного белка. Например, нутритивное качество бобовых повышается обогащением метионином, а злаковые соответственно обогащают лизином.

    Оптимальная биологическая ценность белка

    Оптимальной биологическая ценность белка считается в том случае, если в нем содержатся все незаменимые аминокислоты и их объем достаточен для обеспечения всех процессов роста в организме и прочих метаболических процессов на нормальном уровне.

    Сложность в том, что для каждого человека из любой категории населения оптимален свой суточный объем аминокислот, который определяется, исходя из физиологических показателей, режима дня, рациона, условий жизни и множества других факторов. ВОЗ и ФАО рекомендуют использовать универсальную норму, которая применяется для определения оптимальной биологической ценности белковой составляющей рациона у детей дошкольного возраста 2-5 лет.

    Слишком большое потребление аминокислот опасно тем, что приводит к «аминокислотному антагонизму», сопровождающемуся пищевым отравлением. Если в рационе чрезмерный объем одной аминокислоты, это приводит к дефициту других аминокислот, так как начинается конкурирование между ними за приоритет всасывания в кишечнике (то есть какие-то аминокислоты просто не будут успевать усваиваться).

    Например, если в рационе избыточный объем лейцина, он усваивается в кишечнике приоритетнее изолейцина, валина и тирозина. И даже если три эти аминокислоты присутствуют в рационе в достаточном объеме, возникает их дефицит, что также может приводить к задержке роста у детей и развитию патологических состояний у взрослых.

    Усвояемость и конформация белка

    Хотя объем эссенциальных аминокислот является превалирующим фактором, также для качества белка важна усвояемость – этот показатель отображает процент белка, который всасывается стенками кишечника. Например, для молока это 95%, а для риса 75%. Соответственно, для покрытия суточной нормы одних и тех же аминокислот нужен существенно больший объем рисового белка в сравнении с молочным (то есть "наесть" дневную норму потребление рисковым белком действительно сложно). В целом, белки животного происхождения усваиваются лучше, чем растительные белки.

    На производстве часто выполняется гидролиз белков протеазами (ферменты, расщепляющие пептидную связь между аминокислотами), степень этого воздействия зависит от структурного состояния белка. Нативные (неденатурированные) белки гидролизованы значительно меньше, чем денатурированные. Гидролизации практически не подвержены нерастворимые фибриллярные белки и глобулярные белки, которые уже полностью денатурированы.

    В качестве примера можно привести фазеолин (белок фасоли), который может быть подвергнут гидролизу протеазами и в этом случае будет расщеплен лишь частично с высвобождением полипептидов молекулярной массы до 22,000 Да. Но если фазеолин подвергнуть гидролизу протеазами при тепловой обработке, он полностью распадется до аминокислот и дипептидов.

    Факторы, снижающие биологическую ценность белка

    Большинство растительных белков в форме концентратов и изолятов содержат ингибиторы трипсина и химотрипсина. Эти вещества значительно замедляют процесс гидролиза белков из бобовых и масличных культур, а также препятствуют их полному гидролизу панкреатическими ферментами протеазами. Также эти растительные белки имеют в составе лектины (гликопротеины, «склеивающие» углеводы). Лектины связываются с клетками слизистой оболочки кишечника, что мешает проникновению аминокислот через кишечную стенку.

    Некоторые ингибиторы трипсина и химотрипсина (тип Баумана-Бирка) термостабильны, а другие (тип Кунитца) термолабильны (то есть неустойчивы к тепловому воздействию). Также термолабильны лектины. Это значит, что после прохождения тепловой обработки белки бобовых и масличных культур лучше усваиваются (даже лучше, чем изоляты нативных белков).

    В растительных белках содержатся таннины и фитаты, которые также снижают их биологическую ценность. Например, таннины препятствуют расщеплению полипептидов – процесс, который катализируется трипсином. Также скорость и полнота гидролиза белков снижается в процессе их взаимодействия с полисахаридами и пищевыми волокнами.

    Оценка биологической ценности белков

    Оценка биологической ценности белка для производителей необходима потому, что она позволяет выявить наиболее щадящие методы воздействия, при которых максимально сохраняется питательная ценность и функциональные свойства нативной формы (например – способность лакто-глобулина транспортировать Витамин D3 в кишечнике и свойство лактоферрина стимулировать развитие полезной микробиоты).

    Для конечного потребителя оценка биологической ценности белка тоже важна, она позволяет точно определить оптимальный объем того или иного белка (или их комбинации) в рационе, не допустив недостатка и «аминокислотного антагонизма» при избытке. Для проведения такой оценки используют рацион с содержанием белка 10% (по сухой массе) с обеспечением его энергетической ценности. В течение 9 дней показатели изменения массы тела замеряются и по итогу выводится коэффициент эффективности белка (PER) – это прибавка веса в граммах на 1 грамм потребленного белка.

    Другой показатель – коэффициент чистой эффективности белка (NPR), для его вычисления из показателя увеличения массы тела вычитается потеря массы из безбелковой группы и полученный результат делится на количество усвоенного белка. Показатель NPR отражает способность тестируемого белка эффективно поддерживать процессы роста и функционирования организма.

    Существуют и другие методы оценки биологической ценности белка, включая ферментативные и микробиологические. Например, белок можно лабораторно расщеплять пепсином, трипсином поджелудочной железы или панкреатином. Это позволяет оценить скорость и полноту усвояемости белка, а также выявить – произошли ли с ним какие-либо изменения в процессе промышленной переработки.

    Как пищевая ценность белков может меняться при промышленной переработке

    Существует несколько основных видов промышленной переработки белка – нагревание, замораживание, сушка, воздействие химическими реагентами, ферментация. Самый часто применяемый метод – теплообработка, которая нужна для инактивации микроорганизмов и эндогенных ферментов, вызывающих различные изменения в белках в процессе хранения (например, их окисление). Также термообработка необходима для улучшения органолептических свойств белка (вкуса и запаха).

    Еще один важный эффект от термической обработки – устранение аллергической реакции. Некоторые белки являются аллергенными, например – альфа-лактальбумин, бета-лактоглобулин и соевый белок. Но если они прошли обработку высокими температурами, возможные аллергические реакции и реакции гиперчувствительности устраняются. Проблема в том, что очень часто термообработка и другие методы денатурации негативно сказываются на пищевой ценности белка.

    Умеренная тепловая обработка

    Большинство пищевых белков частично денатурируются при умеренной тепловой обработке 60-90°С (длительность обработки – не более 60 минут). Этот процесс снижает растворимость белков и соответственно ухудшает зависящие от растворимости функциональные свойства. Однако с точки зрения качества белка частичная денатурация улучшает его усвояемость и биодоступность незаменимых аминокислот. Например, яичный белок и некоторые очищенные растительные белки отличаются недостаточной усвояемостью даже когда из них удаляются ингибиторы протеаз. Однако умеренная температурная обработка повышает этот показатель и при этом не образуются токсичные производные.

    Также при умеренной тепловой обработке помимо протеаз инактивируются липазы, липоксигеназы, амилазы, полифенолоксидазы и некоторые другие ферменты, активность которых при хранении может приводить к изменениям вкуса и цвета белка. Например, в белках масличных и бобовых культур содержится много липоксигеназы. Этот фермент опасен тем, что в присутствии кислорода он катализирует окисление полиненасыщенных жирных кислот до гидропероксидов. В результате, образуются альдегиды и кетоны, которые приводят к появлению постороннего вкуса у соевой муки и изолятов соевого белка. Но если перед измельчением семян или бобов липоксигеназа была инактивирована тепловой обработкой, изменение вкуса не происходит.

    Для растительных белков тепловая обработка полезнее, чем для белков животного происхождения, потому что в растительных белках много так называемых антиалиментарных веществ. Например, это уже упомянутые ингибиторы трипсина и химотрипсина, которые значительно снижают усвояемость белка и соответственно – его биодоступность. Опасность этих ингибиторов в том, что их деятельность проводит к повышенной выработке трипсина и химотрипсина, что может привести к гипертрофии и аденоме поджелудочной железы. Лектины, характеризующиеся высоким сродством с углеводами, не только ухудшают усвоение белка, с которым поступают, и снижают усвоение других нутриентов, но также являются фитогемагглютининами. Так называются вещества, которые приводят к агглютинации («слипанию») красных кровяных телец – эритроцитов.

    Так как все эти вещества, содержащиеся в растительных белках, термолабильны, температурная обработка решает указанные проблемы. Например, пропаривание соевой муки, обжарка бобов и семян масличных растений предупреждает гипертрофию поджелудочной железы и повышает коэффициент эффективности белка. Такие же вещества-ингибиторы содержатся в яичном и молочном белке. В яичном это овомукоид и овоингибитор, в молочном – ингибитор плазменогенового активатора (PAI) и ингибитор плазмина (PI). В присутствии воды при умеренной тепловой обработке эти ингибиторы инактивируются. Также инактивируются некоторые токсины, например – энтеротоксин, который продуцируется Золотистым стафилококком. При этом степень денатурации недостаточная, чтобы снизить функциональные свойства молочных белков.

    Специфика производства концентратов и изолятов белков

    Изоляты белка получают из исходно сырья различными методами – экстракция, изоэлектрическое осаждение, термокоагуляция, ультрафильтрация и дифильтрация. Часть белков может теряться при некоторых методах, например – богатые серой альбуминопободные белки при изоэлектрическом осаждении могут оставаться в супернатанте (то есть в надосданой жидкости). Это значит, что часть нативных белков не войдет в конечный продукт, соответственно – изменяется аминокислотный состав и снижается биологическая ценность изолята по сравнению с исходным сырьем.

    Однако, например, в сывороточных концентратах, которые производятся методом ультрафильтрации и диафильтрации, аминокислотный состав не меняется. В таком случае не меняются физические и функциональные свойства белков (в частности – глобулярных белков концентратов молочной сыворотки). Однако меняется их протеозопептонный состав, как результат – меняются пенообразующие свойства.

    Химические изменения аминокислот

    В отличие от низкотемпературной обработки, которая может только изменять свойства белка, высокотемпературная обработка запускает ряд процессов, происходящих непосредственно с аминокислотами. Это процессы рацемизации, гидролиза, десульфурации (потеря серы) и дезамидирования. Почти все они необратимы, но опасность заключается в том, что при некоторых из них могут образовываться структурно-модифицированные типы аминокислот, проявляющие токсичность.

    Потенциальная опасность некоторых процессов денатурации

    При высокотемпературной обработке белков в условиях щелочных значений pH происходит частичная рацемизация, в процессе которой остатки L-аминокислот превращаются в остатки D-аминокислот. Также рацемизация возможна при реакции гидролиза и при нагреве белка до 200 °С. Негативная сторона этого процесса в том, что пептидные связи между D-аминокислотами меньше подвержены ферментативному гидролизу, чем пептидные связи L-аминокислот. То есть такой белок усваивается хуже. Кроме того, в процессе рацемизации частично теряются незаменимые аминокислоты и снижается биологическая ценность белка.

    Также тепловая обработка в щелочной среде помимо рацемизации приводит к разрушению аргинина, серина, треонина, лизина (например, аргинин разлагается до орнитина). При нагреве до 200 °С разлагается большинство аминокислотных остатков. Такой нагрев возможен не только на производстве, но и в быту, пример – готовка мяса на гриле. Опасность обработки белка такими температурами в том, что пиролиз (разложение) аминокислотных остатков приводит к образованию ряда продуктов, для которых тест Эймса показал высокую мутагенность. Наиболее мутагенные и канцерогенные аминокислотные остатки образуются при пиролизе триптофана и глутаминовой кислоты.

    Мутагенные соединения, образующиеся в мясе при высоких температурах, называются имидазохинолинами. Это продукты общей конденсации углеводов, креатина и одной или нескольких аминокислот – глицина, треонина, аланина, лизина.

    Также в процессе обработки белков в щелочной среде могут образовываться так называемые «сшивки» между молекулами и внутри молекул. Опасность процесса в том, что, например, лизиноаланиновая сшивка не может быть расщеплена трипсином, соответственно эти аминокислоты не усвояется. Поэтому образование сшивок снижает усвояемость и биологическую ценность белка. Однако проблема шире, потому что лизиноаланиновая сшивка не дает усваиваться рядом находящимся молекулам. При этом сам лизиноаланин всасывается стенками кишечника, но не усваивается организмом и выводится с мочой. Таким образом, при обработке белка в щелочной среде важно минимизировать количество лизиноаланина, хотя для человека появление таких сшивок не дает нефротоксического эффекта (такой эффект отмечен у мышей).

    При переработке молока даже при нейтральной среде pH высокие температуры приводят к образованию лизиноаланина. Для подавления этого процесса вводят цистеин, аммиак или сульфиты. Наиболее безопасный вариант – вообще не обрабатывать молочный белок при высоких температурах, оставляя его нативным. В этом случае лизиноаланина либо нет вообще, либо его количество незначительно. Также в этом случае белок сохраняет высокую усвояемость и биологическую ценность (соответственно – имеет высокое качество).

    В каких условиях меняются функциональные свойства белков

    Небольшая денатурация (например – обработка при умеренных температурах) обычно желательна для белков, потому что таким образом обеспечивается необходимый уровень растворимости, благодаря которому белок можно использовать по назначению. Более того – в некоторых случаях частичная денатурация может улучшить функциональные свойства конечного продукта. Но некоторые способы и технологии изоляции (выделения) белка ухудшают его свойства.

    Например, если белок изолируется методом изоэлектрического осаждения, структуры большинства глобулярных белков остаются стабильны, но если в белках есть пустоты (типа казеиновых мицелл), то они необратимо дестабилизируются. В результате коллапса (сжатия) мицеллярной структуры меняются ее свойства, что обусловлено в том числе изменением состава изолята по сравнению с исходным белком. Это объясняется тем, что часть фракций белка выпадает в осадок и не попадает в конечный изолят.

    В производстве концентратов сывороточных белков и изолятов сывороточных белков чаще всего применяется метод ультрафильтрации, в ходе которой удаляются мелкие растворенные примеси, что влияет в большей степени на изменение небелкового состава конечного продукта. Удаление лактозы и золы меняет функциональные свойства белка, а при выдерживании ультрафильтрованного концентрата при температура 50-55 °С усиливается взаимодействие «белок-белок», в результате чего меняется влагосвязывающая способность, гелеобразование, пенообразование и эмульгирующие свойства. При этом у изолятов, полученных методом ионного обмена, ниже зольность (содержание кальция и фосфатов), поэтому его функциональные свойства лучше, чем у изолятов, полученных методами фильтрации.

    Выдерживание белков при щелочной pH сильно меняет их аминокислотный состав, зато они лучше растворяются. Также для экстрагирования могут применяться химические реагенты, например – для экстрагирования соевого и хлопкового масла применяют гексан (насыщенный углеводород). Такая обработка приводит к денатурации, как и высокотемпературная обработка.

    Почему для повышения питательной ценности рациона предпочтительнее нативный белок

    На производстве белки часто полностью или частично денатурируются, что может существенно менять их качество, влияя на аминокислотный состав и усвояемость. Зачастую это необходимо для решения технических задач – улучшения растворимости, пенообразования, эмульгирования конечного продукта. Однако в контексте употребление белков в форме добавок для повышения питательной ценности рациона предпочтительнее неденатурированные (нативные белки), то есть белки, которые не были подвергнуты денатурации.

    В качестве примера можно привести концентраты и изоляты сывороточных белков, которые получают методом ультрафильтрации и диафильтрации, то есть речь идет о чисто механической обработке без применения химических реагентов, высоких температур и иных технологий, которые могут существенно изменить структуру нативного белка и его свойства. В таком случае обеспечивается максимальная питательная ценность получаемого продукта, а глобулярные белки сохраняют свои свойства. Глобулярные белки – это группа белков, которые представляют собой полипептидные цепи, свернутые в шары (глобулы).

    В нативных молочных белках содержатся следующие глобулярные белки – бета-лактоглобулин, альфа-лактальбумин, иммуноглобулины, альбумин сыворотки крови, гликомакропептиды, лактоферрин. Если эти глобулярные белки сохраняют нативную форму (не подвергаются денатурации), они выступают естественным источником всех незаменимых аминокислот без лимитирующих аминокислот, причем на аминокислоты с разветвленной боковой цепочкой приходится около 21% аминокислотного состава белка. Глобулярные белки необходимы для обеспечения транспорта нутриентов в кишечнике (например, транспорт Витамина D3 невозможен без бета-лактальбумина).

    Глобулярные белки оказывают антиоксидантное действие, подавляя активность свободных радикалов кислорода, разрушающих здоровые клетки. Эти белки необходимы для работы иммунной системы, для нейтрализации патогенов, токсинов, ядов и чужеродных белков. Они обеспечивают защиту кишечной стенки, подавляют развитие патогенной кишечной микрофлоры и стимулируют полезную микробиоту, включая лактобактерии и бифидобактерии. Гликомакропептиды активируют выработку холецистокинина (нейропептидный гормон, обеспечивающий чувство насыщения), альбумин сыворотки крови является источником железа (профилактика анемии), а лактоферрин оказывает противоопухолевую активность.

    При денатурации молочных белков все или почти все свойства глобулярных белков теряются, снижается объем BCAA и других незаменимых аминокислот. Именно поэтому применительно к сывороточным концентратам и изолятам для повышения питательной ценности рациона предпочтительнее нативный белок, сохраняющий исходно высокое качество.

    Источники


    НАТУРАЛЬНЫЙ СЫВОРОТОЧНЫЙ ИЗОЛЯТ+ | BioSteel – спортивное питание

    НОВОЕ ПРЕВОСХОДНОЕ СОЧЕТАНИЕ НЕ СОДЕРЖАЩИХ ГОРМОНОВ ИЗОЛЯТА, КОНЦЕНТРАТА И ГИДРОЛИЗАТА БЕЛКА ИЗ СЫВОРОТКИ ДЛЯ НЕПОСРЕДСТВЕННОГО И ОТСРОЧЕННОГО ВЫДЕЛЕНИЯ, БЕЗ КАКИХ-ЛИБО ИСКУССТВЕННЫХ ИНГРЕДИЕНТОВ

    Высококачественная композиция с изолятом белка предназначенная для:

    • увеличения интенсивности синтеза мышечного белка, ведущего к увеличению сухой массы тела, уменьшению жировых отложений и повышению результативности
    • обеспечения организма белком высочайшего качества и максимальной биологической доступности в правильных дозах для максимального увеличения результативности.

    BioSteel Sports™ — это единственное решение для спортсменов, не принимающих допинг и ищущих пищевые добавки высочайшего качества. Добавка действительно не содержит даже следов каких-либо запрещенных веществ, потому что каждая партия независимо проверяется лабораторией, одобренной ВАДА. Благодаря низкому содержанию углеводов и жиров, а также высокому содержанию белков,

    данная композиция — это идеальное решение для тех, кто придерживается низкокалорийных диет или диет с ограниченным количеством углеводов. Изначально добавка предназначалась для спортсменов мирового уровня, поэтому в отношении ингредиентов и положительного воздействия на здоровье компромиссные решения не рассматривались.

    ДОСТУПНЫЕ РАЗНОВИДНОСТИ:

    СЛИЯНИЕ ЯГОД
    ЛИМОН ЛАЙМ
    АПЕЛЬСИН
    ГОЛУБАЯ МАЛИНА

    ДОСТУПНЫЕ РАЗНОВИДНОСТИ:

    ШОКОЛАД
    ВАНИЛЬ

    ИНГРЕДИЕНТЫ (1 мерная ложка 29 г):


    БЕЛКОВАЯ КОМПОЗИЦИЯ (24 г) Изолят белка из сыворотки, концентрат белка из сыворотки, гидролизованный изолят белка из сыворотки
     
    АМИНОКИСЛОТЫ, ВСТРЕЧАЮЩИЙСЯ В ПРИРОДЕ: Шоколад 23304 мг / Ваниль 23726 мг L-аланин, L-аргинин, L-аспарагиновая кислота, Lцистин, L-глутамин, L-глицин, L-гистидин, Lизолейцин, L-лейцин, L-лицин, L-метионин, Lфенилаланин, L-пролин, L-серин, L-треонин, Lтриптофан, L-тирозин, L-валин
     
    НЕЛЕКАРСТВЕННЫЕ ИНГРЕДИЕНТЫ: Экстракт из листьев стевии, ксантановая камедь, подсолнечный лецитин, (порошок какао, натуральный шоколадный ароматизатор, натуральный ванильный ароматизатор)
     

    РЕКОМЕНДАЦИИ ПО УПОТРЕБЛЕНИЮ:

    Разбавьте 1 мерную ложку добавки в 250—500 мл холодной воды или напитка по выбору. От количества жидкости будет зависеть вкус и консистенция.
     

    ПИЩЕВАЯ ЦЕННОСТЬ (1 МЕРНАЯ ЛОЖКА, 6,5 г):

    • ККАЛ120
    • ВСЕГО ЖИРОВ1 г
    • НАСЫЩЕННЫЕ ЖИРЫ0,5 г
    • ТРАНС ЖИРЫ0 г
    • ХОЛЕСТИРИН30 мг
    • БЕЛОК24 г
    • ВСЕГО УГЛЕВОДОВ3 г
    • САХАРА1 г
    • ПИЩЕВЫЕ ВОЛОКНА1 г
    • НАТРИЙ90 мг
    • КАЛИЙ190 мг
    • КАЛЬЦИЙ110 мг
    • ЖЕЛЕЗО1 мг
    * Сведения о разновидности «Шоколад»

    Power System - WHEY ISOLATE PROTEIN ― Центр современных спортивных технологий.


    WHEY ISOLATE PROTEIN – БИОАКТИВНЫЙ ИЗОЛЯТ НОВОГО ПОКОЛЕНИЯ

    ИЗОЛЯТ СЫВОРОТОЧНОГО ПРОТЕИНА (ВАНИЛЬ, КЛУБНИКА, НЕЙТРАЛЬНЫЙ).

    Номер свидетельства и дата: 77.99.19.4.У.10241.12.08 от 05.12.2008

    ЧТО ЭТО: WHEY ISOLATE – биоактивный изолят молочной сыворотки, полученный из контролируемого сырья наивысшего немецкого качества (sweet dairy whey) путем холодного процесса CFM ультрафильтрации, микрофильтрации и фракционирования. WHEY ISOLATE содержит в исходной сухой сыворотке 98-99% протеина. WHEY ISOLATE обладает наивысшей биологической ценностью и имеет великолепные естественные вкусы. WHEY ISOLATE создан по самую передовую немецкой технологии, и не содержит ионообменных и денатурированных белков.

    ДЛЯ ЧЕГО ЭТО НУЖНО: WHEY ISOLATE – биоактивный сывороточный изолят высочайшей концентрации и биологической ценности. Предназначен для самых продвинутых спортсменов и служит для интенсивного синтеза сухой мышечной массы, а также для восстановления, особенно в период подготовки к соревнованиям. Легко и быстро усваивается, служит источником энергии, ВСАА и незаменимых аминокислот. WHEY ISOLATE содержит натуральные биоактивные элементы, поддерживает иммунную систему, усиливает защитные силы организма, улучшает пищеварение, контролирует аппетит.

    КАК ЭТО РАБОТАЕТ: Уникальные свойства WHEY ISOLATE достигаются в результате использования лучшего из возможных сырья ”sweet dairy whey” немецкого контролируемого происхождения и применения самой передовой технологии производства - низкотемпературной CFM ультра и микрофильтрации с последующим фракционированием. Это позволяет получить лучший из возможных продуктов в своем классе, избежать потери биологически активных фракций сывороточного белка, его денатурирования (повреждения) и сохранить всю его силу как пищевого компонента и пробиотика. В WHEY ISOLATE не используется ионообменный протеин, поскольку он лишает продукт ценных составляющих и естественных пропорций. WHEY ISOLATE обеспечивает максимально быстрое насыщение крови ВСАА и другими свободными аминокислотами до высочайшего уровня и снабжает организм пробиотиками. Это обеспечивает максимальную эффективность WHEY ISOLATE как источника энергии, ВСАА и аминокислот, для высокой работоспособности, для синтеза мышечной ткани, для быстрого восстановления. Повышенное содержание альфа-лактальбумина, лактоферрина, иммуноглобулинов и гликомакропептидов, являющихся пробиотиками, делает WHEY ISOLATE биоактивным, то есть имеющим свойства активной защиты организма спортсмена в условиях интенсивных тренировок. Эти фракции способствуют отличному усвоению продукта, помогают контролировать аппетит, усиливают защитные силы организма, снижают риск развития вирусных и бактериальных инфекций, улучшают пищеварение и усвоение белка, а также кальция, способствуют развитию бифидобактерий - дружелюбной флоры кишечника.

    СОСТАВ:99 % изолят сывороточного белка, ароматизатор, соль, краситель бета-каротин, подсластители*, растительное масло, витамин В6.
    *для вкусов клубника и ваниль

    АМИНОКИСЛОТНЫЙ СОСТАВ:

    Аминокислоты:

    В 100гр

    Аминокислоты:

    В 100гр

    Изолейцин
    Лейцин
    Лизин
    Метионин
    Фенилаланин
    Треонин
    Триптофан
    Валин
    Аргинин
    6,0 г
    9,8 г
    8,9 г
    2,1 г
    2,9 г
    6,3 г
    1,3 г
    5,5 г
    2,0 г
    Цистин
    Гистидин
    Тирозин
    Аланин
    Аспарагиновая кислота
    Глутаминовая кислота
    Глутамин
    Глицин
    Пролин
    Серин
    2,1 г
    1,6 г
    2,4 г
    4,7 г
    10,3 г
    16,8 г
    6,8 г
    1,3 г
    5,1 г
    4,3 г

     

    Изолят сывороточного протеина 95% Lactalis Prolacta 95 (Франция.)

    Изолят сывороточного белка Prolacta 95 – это высококачественный белок с наивысшей биологической ценностью. Он обеспечивает организм необходимыми строительными кирпичиками, которые необходимы организму для синтеза аминокислот, которые, в свою очередь, необходимы для строительства мышечной массы.

    Благодаря современным методам фильтрации, изолят сывороточного протеина, как правило, менее аллергенный, чем концентраты, сухое молоко или другие молочные продукты. Поэтому данная спортивная добавка является оптимальным выбором для атлетов с непереносимостью лактозы.

    Сывороточный изолят Prolacta 95 - это чистый(сырьевой) протеин, именно на основе этого продукта производиться детское и спортивное питание. Это чистый продукт, на 100 гр. приходиться не менее 95 гр. животного, высоко усвояемого белка. Это отличное решение для спортсменов нуждающихся в большом количестве белка, не желающих ограничивать себя, стремящихся только вперед! 

    Prolacta по праву признана самым качественным сывороточным белком, так как производится на прямую из молока, а не цедится из сыворотки как прочие. Это позволило достичь пыльной и мелкой фракции, что говорит о максимальном усвоении и высокой биологической ценности, кроме того продукт легко размешивается и обладает отличным аминопрофилем с большим содержанием лейцина.

    В 2001 г. компания Lactalis International опубликовала международный патент на изобретение качественного белка Prolacta. Впервые в качестве источника получения белка использована не молочная сыворотка, а непосредственно молоко. С помощью мембранных технологий сывороточные белки напрямую экстрагируются из сепарированного молока без применения высокой температуры, химического и ферментативного воздействия, сопряженных в процессе производства с получением молочной сыворотки. 

     

    Полностью сохраняя нативные свойства, Prolacta является изолятом белка высокого качества, полученного в условиях мягкой обработки, избегая денатурации в структуре белка как следствия воздействия на него высоких температур и потери биологической активности. Известным фактом остается, что большинство белков теряют биологическую ценность при воздействии на них кислот и высоких температур, избежать которых сложно при 99 производстве молочной сыворотки для детского питания традиционным способом.

    Химический состав:

    Белок в сухих веществах мин. 95,0%
    Углеводы макс. 1,2%
    Жир макс. 0,4%

    Способ применения: Смешайте 30-35 грамм белка (2 ст. ложки с горкой) развести на 300-350 мл молока или воды, можно также добавить сироп или какао для придания вкуса.Принимать протеин рекомендуется утром после сна перед завтраком, между приемами пищи и в течении 30 минут после тренировки.

    Ученый из МФТИ раскрыл процесс создания вакцины от коронавируса

    Об эксперте: Павел Волчков — кандидат биологических наук, вирусолог, генетик, заведующий Лабораторией геномной инженерии Московского физико-технического института (МФТИ).

    Существует много разных подходов к созданию вакцины от COVID-19. Она может быть вирусной, инактивированной, векторной, на основе нуклеиновых кислот. Какая из них окажется самой эффективной — пока никто точно не знает. Если вы разработчик, то можете выбрать любую и принять участие в большой мировой гонке по созданию долгожданной прививки. А можете, как ученые из МФТИ, сознательно отказаться от возможных бенефитов и неспешно заняться разработкой экспериментальной вакцины нового типа.

    Одни из самых популярных на сегодняшний день — это рекомбинантные или векторные вакцины. Они изготавливаются на основе вирусов-носителей или вирусных векторов. Как это работает? Вы берете какие-то вирусные частицы, «вычищаете» из них все патогенные составляющие и на их место вставляете нужные вам элементы — генетический материал вируса, против которого изготавливается вакцина. По такому принципу была создана прививка от вирусного гепатита B или ротавирусной инфекции. И по такому же принципу сегодня многие разработчики создают вакцину от COVID-19. В частности, в России векторную вакцину от коронавируса разработали в НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи.

    Павел Волчков:

    «Чем хорош вирусный вектор? Он способен инфицировать клетки только один раз и не может размножаться в организме человека дальше. Такая особенность делает рекомбинантные вакцины довольно безопасными. При этом в качестве вирусного вектора можно использовать буквально любой вирус из библиотеки человеческих патогенов. Выбор зависит от того, для какого заболевания вы изготавливаете вакцину. Потому что одни вирусы лучше заражают мышцы, другие — легкие, третьи — центральную нервную систему. Например, та же вакцина Центра Гамалеи выполнена на аденовирусном векторе».

    Аденовирусы — ДНК-вирусы. Относятся к группе острых респираторных вирусных инфекций (ОРВИ) и характеризуются поражением слизистых оболочек верхних дыхательных путей, конъюнктив, лимфоидной ткани. Большинство аденовирусных инфекций представляют собой легкую форму инфицирования. Существует семь видов аденовирусов человека (от А до G) и 57 серотипов. Подразделение на серотипы связано с различными способами заражения.

    Аденовирус под микроскопом (Фото: Wellcome Images)

    В качестве векторов для вакцин, аденовирусы применяются довольно давно. Эти вирусы хорошо изучены. Согласно данным сайта ClinicalTrials.gov, клинические испытания на людях успешно прошли или проходят более сотни различных вакцин на основе аденовирусных векторов.

    Среди главных преимуществ этих вирусов — их естественный механизм взаимодействия с клетками человека. Они способны обеспечивать довольно длительную экспрессию антигена, а это успешно активирует врожденный иммунный ответ.

    Антигены — это любые вещества, содержащиеся в микроорганизмах и других клетках (или выделяемые ими), которые несут в себе признаки генетически чужеродной информации, и которые потенциально могут быть распознаны иммунной системой организма.

    Павел Волчков:

    «При всех плюсах, у аденовирусов есть и ряд минусов. Первое — они обладают провоспалительным эффектом. То есть могут чрезмерно драйвить иммунную систему. Проще говоря — вызывать сильный иммунный ответ. Это один из возможных побочных эффектов вообще всех аденовирусных вакцин. Но есть еще один нюанс. Большинство аденовирусов — это естественные патогены человека. Многие из нас сталкивались в течение жизни с аденовирусными инфекциями. А что это значит? Что в крови у таких людей уже есть нейтрализирующие антитела к этому вирусу. Они могут связываться с компонентами вакцины и блокировать ее действие. Поэтому для некоторых из нас такая вакцина будет совершенно неэффективна».

    Пять типов изоляции в биологии

    В области биологии «изоляция» описывается как процесс, с помощью которого два вида, которые в противном случае могли бы произвести гибридное потомство, не могут этого сделать. Существует пять процессов изоляции, которые предотвращают скрещивание двух видов: экологический, временной, поведенческий, механический / химический и географический.

    TL; DR (слишком долго; не читал)

    Существует пять типов изоляции, которые биологически предотвращают виды, которые в противном случае могли бы скрещиваться с получением гибридного потомства.Это экологические, временные, поведенческие, механические / химические и географические.

    Экологическая изоляция

    Экологическая изоляция, или среда обитания, происходит, когда два вида, которые могут скрещиваться, не могут скрещиваться, потому что эти виды живут в разных районах. Например, в Индии и лев, и тигр существуют и способны к скрещиванию; однако лев живет на лугах, а тигр - в лесу. Эти два вида живут в разных средах обитания и не будут сталкиваться друг с другом: каждый изолирован от другого вида.

    Временная изоляция

    Временная изоляция - это когда виды, которые могут скрещиваться, не могут скрещиваться, потому что разные виды размножаются в разное время. Эта временная разница может возникать в разное время суток, в разное время года или в другое время. Например, полевые сверчки Gryllus pennsylvanicus и G. veleti становятся половозрелыми в разное время года: один весной, а другой осенью.

    Поведенческая изоляция

    Поведенческая изоляция относится к тому факту, что многие виды выполняют разные брачные ритуалы.Это общий барьер между животными. Например, некоторые виды сверчков спариваются только с самцами, которые воспроизводят определенную песню для спаривания. Ритуалы других видов могут включать брачный танец или испускание аромата. Эти подсказки игнорируются видами, не привыкшими к ритуалу.

    Механическая или химическая изоляция

    Механическая изоляция вызывается структурами или химическими барьерами, которые удерживают виды изолированными друг от друга. Например, у цветущих растений форма цветка будет соответствовать форме естественного опылителя.Растения, не имеющие правильной формы для опылителя, не получат переноса пыльцы. Точно так же определенные химические барьеры препятствуют образованию гамет. Эти химические барьеры позволяют оплодотворять яйцеклетку только сперматозоидам правильного вида.

    Географическая изоляция

    Географическая изоляция относится к существующим физическим барьерам, которые не позволяют двум видам спариваться. Например, один вид обезьяны, который находится на острове, не может размножаться с другим видом обезьяны на материке.Вода и расстояние между двумя видами держат их изолированными друг от друга и делают невозможным их размножение.

    3: Выделение и анализ генов

    1. Последнее обновление
    2. Сохранить как PDF
    1. Авторы и авторства

    Первые две главы охватывали многие важные аспекты генов, такие как то, как они функционируют при наследовании, как они кодируют белок (в общих чертах) и их химическую природу.Все это было изучено без очистки ни одного гена. Полное понимание гена или всего набора генов в геноме требует их выделения и затем интенсивного изучения. Когда ген оказывается «в руках», в принципе можно определить как его биохимические структуры, так и его функцию (функции) в организме. Одна из целей биохимии и молекулярной генетики - придать особые функции отдельным или составным структурам. В этой главе рассматриваются некоторые методы, обычно используемые для выделения генов, и показаны некоторые анализы, которые можно провести с изолированными генами.

    • 3.1: Рекомбинантная ДНК, полимеразная цепная реакция и приложения к структуре и функции эукариотических генов
    • 3.2: Обзор технологии рекомбинантной ДНК
    • 3.3: Введение рекомбинантной ДНК в клетку и репликация: векторы
      Векторы, используемые для перемещения ДНК между видами или из лабораторного стола в живую клетку, должны отвечать трем требованиям: (1) Они должны автономно реплицировать молекулы ДНК в клетке-хозяине.(2) Они должны содержать селектируемый маркер, чтобы клетки, содержащие рекомбинантную ДНК, можно было отличить от тех, которые не содержат. (3) У них должен быть сайт вставки для размещения чужеродной ДНК. Обычно уникальный сайт рестрикционного расщепления в несущественной области векторной ДНК.
    • 3.4: Введение рекомбинантной ДНК в клетки-хозяева
    • 3.5: Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
      Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в настоящее время является одним из наиболее часто используемых анализов для получения конкретный сегмент ДНК или РНК.Это быстро и чрезвычайно чувствительно. Путем амплификации определенного сегмента ДНК он предоставляет средства для выделения этого конкретного сегмента ДНК или гена. Этот метод требует знания нуклеотидной последовательности на концах области, которую вы хотите амплифицировать.
    • 3,6: кДНК
      Конструирование клонов кДНК включает синтез комплементарной ДНК из мРНК и затем вставку ее дуплексной копии в вектор клонирования с последующей трансформацией бактерий.
    • 3.7: Клоны геномной ДНК
      Клоны геномной ДНК, содержащие отдельные фрагменты хромосомной ДНК, необходимы для многих целей
    • 3.8: Структура эукариотического гена
      Многое можно узнать о любом гене после того, как он был выделен методами рекомбинантной ДНК. Можно определить структуру кодирующих и некодирующих областей, последовательность ДНК и многое другое. Это верно для бактериальных и вирусных генов, а также для генов эукариотических клеток.Следующие разделы этой главы будут сосредоточены на анализе эукариотических генов, демонстрирующем возможности изучения очищенных копий генов.
    • 3.9: Интроны и экзоны
      С помощью анализа геномных последовательностей ДНК было обнаружено (или, точнее, предсказано) гораздо больше экзонов и интронов, чем можно было бы открыть прямым экспериментом. Различные типы экзонов, огромная длина интронов и другие факторы усложнили задачу поиска надежных диагностических сигнатур экзонов в геномных последовательностях.Однако в текущих исследованиях был достигнут и продолжается значительный прогресс.
    • 3.10: Функциональный анализ изолированных генов
    • 3.E: Выделение и анализ генов (упражнения)

    Участники и атрибуция

    методов изоляции ДНК | Encyclopedia.com

    Выделение дезоксирибонуклеиновой кислоты ( ДНК ) - это процесс экстракции ДНК из различных источников.Методы, используемые для выделения ДНК, зависят от источника, возраста и размера образца. Несмотря на большое разнообразие используемых методов, между ними есть некоторые сходства. В общем, они стремятся отделить ДНК, присутствующую в ядре клетки, от других клеточных компонентов.

    Выделение ДНК необходимо для генетического анализа, который используется в научных, медицинских или судебных целях. Ученые используют ДНК в ряде приложений, таких как введение ДНК в клетки, животных или растения, или в диагностических целях.В лекарстве последнее применение является наиболее распространенным. С другой стороны, судебной медицине необходимо восстановить ДНК для идентификации лиц (например, насильников, мелких воров, несчастных случаев или жертв войны), определения отцовства и идентификации растений или животных.

    Присутствие белков, липидов, полисахаридов и некоторых других органических или неорганических соединений в препарате ДНК может мешать методам анализа ДНК, особенно полимеразной цепной реакции ( ПЦР ).Они также могут снизить качество ДНК, что приведет к сокращению срока ее хранения.

    Источники выделения ДНК очень разнообразны. В основном его можно изолировать от любого живого или мертвого организма. Общие источники для выделения ДНК включают цельную кровь , , волосы, сперму , кости, ногти, ткани, пятна крови, слюну, , щечные (щечные) мазки, эпителиальные клетки, мочу, бумажные карточки, используемые для сбора образцов, бактерии, ткани животных или растения.

    Совершенно очевидно, что методы экстракции должны быть адаптированы таким образом, чтобы они могли эффективно очищать ДНК из различных источников.Еще один важный фактор - размер выборки. Если образец небольшой (например, сперма или единственный волос), метод должен отличаться от метода, используемого для выделения ДНК из пары миллиграммов ткани или миллилитров крови. Другой важный фактор - свежая проба или хранившаяся. Сохраненные образцы могут быть взяты из архивных образцов тканей, замороженной крови или ткани, эксгумированных костей или тканей, а также образцов древних людей, животных или растений.

    Выделение ДНК обычно начинается с лизиса или разрушения ткани или клеток.Этот процесс необходим для разрушения белковых структур и позволяет высвобождать нуклеиновые кислоты из ядра. Лизис проводится в солевом растворе, содержащем детергенты для денатурирования белков или протеаз (ферментов, переваривающих белки), таких как протеиназа К, или, в некоторых случаях, обоих. Это приводит к разрушению клеток и растворению мембран.

    Хотя лизис мягких тканей или клеток прост, ДНК также необходимо изолировать от твердых тканей, таких как кости, древесина и различные растительные материалы.Большинство образцов растений требуют замораживания в жидком азоте и последующего измельчения тканей в мелкий порошок. С другой стороны, кости сильно минерализованы, и ионы необходимо удалить из образцов перед экстракцией, чтобы они позже не мешали ПЦР. После частичной обработки образцов их гомогенизируют в буфере для лизиса с помощью механического гомогенизатора.

    Выделение ДНК - это простой процесс, который можно выполнить на кухне с использованием бытовой техники и химикатов.Овощи или мясо можно гомогенизировать с солью и водой. После этого с помощью моющего средства клеточные белки и липиды отделяются от ДНК. Ферменты, содержащиеся в размягчителе мяса или ананасовом соке, позволяют осаждать белки и свободную ДНК в раствор. При добавлении спирта в смесь нуклеиновая кислота поднимается на верхнюю часть контейнера и может быть намотана на палочку в виде видимой белой нити.

    В ряде коммерческих наборов для очистки ДНК используются те же принципы, что и в этом домашнем методе, но с другими реагентами.Обычные лизирующие растворы в коммерческом наборе содержат: хлорид натрия; трометамин (также известный как Трис), который представляет собой буфер для поддержания постоянного pH; этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), связывающая ионы металлов; и додецилсульфат натрия (SDS), который является детергентом. Обычным ферментом, используемым при экстракции ДНК, является протеиназа К.

    . Самые старые методы очистки ДНК в лабораториях, все еще часто используемые FBI , основаны на смеси органических растворителей. Лизированные образцы смешивают с фенолом, хлороформом и изоамиловым спиртом для разделение ДНК и белка.Белки денатурируются органической смесью. Когда образец центрифугируется, ДНК остается в водном (водном) слое, фенол находится на дне пробирки, а денатурированные белки образуют мутную поверхность раздела. Этот метод очень эффективен, но, к сожалению, его можно использовать только в том случае, если количество исходного материала достаточно много. Кроме того, используемые органические растворители создают проблемы для здоровья и безопасности. Качество ДНК в результате этой процедуры обычно не подходит для некоторых более чувствительных аналитических методов (особенно , секвенирование и иногда ПЦР).

    Модификация метода использует высокую концентрацию соли (хлорид натрия, NaCl) для снижения уровня ДНК. После денатурации клеточных белков с использованием детергентов и протеазы в течение нескольких часов или в течение ночи добавляют соль и смешивают с раствором. В результате образуется соль нуклеиновой кислоты, которую в присутствии спирта можно выделить центрифугированием.

    Иногда щелочная денатурация образца используется для высвобождения ДНК из клеток. Буккальные мазки и иногда пятна крови можно поместить в небольшие пластиковые пробирки (эппендорф) и подвергнуть денатурации гидроксидом натрия (NaOH).Затем раствор повторно уравновешивают до нейтрального pH более кислым буферным раствором и готов к ПЦР. Хотя это быстрый и простой метод, качество ДНК не всегда подходит для всех приложений.

    Метод, аналогичный щелочной денатурации, - это тепловая денатурация, достигаемая путем кипячения образцов. Нагревание образца до 100 ° C высвобождает ДНК в раствор, но также денатурирует его, разделяя две цепи. В некоторых случаях эта процедура дает адекватную нуклеиновую кислоту, которую можно амплифицировать с помощью ПЦР, однако большую часть времени остаются ингибиторы в виде деградированных белков, других органических соединений или ионов.

    В родственном методе, обычно используемом в лабораториях судебной экспертизы, используется ионообменная смола Chelex, которая связывает ионы многовалентных металлов и особенно полезна для удаления ингибиторов из ДНК. Его можно использовать с любым типом пробы, включая цельную кровь, пятна крови, семенные пятна, щечные мазки или волосы. Единственное отличие от предыдущего метода - наличие смолы, которая связывает примеси из раствора, в то время как ДНК остается в растворе. Путем центрифугирования образцов смола превращается в осадок и отделяется.

    Другой метод, похожий на Chelex, основан на использовании парамагнитных шариков с ДНК-связывающей способностью. Образцы лизируют, а затем твердый материал обрабатывают протеиназой К. Затем лизаты наносят на шарики. Затем смолу промывают и ДНК элюируют из нее при 65 ° C, магнитные шарики отделяют от образца на магнитной подставке.

    Другие методы очистки ДНК включают колонки различного типа, которые заполнены ионообменными смолами или матрицами на основе диоксида кремния.Ионообменные колонки обычно заряжены положительно для связывания отрицательно заряженной ДНК; Матрицы из диоксида кремния также заряжены и также могут удерживать ДНК. В таких случаях ожидается, что ДНК из клеточных лизатов будет связываться с колонкой. Затем эти колонки промывают солевыми растворами для удаления несвязанного материала. Затем нуклеиновую кислоту регенерируют, применяя воду или раствор соли с нейтральным pH, чтобы разрушить связь смола-ДНК.

    Использование колонок позволяет увеличить количество образцов, сократить время выделения по сравнению с традиционной экстракцией на основе растворителя, увеличить выход восстановленной ДНК и улучшить качество очищенной ДНК.

    Помимо колонок и ранее описанных смол, используются также жидкие смолы. Принцип такой же, как и для магнитных шариков, но на заключительном этапе образцы нужно вращать, чтобы отделить ДНК от смолы.

    Все эти методы до сих пор имели дело с простыми одиночными образцами. В некоторых случаях образец состоит из смеси клеток, например сперматозоидов и не спермальных эпителиальных клеток. Эта экстракция основана на различных свойствах двух типов клеток.Сперматозоиды сопротивляются лизису протеиназой К; поэтому в его присутствии сначала лизируются не сперматозоиды. При центрифугировании пробирки раствор содержит эпителиальную ДНК, а осадок содержит сперматозоиды. Затем сперматозоиды лизируют путем добавления дитиотреитола или DTT с протеиназой К. Для выделения ДНК из этих дифференциальных лизатов можно использовать любой из методов, упомянутых ранее.

    Хотя растения не являются обычным источником ДНК для судебно-медицинских исследований, анализ их ДНК очень распространен в науке.С растениями труднее работать, чем со многими другими материалами, по нескольким причинам. Во-первых, у растительных клеток есть клеточная стенка, которую необходимо хотя бы частично разрушить, прежде чем можно будет получить доступ к цитоплазме с ДНК. Во-вторых, растения часто имеют высокий уровень сахаров (например, крахмала или фруктозы) в тканях или других органических соединений, таких как полифенолы.

    Измельчение образцов в жидком азоте помогает разрушить клеточную стенку, но органические соединения, включая сахара, все еще остаются.В результате были разработаны методы, использующие смесь хлороформ-октанол, бромид гексадецилтриметиламмония (CTAB) с высоким содержанием соли для удаления полисахаридов и поливинилпирролидон (PVP) для удаления полифенолов.

    Все эти методы успешно используются в различных лабораториях и с различными образцами. Необходимо правильно выбрать методы, чтобы оптимизировать выход и качество экстрагированной ДНК.

    см. Также ДНК; ДНК-профилирование; Системы типирования ДНК.

    Границы | Выделение и анализ отдельных клеток

    Введение

    Клетка - основная единица биологических организмов.Несмотря на очевидную синхронность в клеточных системах, результаты анализа отдельных клеток показывают, что даже одна и та же клеточная линия или ткань может представлять разные геномы, транскриптомы и эпигеномы во время деления и дифференцировки клеток (Schatz and Swanson, 2011). Например, развивающийся эмбрион, мозг или опухоль имеют сложные структуры, состоящие из множества типов клеток, которые могут быть пространственно разделены. Таким образом, выделение отдельных типов клеток необходимо для дальнейшего анализа и будет полезно для диагностики, биотехнологии и биомедицины.

    Обычные клеточные анализы в основном измеряют средний ответ от популяции клеток, предполагая, что средний ответ является репрезентативным для каждой клетки. Однако при выполнении этой важной информации о небольшой, но потенциально релевантной субпопуляции может быть потеряна, особенно в тех случаях, когда эта субпопуляция определяет поведение всей популяции. Например, микроокружение опухоли представляет собой сложную гетерогенную систему, которая состоит из множества сложных взаимодействий между опухолевыми клетками и соседними с ней незлокачественными стромальными клетками.Стромальные клетки состоят из эндотелиальных клеток, фибробластов, макрофагов, иммунных клеток и стволовых клеток. Из-за различий в генетических факторах и факторах окружающей среды разные типы клеток обладают уникальным поведением и по-разному влияют на патогенные состояния (Schor and Schor, 2001). Эти проблемы делают традиционный анализ недостаточным. Таким образом, новые технологии выделения отдельных отдельных клеток из сложного образца и изучения геномов и протеомов отдельных клеток могут дать отличное понимание вариабельности генома и процессов экспрессии генов.Считается, что анализ отдельных клеток влияет на различные области, включая науки о жизни и биомедицинские исследования (Blainey and Quake, 2014).

    Раньше исследователи применяли методы анализа отдельных клеток с низкой пропускной способностью, такие как иммунофлуоресценция, флуоресценция in situ гибридизация (FISH) и ПЦР отдельных клеток, для обнаружения определенных молекулярных маркеров отдельных клеток (Taniguchi et al., 2009; Citri et al., 2012). Эти методы позволяют количественно определять ограниченное количество параметров в отдельных ячейках.С другой стороны, сейчас широко используется высокопроизводительный геномный анализ, такой как секвенирование ДНК и РНК. Однако геномные исследования основаны на изучении коллективных средних значений, полученных при объединении тысяч и миллионов клеток, что исключает анализ вариабельности от клетки к клетке в масштабе всего генома. Таким образом, секвенирование отдельных клеток развивалось параллельно с его необходимостью в исследовании, которое в 2013 году (2014) признало его «методом года» организацией Nature Methods. Используя анализ отдельных клеток, исследователи профилировали многие биологические процессы и заболевания на уровне отдельных клеток, включая эволюцию опухоли, циркулирующие опухолевые клетки (ЦКО), гетерогенность нейронов, раннее развитие эмбриона и некультивируемые бактерии.

    В этом обзоре мы обсуждаем технологии, недавно разработанные для выделения отдельных клеток, получения генома, анализа транскриптома и протеома, а также их применения. Мы также кратко обсудим будущие возможности технологий выделения одиночных клеток и анализа.

    Технологии изоляции одиночных ячеек

    Перед тем, как приступить к анализу отдельных клеток, ученым необходимо выделить или идентифицировать отдельные клетки. Эффективность технологии выделения клеток обычно характеризуется тремя параметрами: эффективностью или пропускной способностью (сколько клеток может быть выделено за определенное время), чистотой (доля клеток-мишеней, собранных после разделения) и извлечение (доля клеток-мишеней, собранных после разделения). клетки-мишени, полученные после разделения, по сравнению с изначально доступными клетками-мишенями в образце).Текущие методы показывают разные преимущества для каждого из трех параметров.

    Основываясь на разнообразии используемых принципов, существующие методы изоляции ячеек можно разделить на две группы. Первая группа основана на физических свойствах, таких как размер, плотность, электрические изменения и деформируемость, с такими методами, как центрифугирование в градиенте плотности, мембранная фильтрация и платформы для захвата на основе микрочипов. Наиболее выгодными физическими свойствами является изоляция отдельных ячеек без маркировки.Вторая группа основана на биологических характеристиках клеток, включая методы аффинности, такие как аффинная твердая матрица (шарики, пластины, волокна), сортировка клеток с активацией флуоресценции и сортировка клеток с магнитной активацией, которые основаны на свойствах экспрессии биологических белков ( Дайняк и др., 2007). Таким образом, ниже мы кратко резюмируем принцип каждого метода, а также преимущества и ограничения их применения (таблица 1). Мы не будем обсуждать предельное разведение, поскольку оно хорошо известно в области производства моноклональных культур клеток.

    Таблица 1. Обзор методов выделения одиночных клеток .

    Сортировка клеток с активацией флуоресценции (FACS)

    Сортировка клеток с активацией флуоресценции (FACS), специализированный тип проточной цитометрии с возможностью сортировки, представляет собой наиболее сложный и удобный метод для характеристики и определения различных типов клеток в гетерогенной клеточной популяции на основе размера, гранулярности и флуоресценции. FACS позволяет проводить одновременный количественный и качественный многопараметрический анализ отдельных клеток (Gross et al., 2015). Перед разделением готовят клеточную суспензию, и клетки-мишени метят флуоресцентными зондами. Моноклональные антитела, конъюгированные с флуорофором, являются наиболее широко используемыми флуоресцентными зондами (mAb), которые распознают специфические поверхностные маркеры на клетках-мишенях. Когда клеточная суспензия проходит через цитометрию, каждая клетка подвергается воздействию лазера, который позволяет детекторам флуоресценции идентифицировать клетки на основе выбранных характеристик. Прибор прикладывает заряд (положительный или отрицательный) к капле, содержащей интересующую ячейку, а система электростатического отклонения облегчает сбор заряженных капель в соответствующие пробирки для сбора для последующего анализа (рис. 1A).Хотя FACS широко используется для выделения популяций высокоочищенных клеток, сообщается, что FACS также может использоваться для сортировки отдельных клеток (Schulz et al., 2012). Например, системы сортировки клеток BD (такие как BD FACSAria III Cell Sorter) могут выделить отдельные представляющие интерес клетки из тысяч клеток в популяции с использованием до 18 поверхностных маркеров.

    Рис. 1. Обзор технологий изоляции отдельных ячеек, обсуждаемых в этом разделе. (A) Схема сортировки клеток, активируемых флуоресценцией.Взвешенные меченые клетки передаются в виде потока капель, каждая из которых содержит одну клетку перед лазером. Система обнаружения флуоресценции определяет характеристики флуоресценции и светорассеяния. Исходя из их характеристик, прибор подает заряд на каплю, содержащую интересующую ячейку, а система электростатического отклонения облегчает сбор заряженных капель в разные собирающие трубки. Клетки, помеченные зеленым, пурпурным и желтым цветом, указывают на разные типы клеток. (B) Схема сортировки клеток с магнитной активацией. Представляющие интерес клетки помечают магнитными шариками, конъюгированными со специфическими антителами. Внешнее магнитное поле используется для отделения меченых клеток от клеточной суспензии. S и N обозначают магнитное поле. (C) Схема микродиссекции лазерного захвата. В этом методе используется лазер, который стреляет через колпачок над интересующими клетками, чтобы расплавить мембрану и позволить клеткам прилипнуть к расплавленной мембране. Когда крышка снимается, захваченные клетки удаляются, а нежелательные клетки остаются. (D) Схема ручного отбора ячеек. За интересующими клетками наблюдают под микроскопом. С помощью стеклянной пипетки, подключенной к микроманипулятору, отдельные клетки могут быть собраны и перенесены в новую пробирку для последующего анализа. (E) Схема микрофлюида, используемого для выделения одиночных клеток. Перед началом экспериментов клетки необходимо диссоциировать, а затем перетечь в чип. Таким образом, клетки можно разделить на разные пробирки, содержащие только одну клетку.

    С конца 1960-х годов были достигнуты значительные успехи в технологии FACS, включая оборудование и доступность большого количества высокоспецифичных антител.Возможности технологии FACS значительно улучшились: от метода, ограниченного измерением 1-2 флуоресцентных видов на клетку до 10-15 видов. Максимальное количество белков, которые можно одновременно измерить, постоянно увеличивается (Wu and Singh, 2012). Благодаря этому прогрессу наше понимание иммунологии и биологии стволовых клеток значительно улучшилось вместе с открытием множества функционально разнообразных популяций клеток (Bendall et al., 2012). Также сообщалось, что с использованием цитометрии следующего поколения, «постфлуоресцентной» технологии отдельных клеток, называемой массовой цитометрией, теоретически можно измерить 70–100 параметров.

    Хотя FACS широко используется как в фундаментальных, так и в клинических исследованиях, существует несколько ограничивающих недостатков. Во-первых, для FACS требуется огромное начальное количество клеток (более 10 000) в суспензии. Следовательно, он не может изолировать отдельные клетки от клеточной популяции с низким количеством. Во-вторых, быстрый поток в машине и неспецифические флуоресцентные молекулы могут повредить жизнеспособность отсортированных клеток, что приведет к невозможности изоляции. Более того, перед анализом FACS клетки или клеточные культуры необходимо подвергнуть экспериментам по стимуляции и обработать в отдельной среде.

    Сортировка клеток с магнитной активацией (MACS)

    Магнитно-активированная сортировка клеток (MACS) - еще один широко используемый метод пассивного разделения для выделения различных типов клеток в зависимости от их кластера дифференцировки. Сообщалось, что MACS способен выделять определенные популяции клеток с чистотой> 90% (Miltenyi et al., 1990). MACS основан на антителах, ферментах, лектинах или стрепавидинах, конъюгированных с магнитными шариками для связывания определенных белков на клетках-мишенях.Когда смешанная популяция клеток помещается во внешнее магнитное поле, магнитные шарики активируются, и меченые клетки поляризуются, в то время как другие клетки вымываются. Остальные клетки могут быть получены путем элюирования после выключения магнитного поля (рис. 1B). С помощью этого метода клетки могут быть разделены зарядом по отношению к конкретным антигенам. Позитивные методы разделения используют покрытые магнитные шарики и привлекают клетки. Интересующие клетки помечаются, а немеченые клетки отбрасываются.Напротив, если видоспецифические вещества недоступны, хорошим выбором является использование методов отрицательного разделения, которые используют смесь антител для покрытия необработанных клеток. В этом случае меченые клетки отбрасываются, а немеченые остаются (Grützkau and Radbruch, 2010).

    Из двух наиболее распространенных методов изоляции конкретных ячеек, основанных на аффинности, технология MACS сравнительно проста и экономична. Однако очевидный недостаток системы MACS заключается в ее начальных затратах на разделительный магнит и эксплуатационных расходах, включая не только стоимость сопряженных магнитных шариков, но и замену колонок.Кроме того, окончательная чистота изолированных клеток в устройствах MACS зависит от специфичности и аффинности антител, используемых для отбора клеток-мишеней. Это также зависит от количества неспецифических захватов ячеек. Неспецифическое загрязнение может быть результатом адсорбции фоновых клеток на улавливающем устройстве или их захвата большим избытком магнитных частиц, необходимых для мечения редких клеток в больших объемах. Использование новых материалов может устранить загрязнение от неспецифической адсорбции или захвата других клеток крови.Другой недостаток MACS заключается в том, что он может использовать только молекулы клеточной поверхности в качестве маркеров для разделения живых клеток. Кроме того, следует отметить, что MACS гораздо более ограничен, чем FACS, из-за иммуномагнитных методов, которые могут разделять клетки только на положительные и отрицательные популяции. Невозможно разделить высокую и низкую экспрессию молекулы, хотя это возможно с помощью сортировки FACS.

    Микродиссекция лазерного захвата (LCM)

    Laser Capture Microdissection (LCM) - это передовая технология для выделения чистых популяций клеток или отдельной клетки из преимущественно твердых образцов ткани на предметном стекле микроскопа (Emmert-Buck et al., 1996). Он может точно и эффективно нацеливать и захватывать интересующие клетки, чтобы в полной мере использовать новые молекулярно-аналитические технологии, включая ПЦР, микроматрицы и протеомику (Espina et al., 2007). Сегодня существует два основных класса систем микродиссекции с лазерным захватом: инфракрасные (IR LCM) и ультрафиолетовые (UV LCM). Система LCM состоит из инвертированного микроскопа, твердотельного лазерного диода ближнего инфракрасного диапазона, блока управления лазером, предметного столика микроскопа, управляемого джойстиком, с вакуумным зажимом для иммобилизации слайдов, камеры CCD и цветного монитора (Datta et al., 2015). Основной принцип LCM начинается с визуализации представляющих интерес клеток с помощью инвертированного микроскопа, затем доставляется сфокусированный лазерный импульс с фиксированным положением, короткой продолжительностью и направлением для плавления тонкой прозрачной термопластичной пленки на крышке над целевыми ячейками. Пленка плавится и сливается с выбранными нижележащими клетками. Когда пленка удаляется, клетки-мишени остаются связанными с пленкой, а остальная ткань остается. Наконец, перенесите клетки в микроцентрифужную пробирку, содержащую буферные растворы, необходимые для широкого спектра последующих анализов (Kummari et al., 2015; Рисунок 1С).

    Наиболее важным преимуществом LCM является его скорость при сохранении точности и универсальности (Fend and Raffeld, 2000). LCM обеспечивает быстрый и надежный метод получения чистых популяций клеток-мишеней из широкого спектра клеточных и тканевых препаратов с помощью микроскопической визуализации (Bonner et al., 1997). Обычные методы молекулярного анализа требуют диссоциации ткани. Это может вызвать проблемы с естественным загрязнением и снизить специфичность и чувствительность к последующему молекулярному анализу.С другой стороны, LCM - это метод «без прикосновения», который не разрушает прилегающие ткани после первоначального микродиссекции. Морфология как захваченных клеток, так и остаточной ткани хорошо сохраняется и снижает опасность потери ткани (Esposito, 2007). Кроме того, после удаления выбранных клеток оставшаяся ткань на слайде полностью доступна для дальнейшего захвата, что позволяет проводить сравнительный молекулярный анализ соседних клеток.

    Основным требованием для эффективной LCM является правильная идентификация клеточных субпопуляций или отдельных клеток в сложной ткани.Таким образом, основным ограничением является необходимость идентификации представляющих интерес клеток посредством визуального микроскопического исследования морфологических характеристик, что, в свою очередь, требует наличия патолога, цитолога или технолога, обученного идентификации клеток (Espina et al., 2007). Еще одно существенное ограничение - микродиссекция ткани не имеет покровного стекла. Соскальзывание покрытия предотвратит физический доступ к поверхности ткани, что имеет решающее значение для любого современного метода микродиссекции. Без покровного стекла и соответствия показателей между монтажной средой и тканью срез сухой ткани обладает преломляющими свойствами, что может скрывать детали клеток при большом увеличении.Более того, LCM вводит ряд технических артефактов, включая разрезание клеток во время подготовки срезов ткани и УФ-повреждение ДНК или РНК из-за энергии лазерной резки (Allard et al., 2004).

    Ручной сбор клеток / микроманипуляции

    Ручной сбор ячеек - простой, удобный и эффективный метод выделения отдельных ячеек. Подобно LCM, ручные микроманипуляторы для сбора клеток также состоят из инвертированного микроскопа в сочетании с микропипетками, которые перемещаются через моторизованные механические столики.Каждую изолированную отдельную клетку можно наблюдать и фотографировать под микроскопом, что обеспечивает беспристрастную изоляцию (рис. 1D). В отличие от LCM, который в основном изолирует отдельные клетки из срезов фиксированной ткани, микроманипуляция играет важную роль в выделении живых культуральных клеток или клеток эмбриона.

    Микроманипуляции могут быть легко выполнены в электрофизиологической лаборатории, оснащенной системой зажимов. Например, после исследования функции нейронов в препаратах срезов головного мозга после стандартных электрофизиологических записей цельноклеточных патч-кламп, ученые применяли отрицательное давление через патч-пипетку, чтобы цитозольный материал, содержащий клеточную мРНК, можно было аспирировать для дальнейшего анализа (Eberwine et al., 1992; Citri et al., 2012). Однако пропускная способность ограничена, и для ее выполнения требуются высококвалифицированные специалисты, у нее есть ограничение полезности при обнаружении сложных изменений.

    Микрофлюидика

    Microfluidics признана мощной технологией для исследования внутренней сложности клеточных систем, поскольку она обеспечивает точный контроль жидкости, низкий расход образцов, миниатюризацию устройства, низкую стоимость анализа и простоту работы с объемами нанолитров (Whitesides, 2006; Рисунок 1E) .Сортировку клеток с помощью микрожидкостного чипа можно разделить на четыре категории: микрофлюидная хроматография на основе аффинной клеточной хроматографии (Nagrath et al., 2007), физические характеристики микрожидкостного разделения на основе клеток, микрожидкостное разделение на иммуномагнитных шариках и методы разделения, основанные на различиях между диэлектриками. свойства различных типов клеток.

    Микрожидкостная хроматография на основе клеточной аффинной хроматографии является наиболее часто используемым методом анализа микрожидкостных чипов. Он основан на высокоспецифических взаимодействиях между антигеном и антителом, лигандом и рецептором.В начале процесса микроканал в чипе модифицируется специфическими антителами, способными связываться с антигеном или аптамером клеточной поверхности, такими как молекула адгезии эпителиальных клеток. Как только образец проходит через микроканалы, его антиген клеточной поверхности может связываться со специфическими антителами или аптамером, иммобилизуя клетки на чипе, в то время как оставшиеся клетки стекают с чипа с буфером. Наконец, используя другой буфер, мы можем элюировать иммобилизованные клетки для последующего анализа.По сравнению с другими методами разделения системы на основе аффинности обладают более высокой специфичностью и чувствительностью из-за события распознавания-связывания.

    Сегодня микрофлюидику можно комбинировать с различными методами разделения, такими как фильтрация и осаждение, или технологиями на основе аффинности, такими как FACS и MACS. В последние годы сообщалось о многочисленных исследованиях и применениях микрофлюидных устройств, включая исследования рака, микробиологию, одноклеточный анализ, исследование стволовых клеток, открытие лекарств и скрининг (Arora et al., 2010; Ли и др., 2012а). В последнее время микрожидкостные чипы изготавливают из кремния или стекла, эластомера, термореактивных материалов, гидрогеля, термопластов и бумаги (Ren et al., 2013, 2014). Преимущества и недостатки материалов, используемых в микрожидкостных чипах, были хорошо описаны ранее (Ren et al., 2014). Микрофлюидика используется для управления жидкостями (размером от 1 до 1000 мкм) в сетях микроканалов в одном устройстве. При таких сверхмалых объемах жидкости проявляют другие физико-химические свойства по сравнению с их поведением в макромасштабе (Squires and Quake, 2005).В микрофлюидных устройствах можно использовать другие распространенные жидкости, включая суспензии бактериальных клеток, образцы цельной крови, растворы белков или антител и различные буферы.

    Используя преимущества одновременной обработки и обработки клеток, микрофлюидные чипы демонстрируют потенциальные возможности применения в секвенировании ДНК (Hashimoto et al., 2007; Liu et al., 2007), анализе белков (Emrich et al., 2007), манипуляции с клетками и анализ клеточного состава (VanDijken et al., 2007; Bhagat et al., 2010). Например, компания Fluidigm разработала коммерчески доступную микрожидкостную систему количественной ПЦР на основе клапанов под названием Dynamic Array ™.Эта система продвинулась в предоставлении исследователям методов с малым объемом (нанолитр) и высокой пропускной способностью (тысячи реакций ПЦР на устройство) и становится все более популярной для крупномасштабных исследований отдельных клеток. Более того, микрофлюидные технологии нашли все большее применение в изучении разнообразия и вариаций в геномах отдельных клеток, от биологии рака до микробиологии окружающей среды и нейробиологии. Помимо приложений в геномике, преимущества масштабируемости и малого объема микрофлюидных методов нашли применение в измерении внутриклеточных и секретируемых белков отдельными клетками.

    Анализ отдельных клеток

    Инструменты анализа отдельных клеток можно разделить на три группы: геномика, транскриптомика и протеомика. Благодаря технологиям секвенирования следующего поколения (NGS), а также подходам полногеномной / транскриптомной амплификации (WGA / WTA) возникла новая научная область исследований генома отдельных клеток. Комбинация высокопроизводительного и многопараметрического подходов используется в анализе отдельных ячеек, который может отражать межклеточную изменчивость и гетерогенные различия в отдельных клетках.Поэтому разработка эффективных методов анализа отдельных клеток требует внимания. В этом разделе мы обсуждаем новые технологии, разработанные для анализа отдельных клеток геномики, транскриптомики и протеомики (таблица 2).

    Таблица 2. Методы анализа отдельных клеток .

    Геномика одной клетки

    Секвенирование одноклеточного генома позволяет нам идентифицировать хромосомные вариации, такие как количество копий и однонуклеотидные вариации. Это также позволяет нам изучать эволюцию опухоли, генез гамет и соматический мозаицизм, что отражается в геномной гетерогенности среди популяции клеток.Однако у людей он часто сталкивается с низким количеством материалов генома, например, вес одной геномной ДНК составляет всего 6 пг, и каждый ген в геноме имеет только две копии в одной нормальной клетке, что недостаточно для текущее использование NGS. Однако амплификация с использованием традиционной ПЦР страдает от серьезных смещений и выпадения аллелей в геноме, когда она применяется к отдельным клеткам. Следовательно, точная, беспристрастная амплификация ДНК имеет решающее значение для секвенирования генома одной клетки. Было предпринято множество попыток, в основном путем модификации традиционной методологии ПЦР на ПЦР с линкерным адаптером (LA-PCR) (Klein et al., 1999), ПЦР с вкраплениями повторяющихся последовательностей (IRS-PCR), ПЦР с удлинением праймера до амплификации (PEP-PCR) (Hubert et al., 1992), ПЦР с вырожденными олигонуклеотидами (DOP-PCR) (Telenius et al., 1992), и его вариант смещения ДОФ-ПЦР (D-DOP-PCR) (Langmore, 2002). Например, используя DOP-PCR, Navin и его коллеги продемонстрировали точное и надежное определение числа копий в масштабе всего генома в реаранжированных геномах рака (Navin et al., 2011). Это первый отчет о секвенировании генома одной клетки применительно к исследованию гетерогенности генома рака.Однако эти методы также имеют некоторые ограничения по низкому охвату, смещению амплификации и выпадению аллелей.

    Многократная амплификация смещения (MDA) - самый популярный метод, применяемый в геномном анализе, благодаря его высокой точности и простоте. Он может амплифицировать ДНК в изотермической реакции при 30 ° C со случайными гексамерными праймерами и ДНК-полимеразой phi29. Ядро MDA состоит в том, что ДНК-полимераза phi29 может удлинить праймеры с высокой точностью и высокой процессивностью, что проявляет мощную способность замещения цепи во время синтеза новой цепи (Dean et al., 2002). В процессе замещения образуются одноцепочечные ДНК-матрицы, которые изменяются и удлиняются, тем самым амплифицируя ДНК в изотермической реакции. Основываясь на MDA, Сюй и его коллеги представили первый внутриопухолевый генетический ландшафт на одноклеточном уровне и продемонстрировали, что светлоклеточная почечно-клеточная карцинома (ccRCC, наиболее распространенный рак почки) может быть более генетически сложным, чем считалось ранее (Xu et al., 2012). Однако MDA также страдает от сильных предубеждений и высокой скорости выпадения аллелей по всему геному, что делает реакцию уязвимой для генерации «химер», что приводит к нежелательному шуму и ложным результатам.

    Другой новый метод, многократный отжиг и циклы амплификации на основе петель (MALBAC) продемонстрировал точное обнаружение вариаций числа копий (Zong et al., 2012), что позволяет амплифицировать геном отдельной клетки с высокой однородностью. MALBAC основан на преамплификации смещения цепи, которая генерирует ампликоны с комплементарными концами. Таким образом, полные ампликоны, образующиеся в реакции, запечатываются, образуя петли, чтобы предотвратить их повторную амплификацию. Это также гарантирует, что каждый новый ампликон копируется из исходных шаблонов.Таким образом, очевидным преимуществом MALBAC является то, что он может уменьшить ошибки амплификации и смещения, поскольку исходные материалы для экспоненциальной амплификации представляют собой ампликон, отдельно скопированный из исходного шаблона. Однако это все еще необходимо для повышения точности и снижения систематической ошибки (Marcy et al., 2007; Wu et al., 2014).

    Транскриптомика одиночных клеток

    Секвенирование транскриптома одной клетки недавно стало мощной технологией для выявления дифференциальной экспрессии генов и разнообразных паттернов сплайсинга РНК во время раннего эмбрионального развития, дифференциации и репрограммирования.Основное применение одноклеточной транскриптомики - связать генотип клетки с фенотипом. Он способен обнаруживать тысячи транскриптов в различных тканях и клетках (Cloonan et al., 2008; Mortazavi et al., 2008). Хотя мРНК не так редка, как ДНК в отдельной клетке, все же существуют тысячи копий. Это идеально, поскольку для секвенирования транскриптома NGS также требуется большое количество РНК в качестве исходного материала. МРНК из отдельных клеток необходимо подвергнуть обратной транскрипции в кДНК с последующими циклами амплификации ПЦР (Sandberg, 2014).Ключевой процесс успешного завершения амплификации одноклеточной мРНК основан на выполнении обратной транскрипции двухцепочечной ДНК с высокой эффективностью и низкими смещениями.

    Об амплификации на основе ПЦР

    впервые сообщалось при одноклеточном транскриптомном анализе получения одноклеточных кДНК с использованием микрочипов кДНК и анализа РНК-seq (Brady and Iscove, 1993). Недостатком микроматрицы является низкая чувствительность обнаружения, которая, вероятно, пропустит многие низкоуровневые, но ключевые транскрипты.По сравнению с анализом микроматриц, анализ РНК-seq расширил спектр обнаруженных генов с высокой точностью и эффективно увеличил долю полноразмерной кДНК. Одним из преимуществ смещения амплификации транскриптома мРНК на основе ПЦР является то, что он делает разницу в экспрессии более заметной между образцами и может использоваться любое исходное количество РНК. Но, с другой стороны, это может исказить исходную разницу, когда она незначительна. Было разработано несколько модифицированных методов амплификации кДНК на основе ПЦР, таких как глобальная амплификация ПЦР (GA), 3'-концевая амплификация (TPEA) и амплификация обратной транскрипции, опосредованная переключением цепи (SMART) (Pan, 2014).

    Амплификация на основе транскрипции (IVT) in vitro. Линейная амплификация РНК - первая стратегия, которая была использована для успешной амплификации РНК для исследований молекулярного профилирования, что способствовало рождению эры анализа отдельных клеток (Liu et al., 2014 ). Он основан на IVT, опосредованном РНК-полимеразой Т7, и требует трех раундов амплификации. Основные преимущества стратегии IVT включают ее специфичность, точность соотношения и снижение накопления неспецифических продуктов, но ее недостатком является низкая эффективность и длительность процедуры.

    Недавно были разработаны методы амплификации одноклеточной РНК на основе ДНК-полимеразы Phi29 (Blanco and Salas, 1984; Dean et al., 2002). Эта полимераза представляет собой высокопроизводительный фермент с сильной активностью замещения цепей, что позволяет получать высокоэффективную изотермическую ДНК. Метод амплификации транскриптома на основе ДНК-полимеразы phi29 представляет собой простую, быструю и изотермическую реакцию (Liu et al., 2014). Основным преимуществом этого метода является высокая эффективность, низкий уровень смещения и однородный характер усиления.

    Кроме того, чтобы сохранить пространственную и временную информацию о РНК в клетках, было разработано несколько новых методов секвенирования РНК, включая анализ транскриптома in vivo (TIVA), флуоресцентный анализ одной молекулы in situ , гибридизация (smFISH), флуоресцентный анализ. in situ, секвенирование РНК (FISSEQ) и т. Д. (Lee et al., 2014; Lovatt et al., 2014). Эти технологии становятся мощным инструментом для решения давних биомедицинских вопросов.

    Протеомика одиночных клеток

    Одноклеточный анализ ДНК и РНК может предоставить качественную информацию об экспрессии белка.Однако они не могут предоставить информацию о концентрации белка, его местонахождении, посттрансляционных модификациях или взаимодействиях с другими белками. Таким образом, одноклеточная протеомика помогает нам получить гораздо больше информации, которая имеет решающее значение для передачи сигналов между клетками и неоднородности клеток. Традиционные методы анализа белков, такие как гель-электрофорез, иммуноанализ, хроматография и масс-спектрометрия, требуют для анализа большого количества клеток. Таким образом, основные проблемы анализа белков на уровне отдельной клетки - это чрезвычайно малое количество копий отдельных белков и отсутствие методов амплификации.Однако недавние достижения в многопараметрической проточной цитометрии, микрофлюидике, масс-спектрометрии, масс-цитометрии и других методах привели к новым исследованиям протеомики отдельных клеток, которые могут быть выполнены с большей чувствительностью и специфичностью.

    Проточная цитометрия не только широко используется для сортировки клеток, но и является наиболее устоявшимся и удобным для пользователя методом как качественного, так и количественного многопараметрического анализа отдельных клеток. Как упоминалось ранее, с помощью многопараметрической проточной цитометрии ученые могут одновременно измерять 10-15 ключевых белков в сигнальных путях в отдельных клетках (De Rosa et al., 2001; Перес и Нолан, 2002). Кроме того, в иммунологическом исследовании, подтверждающем концепцию, было проанализировано до 19 отдельных параметров, включая 17 флуоресцентных цветов и 2 физических параметра (Perfetto et al., 2004). Эта сильная способность превратила проточную цитометрию в мощный инструмент полуколичественного анализа путей, лежащих в основе многих заболеваний (Irish et al., 2004; Sachs et al., 2005). Основным ограничением является спектральное перекрытие из-за широких спектральных полос излучения органических флуоресцентных красителей.Квантовые точки смягчают, но не устраняют проблему. Следовательно, для спектральной деконволюции требуются сложные алгоритмы коррекции. Более того, в коммерческих проточных цитометрах используются клеточные суспензии, которые, в свою очередь, позволяют проводить индивидуальный опрос клеток. Пробоподготовка по-прежнему выполняется вручную и, следовательно, требует большого количества ячеек (более 10 000). Это затрудняет анализ небольших образцов, таких как клетки, полученные при биопсии, образцы тканей или небольшие объемы крови.

    Чтобы преодолеть эти ограничения, были предприняты усилия по разработке миниатюрных проточных цитометров на основе микрофлюидов, которые позволяют анализировать небольшое количество клеток (100–1000) (Lindström and Andersson-Svahn, 2010).Например, Су и его коллеги разработали микрофлюидный цитометр без меток на основе микроскопа. Он способен получать двумерные картины светорассеяния от мельчайших зрелых клеток крови (тромбоцитов), гемопоэтических стволовых / предшественников пуповинной крови (клетки CD34 +) и миелоидных клеток-предшественников (Su et al., 2011). Srivastava et al. (2009) разработали интегрированное микрожидкостное устройство, приспособленное для коммерческого использования. Основным преимуществом этого микрофлюидного устройства является его способность выполнять культивирование клеток, стимуляцию и подготовку образцов в сочетании с традиционной флуоресцентной визуализацией и микрожидкостной проточной цитометрией для мониторинга иммунного ответа в макрофагах.Эти микрофлюидные устройства не только резко уменьшили количество требуемых образцов и реагентов, но также предоставили средства для выполнения двух ортогональных режимов измерений - визуализации и цитометрии в одном эксперименте.

    Масс-спектрометрия (МС) - самый мощный инструмент для анализа белков. Однако использование MS для анализа белков в отдельных клетках ограничено из-за отсутствия чувствительности для обнаружения небольших количеств белков. Фракционирование клеточного лизата с помощью капиллярного электрофореза (КЭ) перед МС предлагает хороший способ улучшить чувствительность.Недавно был разработан формат проточной цитометрии, в котором используется точность масс-спектрометрии, называемая масс-цитометрией. Он может уникальным образом обеспечить измерение более 40 одновременных параметров сотовой связи на отдельных ячейках с пропускной способностью для исследования миллионов ячеек из отдельной выборки (Mellors et al., 2010).

    Применение анализа отдельных клеток

    Экспоненциальный рост исследований, в которых применяется анализ отдельных клеток, явно связан с признанием этого метода биологами.Анализ отдельных клеток повлиял и повлиял на различные области науки, включая биологию рака, нейробиологию, иммунологию и так далее. Задокументировать каждое из этих событий невозможно. Таким образом, краткий обзор областей применения, которые обычно рассматриваются с помощью анализа отдельных клеток, представлен в исследованиях и приложениях для рака, головного мозга, стволовых клеток и т. Д.

    Применение анализа отдельных клеток при раке, Neuron Research

    О внутриопухолевой гетерогенности широко сообщалось при многих типах рака человека.Опухоли часто состоят из отдельных, молекулярно различных клонов, которые различаются по скорости пролиферации и метастатическому потенциалу, что наиболее важно, по своей чувствительности и реакции на лекарственное лечение. Те клетки, которые могут вызывать отдаленные метастазы, должны обладать уникальными характеристиками по сравнению с остальной субпопуляцией. Секвенирование экзома единичных клеток, выделенных из первичных карцином почек, показало, что только 31–37% генетических повреждений в опухоли идентичны остальным опухолевым клеткам (Gerlinger et al., 2012; Xu et al., 2012). Следовательно, анализ возникновения, развития и метастазирования этих опухолей на уровне отдельных клеток дает гораздо более подробную информацию о том, как лекарство будет реагировать на опухолевые клетки. Сообщалось, что мутации PIK3CA были обнаружены в первичных и метастатических опухолевых тканях, но они периодически различаются в единичных клетках ЦКО, и DTC указывают на эффективность препарата (Deng et al., 2014).

    Было обнаружено несколько важных типов раковых клеток, включая первичные опухолевые клетки, метастатические опухолевые клетки, раковые стволовые клетки (CSC), циркулирующие опухолевые клетки (CTC) и диссеминированные опухолевые клетки (DTC) (Zhang et al., 2016). CTC и DTC играют жизненно важную роль в распространении рака, самообновлении и отдаленных метастазах. Они получают все большее признание за их потенциальную полезность в мониторинге заболеваний и терапевтическом нацеливании. У многих онкологических больных диагностируется рак на ранней стадии без клинических симптомов метастазирования, но впоследствии у них развивается метастатический рецидив. Одна из важных причин заключается в том, что ЦКО в крови и ДКК уже достигли вторичного органа, но еще не выросли, чтобы стать клиническими метастазами.Однако ЦОК настолько редки среди огромного количества клеток крови, всего лишь одна клетка на 10 миллионов лейкоцитов и 5 миллиардов эритроцитов, что точная идентификация ЦОК оказывается наиболее трудным шагом в процессе выделения. (Deng et al., 2008). В последние годы были разработаны различные методы обогащения и обнаружения, что привело к значительному прогрессу в обнаружении ЦОК. Например, система CellSearch ® (Janssen Diagnostics, NJ, USA) является первым и единственным методом, одобренным FDA США для обнаружения, обогащения и количественного определения ЦОК в образцах периферической цельной крови (Riethdorf et al. ., 2007). В этой системе используются магниты с наночастицами феррожидкости, конъюгированными с антителами, которые нацелены на молекулы адгезии эпителиальных клеток, такие как EpCAM и CD45. EpCAM является наиболее часто используемым эпителиальным маркером, который присутствует на эпителиальных опухолевых клетках, в то время как CD45 является иммуноцитарным маркером, который присутствует на многих клетках крови, но отсутствует в эпителиальных клетках. Таким образом, данные о EpCAM-положительных и CD45-отрицательных клетках указывают на присутствие ЦОК. Другая новая технология иммуномагнитного разделения, называемая MagSweeper (Illumina), включает погружение вращающегося магнитного стержня в связанные антитела EpCAM для выделения ЦОК.Затем переместите магнитный стержень в новый буфер для высвобождения ЦКО (Talasaz et al., 2009; Powell et al., 2012). MagSweeper можно надежно использовать для извлечения функциональных ЦОК человека из крови мышей, инокулированных ксенотрансплантатами опухоли человека, при сохранении их способности инициировать опухоль и метастазировать (Ameri et al., 2010). Это подчеркивает, что наиболее выгодным аспектом MagSweeper является то, что ЦКО могут быть полностью изолированы при сохранении целостности и жизнеспособности этих хрупких клеток.

    В последние годы было опубликовано большое количество исследований с использованием анализа отдельных клеток для анализа отдельных опухолевых клеток, выделенных из рака груди (Navin et al., 2011; Deng et al., 2014; Wang et al., 2014; Eirew et al. al., 2015), рак толстой кишки (Zong et al., 2012; Yu et al., 2014), аденокарциномы поджелудочной железы (Ruiz et al., 2011), мышечно-инвазивный рак мочевого пузыря (Li et al., 2012b), кишечник рак (Grün et al., 2015), рак аденокарциномы легких (Kim et al., 2015), почечно-клеточный рак (Gerlinger et al., 2012; Li et al., 2012b) и острый миелоидный лейкоз (Ding et al., 2012; Hughes et al., 2014; Paguirigan et al., 2015). Например, Навин и его коллеги исследовали вариацию числа копий в единичных опухолевых клетках с использованием DOP WGA с последующим секвенированием ДНК для определения структуры популяции клеток и паттернов эволюции опухоли в единственной опухоли груди (Navin et al., 2011). Это исследование стало важным прорывом в исследованиях эволюции опухолей и предложило способ оценки генетических деталей структуры опухоли.Хоу и его коллеги впервые применили технологию секвенирования отдельных клеток на основе MDA для анализа первичного тромбоцитоза (эссенциальный незрелый, ET) у пациентов на уровне отдельных клеток костного мозга (Hou et al., 2012). Таким образом, понимание гетерогенности опухоли с помощью анализа отдельных клеток считается самой большой проблемой в исследованиях рака, и если это будет выяснено, это повысит нашу способность определять лучшие варианты лечения.

    Без преувеличения можно сказать, что мозг - самая сложная структура человеческого тела.В человеческом мозге более 100 миллиардов нейронов. Каждый из них может установить около 10 000 прямых связей с другими, что в сумме составляет около 100 триллионов нервных связей. Это делает мозг сложной сетью (Herculano-Houzel, 2009). Мозг разделен на несколько областей. Каждая область состоит из различных морфологически и / или нейрохимически различных нейронов, окруженных различными типами глиальных клеток (олигодендроцитов, микроглии и астроцитов). Кроме того, отдельные области мозга, такие как области коры головного мозга, гиппокамп, выполняют определенные функции.Кора головного мозга отвечает за многие функции «высшего порядка», такие как язык и обработка информации, в то время как гиппокамп участвует в пространственном обучении и памяти. Все больше данных показывает, что каждая область мозга содержит разные типы нейронов в зависимости от их местоположения, идентичности нейротрансмиттера, связи, электрофизиологических свойств и молекулярных маркеров. Изменения геномного содержания и эпигенетического профилирования конкретных подтипов нейронов или глии участвуют в патогенезе нейропсихиатрических заболеваний, таких как болезни Паркинсона и Альцгеймера и расстройства аутистического спектра (Citri et al., 2012).

    Следовательно, нет никаких сомнений в том, что изоляция и анализ отдельных клеток вносят все более значительный вклад в наше понимание роли, которую вариации соматического генома играют в разнообразии и поведении нейронов. Например, метод, основанный на MACS, был успешно применен для выделения незрелых нервных клеток из большого числа эмбриональных рыбок данио; Антитело микрогранул, конъюгированных с PSA-NCAM, использовали в полуавтоматическом процессе диссоциации. (Welzel et al., 2015). Более того, MACS также использовался для выделения популяций эмбриональных спинномозговых олигодендроглиальных клеток-предшественников из эмбрионального спинного мозга крысы. Используя суперпарамагнитные шарики MicroBeads в сочетании с антителами A2B5 (специфический маркер развития олигодендроглии) и колонку-сепаратор Mini-MACS, олигодендроглиальные клетки были изолированы с чистотой клеток 58–61% по сравнению с 6–12% в неразделенной популяции (Cizkova и др., 2009).

    Более того, нейроны базолатеральной миндалины (BLA) используются для активации отдельных популяций латерального центрального ядра нейронов миндалины (CeL), чтобы либо вызвать страх, либо уменьшить беспокойство.Намбури и его коллеги определили две популяции нейронов в базолатеральных нейронах миндалины, которые претерпевают противоположные синаптические изменения в результате обусловливания страха (отрицательная эмоция) или вознаграждения (положительная эмоция). Используя RNA-seq, они идентифицировали несколько дифференциально экспрессируемых генов-кандидатов между этими двумя популяционными нейронами, которые могут опосредовать эффекты (Namburi et al., 2015). Усоскин и его коллеги использовали всесторонний анализ транскриптома 622 одиночных нейронов сенсорной системы мыши и обнаружили 11 принципиально различных типов сенсорных нейронов.Интересно, что каждый нейрон связан с разными типами ощущений (Usoskin et al., 2015). Даже клетки, которые кажутся морфологически похожими, могут обнаруживать заметные различия в паттернах экспрессии. В нейробиологических исследованиях электрофизиологический анализ в сочетании с молекулярной биологией в пределах одной клетки даст убедительные результаты, позволяющие нам лучше понять, как изменения на молекулярном уровне проявляются в функциональных свойствах (Eberwine et al., 1992).

    Применение анализа отдельных клеток в исследованиях стволовых клеток

    Стволовые клетки - это недифференцированные клетки, которые характеризуются как способностью к самообновлению, так и способностью дифференцироваться в специализированные типы клеток.Как стволовые клетки уравновешивают свою способность к самообновлению и способность к дифференцировке - центральные вопросы в исследованиях стволовых клеток. Стволовые клетки обычно можно разделить на плюрипотентные стволовые клетки, которые могут давать начало клеткам всех трех зародышевых листков (эктодерма, мезодерма и энтодерма) или тканеспецифические стволовые клетки (также называемые соматическими или взрослыми стволовыми клетками), которые играют важную роль в развитии эмбриональных тканей и гомеостазе взрослых тканей. Оба этих типа стволовых клеток смешаны с различными дифференцированными и промежуточными типами клеток в эмбриональных или взрослых тканях, образуя гетерогенные популяции.Таким образом, выделение, анализ и разработка специфических методов лечения, направленных на стволовые клетки, дают больным раком надежду на улучшение показателей выживаемости и качества жизни (Li et al., 2008; Sharma et al., 2010).

    Предполагается, что раковые стволовые клетки (РСК) сохраняются в опухолях как отдельная популяция и вызывают рецидивы и метастазы, образуя новые опухоли. CSC по своей природе более невосприимчивы к воздействию различных противоопухолевых препаратов, возможно, из-за усиленного оттока лекарств (Trumpp and Wiestler, 2008).Эти клетки особенно устойчивы к терапевтическим препаратам. Из-за ограниченного количества CSC в раковых тканях выделение и анализ CSC все еще представляет собой тяжелую работу. Секвенирование отдельных клеток предоставляет мощные инструменты для идентификации этих клеток, обеспечивая новое понимание сложной внутриопухолевой гетерогенности. Например, Patel et al. (2014) использовали секвенирование одноклеточной РНК для профилирования 672 отдельных клеток из пяти первичных. Каждая опухоль показала высокую внутриопухолевую клеточную гетерогенность во многих аспектах, включая вариации числа копий, а также клеточный цикл, иммунный ответ и гипоксию.Изучая набор генов «стволовости», они идентифицировали непрерывные, а не дискретные, связанные со стволовостью состояния экспрессии среди отдельных клеток всех пяти опухолей, отражающие сложные состояния стволовых клеток в первичной опухоли. Было высказано предположение, что ОСК более устойчивы к химио- и лучевой терапии, чем другие клетки опухоли. Это могло быть одним из объяснений того, почему большинство опухолей рецидивируют после терапии. Таким образом, понимание того, как раковые стволовые клетки сопротивляются медикаментозной терапии, может привести к разработке новых, более эффективных методов лечения рака.Хотя существование этих CSC все еще вызывает споры при многих типах рака, нет никаких сомнений в том, что CSC могут стать основой для нового инновационного лечения, направленного на корни рака.

    Нервные стволовые клетки (NSC) в субвентрикулярной зоне (SVZ) и субгранулярной зоне (SGZ) зубчатой ​​извилины непрерывно делятся и дифференцируются в зрелые нейроны и глию в мозге взрослых грызунов (Aimone et al., 2014). Хотя было документально подтверждено, что эндогенные NSC могут быть активированы с образованием нескольких типов потомства, которые способствуют восстановлению мозга после травмы головного мозга, люди не знают, как отдельные пулы NSC могут реагировать на повреждение головного мозга и какие молекулы запускают вызванную повреждением активацию NSC. .Одноклеточное секвенирование выявляет популяцию спящих нервных стволовых клеток в SVZ, которые активируются при повреждении головного мозга за счет понижающей регуляции гликолитического метаболизма и сопутствующей повышающей регуляции клон-специфичных факторов транскрипции и синтеза белка (Llorens-Bobadilla et al., 2015 ).

    Все больше доказательств показывает, что в тканях сосуществуют множественные молекулярно различные группы стволовых клеток, которые по-разному реагируют на физиологические стимулы. Понимание и внедрение этого молекулярного разнообразия будет иметь решающее значение для использования потенциала лечения заболеваний.

    Заключение и прогноз

    Биологическая значимость клетки для клеточных вариаций и высокий потенциал анализа отдельных клеток как в фундаментальных исследованиях, так и в клинической диагностике привлекли внимание научного сообщества. Анализ экспрессии гена отдельной клетки можно использовать для идентификации опухолевых клеток; анализ мутаций одноклеточной ДНК можно использовать для мониторинга опухолевых клеток и принятия клинических решений (Powell et al., 2012; Deng et al., 2014). Понимание клеточной гетерогенности было основным направлением технологического развития за последнее десятилетие, что привело к появлению все более мощного набора инструментов, протоколов и методов для анализа отдельных клеток на уровне последовательности ДНК, экспрессии РНК и обилия белков (Kalisky et al., 2011; Ву и Сингх, 2012). Как замечательные примеры, технические разработки и соответствующие клинические решения, основанные на анализе одиночных клеток ЦОК и ЦОК, показали перспективу раскрытия индивидуализированной медицины для борьбы с раком.

    Несмотря на то, что в последние годы в анализе генов отдельных клеток был достигнут значительный прогресс, изоляция живых отдельных клеток и молекулярные анализы более благоприятны для глобального профилирования экспрессии РНК и мутаций ДНК (Powell et al., 2012). Мы все еще только начинаем сталкиваться с проблемами измерения неоднородности клеток.Еще есть возможности для улучшений, позволяющих использовать новые режимы анализа и улучшать чувствительность, точность, скорость и пропускную способность (Lecault et al., 2012).

    Для анализа генома отдельных клеток и экспрессии генов наибольшее препятствие для прямого обнаружения разнообразных геномных, транскриптомных и эпигенетических событий - наличие достаточного количества ДНК или РНК. С одной стороны, очистка высококачественных нуклеотидов из одного образца играет ключевую роль для следующих исследований.Проблема, с которой обычно сталкиваются, - это абсорбция трубки, которая вызывает потерю материала пробы. Для уменьшения потерь ДНК и РНК рекомендуется использовать контейнеры с материалом с низким уровнем абсорбции вместо обычных пробирок и анализ реакции в одной пробирке, также часто используется прямая ПЦР / ОТ-ПЦР в одной клетке без выделения нуклеотидов. Другая проблема - низкая эффективность репликации последовательностей вторичной структуры ДНК. Современные методы секвенирования отдельных клеток по-прежнему имеют относительно высокий технический уровень шума. Это приемлемо при изучении генов с высокой экспрессией, но биологические вариации генов, которые экспрессируются на низких уровнях, могут быть замаскированы.Таким образом, необходимо срочно повысить эффективность обратной транскрипции и ПЦР-амплификации. С другой стороны, эту проблему можно решить с помощью платформ секвенирования третьего поколения, которые основаны на секвенировании отдельных молекул и мониторинге сигналов в реальном времени (Schadt et al., 2010; Liu et al., 2012). В технологии секвенирования третьего поколения не требуется амплификации, а также устраняется проблема смещения амплификации ПЦР. Однако чувствительность обнаружения, точность считывания секвенирования, обработка образцов, восстановление и сборка последовательности все еще нуждаются в дальнейшем улучшении.

    Анализ белков намного сложнее, чем анализ нуклеиновых кислот. Несомненно, сложность протеома, отсутствие методов амплификации и высокоспецифичных высокоаффинных зондов делают анализ белков технически сложным. Поскольку содержимое клеток сильно разбавлено после лизиса, необходимы зонды с высоким сродством (не только моноклональные антитела) и высокочувствительные методы обнаружения для обнаружения белков с низким содержанием и посттрансляционных модификаций.

    Подводя итог, можно сказать, что анализ отдельных клеток теперь готов осветить этот новый уровень биологической сложности в условиях нормального развития и болезней.Учитывая быстрый прогресс в разработке технологий выделения или анализа отдельных клеток, многие из упомянутых выше проблем будут решены в ближайшем будущем. Тем не менее, необходимы дальнейшие разработки и междисциплинарное сотрудничество между технологами, учеными и клиницистами. Мы ожидаем, что в далеком будущем методы использования отдельных клеток станут мощным инструментом для решения давних вопросов как в биологических исследованиях, так и в клинической диагностике.

    Авторские взносы

    GD и HX разработали структуру рукописи; PH и WZ написали рукопись; GD и HX прочитали, отредактировали и одобрили рукопись; Г-н Брайан Денг (Стэнфордский университет) помогал в обсуждении и исправлении английского письма.

    Заявление о конфликте интересов

    Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

    Рецензент ASB и ведущий редактор заявили о своей общей принадлежности, а ведущий редактор заявляет, что процесс, тем не менее, соответствовал стандартам справедливой и объективной проверки.

    Благодарности

    Работа поддержана грантами Китайской национальной программы фундаментальных исследований (2013CB531103 - HX), Национального фонда естественных наук Китая (91339113, 81270202 - HX, 81601179 - WZ), Фонда естественных наук провинции Цзянси в Китае (20161BAB204166 - WZ). , 20161BAB205212 для PH), Программа фундаментальных исследований Шэньчжэня (20140825105648 для GD) и грант Уханьского научно-технического бюро (2014060202010125 для GD), Программа Hubei 100 Talents и Wuhan 3551 Talents (для GD).

    Список литературы

    Аймон, Дж. Б., Ли, Й., Ли, С. В., Клеменсон, Г. Д., Дэн, В. и Гейдж, Ф. Х. (2014). Регуляция и функция взрослого нейрогенеза: от генов к познанию. Physiol. Ред. . 94, 991–1026. DOI: 10.1152 / Physrev.00004.2014

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Allard, W.J., Matera, J., Miller, M.C., Repollet, M., Connelly, M.C., Rao, C., et al. (2004). Опухолевые клетки циркулируют в периферической крови всех основных карцином, но не у здоровых субъектов или пациентов с доброкачественными заболеваниями. Clin. Рак Res . 10, 6897–6904. DOI: 10.1158 / 1078-0432.CCR-04-0378

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Амери К., Луонг Р., Чжан Х., Пауэлл А. А., Монтгомери К. Д., Эспиноза И. и др. (2010). Циркулирующие опухолевые клетки демонстрируют измененный ответ на гипоксию и агрессивный фенотип. Br. J. Cancer 102, 561–569. DOI: 10.1038 / sj.bjc.6605491

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Арора, А., Симоне, Г., Салиб-Бойгелаар, Г. Б., Ким, Дж. Т., и Манц, А. (2010). Последние разработки в области систем микро-общего анализа. Анал. Chem . 82, 4830–4847. DOI: 10.1021 / ac100969k

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Бхагат А.А., Боу, Х., Хоу, Х.В., Тан, С.Дж., Хан, Дж. И Лим, К.Т. (2010). Микрофлюидика для разделения клеток. Med. Биол. Англ. Вычислить . 48, 999–1014. DOI: 10.1007 / s11517-010-0611-4

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Бланко, Л., и Салас, М. (1984). Характеристика и очистка ДНК-полимеразы, кодируемой фагом phi 29, необходимой для инициации репликации. Proc. Natl. Акад. Sci. США . 81, 5325–5329. DOI: 10.1073 / pnas.81.17.5325

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Боннер Р. Ф., Эммерт-Бак М., Коул К., Похида Т., Чуаки Р., Гольдштейн С. и др. (1997). Лазерная микродиссекция: молекулярный анализ ткани. Наука 278, 1481, 1483.

    PubMed Аннотация | Google Scholar

    Citri, A., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M., and Malenka, R. C. (2012). Комплексное профилирование экспрессии генов с помощью КПЦР в отдельных нейрональных клетках. Nat. Протокол . 7, 118–127. DOI: 10.1038 / nprot.2011.430

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Cizkova, D., Cizek, M., Nagyova, M., Slovinska, L., Novotna, I., Jergova, S., et al. (2009). Обогащение клеток-предшественников олигодендроцитов крысы с помощью магнитной сортировки клеток. J. Neurosci. Методы 184, 88–94. DOI: 10.1016 / j.jneumeth.2009.07.030

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Клунан Н., Форрест А. Р., Колле Г., Гардинер Б. Б., Фолкнер Г. Дж., Браун М. К. и др. (2008). Профилирование транскриптома стволовых клеток с помощью массового секвенирования мРНК. Nat. Методы 5, 613–619. DOI: 10.1038 / nmeth.1223

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Датта, С., Малхотра, Л., Дикерсон, Р., Чаффи, С., Сен, К. К., и Рой, С. (2015). Микродиссекция лазерного захвата: большие данные из небольших образцов. Histol. Гистопатол . 30, 1255–1269. DOI: 10.14670 / HH-11-622

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Дин, Ф. Б., Хосоно, С., Фанг, Л., Ву, X., Фаруки, А. Ф., Брей-Уорд, П., и др. (2002). Комплексная амплификация генома человека с использованием множественной амплификации смещения. Proc. Natl. Акад. Sci. США . 99, 5261–5266.DOI: 10.1073 / pnas.082089499

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Денг, Г., Херрлер, М., Берджесс, Д., Манна, Э., Краг, Д., и Берк, Дж. Ф. (2008). Обогащение антицитокератином отдельно или в сочетании с антителами против EpCAM значительно увеличивает чувствительность обнаружения циркулирующих опухолевых клеток у пациентов с метастатическим раком молочной железы. Резолюция о раке молочной железы . 10: R69. DOI: 10.1186 / bcr2131

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Дэн, Г., Кришнакумар, С., Пауэлл, А. А., Чжан, Х., Миндринос, М. Н., Телли, М. Л. и др. (2014). Одноклеточный мутационный анализ PIK3CA в циркулирующих опухолевых клетках и метастазах при раке молочной железы показывает гетерогенность, несоответствие и персистентность мутаций в культивируемых диссеминированных опухолевых клетках из костного мозга. BMC Рак 14: 456. DOI: 10.1186 / 1471-2407-14-456

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Де Роса, С. К., Герценберг, Л. А., и Родерер, М.(2001). 11-цветная 13-параметрическая проточная цитометрия: идентификация наивных Т-клеток человека по фенотипу, функции и разнообразию рецепторов Т-клеток. Nat. Мед . 7, 245–248. DOI: 10.1038 / 84701

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Динг, Л., Лей, Т. Дж., Ларсон, Д. Э., Миллер, К. А., Кобольд, Д. К., Велч, Дж. С. и др. (2012). Клональная эволюция при рецидиве острого миелоидного лейкоза, выявленная с помощью полногеномного секвенирования. Природа 481, 506–510.DOI: 10.1038 / nature10738

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Эбервайн, Дж., Йе, Х., Мияширо, К., Цао, Ю., Наир, С., Финнелл, Р. и др. (1992). Анализ экспрессии генов в отдельных живых нейронах. Proc. Natl. Акад. Sci. США . 89, 3010–3014. DOI: 10.1073 / pnas.89.7.3010

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Эйрев, П., Стейф, А., Хаттра, Дж., Ха, Г., Яп, Д., Фарахани, Х. и др. (2015). Динамика геномных клонов в ксенотрансплантатах больных раком молочной железы при одноклеточном разрешении. Природа 518, 422–426. DOI: 10.1038 / природа13952

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Эммерт-Бак, М. Р., Боннер, Р. Ф., Смит, П. Д., Чуаки, Р. Ф., Чжуан, З., Голдштейн, С. Р. и др. (1996). Лазерная микродиссекция. Наука 274, 998–1001. DOI: 10.1126 / science.274.5289.998

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Эмрих, К. А., Мединц, И. Л., Чу, В. К., и Мэтис, Р. А.(2007). Микрофабричное устройство для двумерного электрофореза для профилирования дифференциальной экспрессии белков. Анал. Chem . 79, 7360–7366. DOI: 10.1021 / ac0711485

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Эспозито, Г. (2007). Дополнительные методы: микродиссекция с помощью лазерного захвата - повышение специфичности профилей экспрессии генов в образцах рака. Adv. Exp. Med. Биол . 593, 54–65. DOI: 10.1007 / 978-0-387-39978-2_6

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Герлингер, М., Роуэн, А.Дж., Хорсвелл, С., Ларкин, Дж., Эндесфельдер, Д., Гронроос, Э. и др. (2012). Внутриопухолевая гетерогенность и разветвленная эволюция выявлены с помощью мультирегионального секвенирования. N. Engl. J. Med . 366, 883–892. DOI: 10.1056 / NEJMoa1113205

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Гросс А., Шендубе Дж., Циммерманн С., Стиб М., Зенгерле Р. и Колтай П. (2015). Технологии выделения одноклеточных. Внутр. J. Mol. Sci . 16, 16897–16919.DOI: 10.3390 / ijms160816897

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Грюн Д., Любимова А., Кестер Л., Вибрандс К., Басак О., Сасаки Н. и др. (2015). Секвенирование одноклеточной матричной РНК позволяет выявить редкие типы клеток кишечника. Природа 525, 251–255. DOI: 10.1038 / природа14966

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Grützkau, A., and Radbruch, A. (2010). Маленький, но мощный: как MACS-технология, основанная на наноразмерных суперпарамагнитных частицах, помогла проанализировать иммунную систему за последние 20 лет. Cytometry A 77, 643–647. DOI: 10.1002 / cyto.a.20918

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Haselgrübler, T., Haider, M., Ji, B., Juhasz, K., Sonnleitner, A., Balogi, Z., et al. (2014). Многопараметрический анализ отдельных ячеек с высокой пропускной способностью. Анал. Биоанал. Chem . 406, 3279–3296. DOI: 10.1007 / s00216-013-7485-x

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Хашимото, М., Барани, Ф., Сюй, Ф., и Сопер, С.А. (2007). Последовательная обработка биологических реакций с использованием проточных микрофлюидных устройств: сопряженная ПЦР / LDR для обнаружения точечных мутаций ДНК с низким содержанием. Аналитик 132, 913–921. DOI: 10.1039 / b700071e

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Hou, Y., Song, L., Zhu, P., Zhang, B., Tao, Y., Xu, X., et al. (2012). Секвенирование одноклеточного экзома и моноклональная эволюция JAK2-негативного миелопролиферативного новообразования. Ячейка 148, 873–885.DOI: 10.1016 / j.cell.2012.02.028

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Хуберт Р., Вебер Дж. Л., Шмитт К., Чжан Л. и Арнхейм Н. (1992). Новый источник полиморфных ДНК-маркеров для типирования сперматозоидов: анализ микросателлитных повторов в единичных клетках. Am. J. Hum. Генет . 51, 985–991.

    PubMed Аннотация | Google Scholar

    Хьюз, А.Э., Магрини, В., Деметер, Р., Миллер, К.А., Фултон, Р., Фултон, Л.Л. и др. (2014).Клональная архитектура вторичного острого миелоидного лейкоза, определенная с помощью секвенирования одной клетки. PLoS Genet . 10: e1004462. DOI: 10.1371 / journal.pgen.1004462

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Irish, J. M., Hovland, R., Krutzik, P.O., Perez, O. D., Bruserud, O., Gjertsen, B.T., et al. (2004). Профилирование отдельных клеток потенцированных фосфобелковых сетей в раковых клетках. Cell 118, 217–228. DOI: 10.1016 / j.cell.2004.06.028

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ким, К.Т., Ли, Х. У., Ли, Х. О., Ким, С. С., Со, Й. Дж., Чанг, В. и др. (2015). Секвенирование одноклеточной мРНК выявляет субклональную гетерогенность в ответах клеток аденокарциномы легких на противораковые препараты. Биология генома . 16: 127. DOI: 10.1186 / s13059-015-0692-3

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Кляйн, К.А., Шмидт-Киттлер, О., Шардт, Дж. А., Пантель, К., Спайхер, М. Р., и Ритмюллер, Г. (1999). Сравнительная геномная гибридизация, потеря гетерозиготности и анализ последовательности ДНК отдельных клеток. Proc. Natl. Акад. Sci. США . 96, 4494–4499. DOI: 10.1073 / pnas.96.8.4494

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Куммари, Э., Го-Росс, С. X., Иеллс, Дж. Б. (2015). Микродиссекция с лазерным захватом - демонстрация изоляции отдельных дофаминовых нейронов и всей вентральной области покрышки. J. Vis. Опыт . 96: e52336. DOI: 10.3791 / 52336

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Леко, В., Уайт, А.К., Сингхал, А., и Хансен, К.Л. (2012). Микрожидкостный анализ отдельных клеток: от обещания к практике. Curr. Opin. Chem. Биол . 16, 381–390. DOI: 10.1016 / j.cbpa.2012.03.022

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ли, Дж. Х., Даугарти, Э. Р., Шейман, Дж., Калхор, Р., Янг, Дж. Л., Ферранте, Т. К. и др. (2014). Высоко мультиплексное секвенирование субклеточной РНК in situ . Science 343, 1360–1363. DOI: 10.1126 / наука.1250212

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ли П., Гао Ю. и Паппас Д. (2012a). Многопараметрическая аффинная хроматография клеток: разделение и анализ в одном микрофлюидном канале. Анал. Chem . 84, 8140–8148. DOI: 10.1021 / ac302002a

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ли, X., Льюис, M. T., Huang, J., Gutierrez, C., Osborne, C. K., Wu, M. F., et al. (2008). Внутренняя резистентность онкогенных клеток рака молочной железы к химиотерапии. J. Natl. Институт рака . 100, 672–679. DOI: 10.1093 / jnci / djn123

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ли Ю., Сюй X., Сонг Л., Хоу Й., Ли З., Цанг С. и др. (2012b). Анализ секвенирования отдельных клеток характеризует общие и специфичные для клеточного происхождения мутации при мышечно-инвазивном раке мочевого пузыря. Gigascience 1:12. DOI: 10.1186 / 2047-217X-1-12

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Лю, Л., Li, Y., Li, S., Hu, N., He, Y., Pong, R., et al. (2012). Сравнение систем секвенирования нового поколения. J. Biomed. Биотехнология . 2012: 251364. DOI: 10.1155 / 2012/251364

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Лю Н., Лю Л. и Пань X. (2014). Одноклеточный анализ транскриптома и его применение для характеристики стволовых клеток и ранних эмбрионов. Cell. Мол. Наука о жизни . 71, 2707–2715. DOI: 10.1007 / s00018-014-1601-8

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Лю П., Со Т. С., Бейор Н., Шин К. Дж., Шерер Дж. Р. и Мэтис Р. А. (2007). Интегрированная портативная микросистема для полимеразной цепной реакции и капиллярного электрофореза для быстрой судебно-медицинской экспертизы с коротким тандемным повторным типированием. Анал. Chem . 79, 1881–1889. DOI: 10.1021 / ac061961k

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Льоренс-Бобадилла, Э., Чжао, С., Басер, А., Саиз-Кастро, Г., Звадло, К., и Мартин-Вильяльба, А. (2015). Одноклеточная транскриптомика выявляет популяцию спящих нервных стволовых клеток, которые активируются при повреждении головного мозга. Стволовые клетки клетки 17, 329–340. DOI: 10.1016 / j.stem.2015.07.002

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ловатт, Д., Рубль, Б. К., Ли, Дж., Дук, Х., Ким, Т. К., Фишер, С. и др. (2014). Транскриптом in vivo анализ (TIVA) пространственно определенных одиночных клеток в живой ткани. Nat. Методы 11, 190–196. DOI: 10.1038 / nmeth.2804

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Лу, С., Цзун, К., Fan, W., Yang, M., Li, J., Chapman, A.R., et al. (2012). Исследование мейотической рекомбинации и анеуплоидии отдельных сперматозоидов с помощью полногеномного секвенирования. Наука 338, 1627–1630. DOI: 10.1126 / science.1229112

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Марси Ю., Ишой Т., Ласкен Р. С., Стоквелл Т. Б., Валенц Б. П., Халперн А. Л. и др. (2007). Нанолитровые реакторы улучшают многократную амплификацию генома из отдельных клеток. PLoS Genet .3: e155. DOI: 10.1371 / journal.pgen.0030155

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Меллорс, Дж. С., Джорабчи, К., Смит, Л. М., и Рэмси, Дж. М. (2010). Интегрированное микрофлюидное устройство для автоматического анализа отдельных клеток с использованием электрофоретического разделения и масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением. Анал. Chem . 82, 967–973. DOI: 10.1021 / ac8y

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Мортазави, А., Уильямс, Б.А., Макку, К., Шеффер, Л., и Уолд, Б. (2008). Картирование и количественная оценка транскриптомов млекопитающих с помощью RNA-Seq. Nat. Методы 5, 621–628. DOI: 10.1038 / nmeth.1226

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Награт С., Секвист Л. В., Махесваран С., Белл Д. В., Иримиа Д., Улкус Л. и др. (2007). Выделение редких циркулирующих опухолевых клеток у онкологических больных с помощью микрочиповой технологии. Природа 450, 1235–1239. DOI: 10.1038 / природа06385

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Намбури П., Бейелер А., Йорозу С., Калхун Г. Г., Хальберт С. А., Вичманн Р. и др. (2015). Схема механизма различения положительных и отрицательных ассоциаций. Nature 520, 675–678. DOI: 10.1038 / природа14366

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Navin, N., Kendall, J., Troge, J., Andrews, P., Rodgers, L., Mcindoo, J., et al. (2011).Эволюция опухоли определяется одноклеточным секвенированием. Nature 472, 90–94. DOI: 10.1038 / nature09807

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Пагириган, А. Л., Смит, Дж., Мешинчи, С., Кэрролл, М., Мали, К., и Радич, Дж. П. (2015). Одноклеточное генотипирование демонстрирует сложное клональное разнообразие при остром миелоидном лейкозе. Sci. Пер. Мед . 7: 281re282. DOI: 10.1126 / scitranslmed.aaa0763

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Пан, X., Durrett, R.E., Zhu, H., Tanaka, Y., Li, Y., Zi, X., et al. (2013). Два метода секвенирования полноразмерной РНК для небольшого количества клеток и отдельных клеток. Proc. Natl. Акад. Sci. США . 110, 594–599. DOI: 10.1073 / pnas.1217322109

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Пател А. П., Тирош И., Тромбетта Дж. Дж., Шалек А. К., Гиллеспи С. М., Вакимото Х. и др. (2014). Одноклеточная РНК-seq подчеркивает внутриопухолевую гетерогенность первичной глиобластомы. Наука 344, 1396–1401. DOI: 10.1126 / science.1254257

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Перес, О. Д., и Нолан, Г. П. (2002). Одновременное измерение нескольких состояний активных киназ с помощью полихроматической проточной цитометрии. Nat. Биотехнология . 20, 155–162. DOI: 10.1038 / nbt0202-155

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Перфетто, С. П., Чаттопадхай, П. К., и Родерер, М. (2004).Семнадцатицветная проточная цитометрия: разгадка иммунной системы. Nat. Ред. Иммунол . 4, 648–655. DOI: 10.1038 / nri1416

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Пауэлл А. А., Таласаз А. Х., Чжан Х., Корам М. А., Редди А., Дэн Г. и др. (2012). Профилирование отдельных клеток циркулирующих опухолевых клеток: транскрипционная гетерогенность и разнообразие клеточных линий рака молочной железы. PLoS ONE 7: e33788. DOI: 10.1371 / journal.pone.0033788

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ритдорф, С., Fritsche, H., Muller, V., Rau, T., Schindlbeck, C., Rack, B., et al. (2007). Обнаружение циркулирующих опухолевых клеток в периферической крови пациентов с метастатическим раком молочной железы: валидационное исследование системы CellSearch. Clin. Рак Res . 13, 920–928. DOI: 10.1158 / 1078-0432.CCR-06-1695

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Руис К., Ленкевич Э., Эверс Л., Холли Т., Робсон А., Кифер Дж. И др. (2011). Продвижение клинически значимого взгляда на клональную природу рака. Proc. Natl. Акад. Sci. США . 108, 12054–12059. DOI: 10.1073 / pnas.1104009108

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Сакс К., Перес О., Пеер Д., Лауффенбургер Д. А. и Нолан Г. П. (2005). Причинные белковые сигнальные сети, полученные из многопараметрических данных одной клетки. Наука 308, 523–529. DOI: 10.1126 / science.1105809

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Шор, С. Л., и Шор, А.М. (2001). Фенотипические и генетические изменения в строме молочной железы: последствия для прогрессирования опухоли. Резолюция о раке молочной железы . 3, 373–379. DOI: 10.1186 / bcr325

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Шульц, К. Р., Данна, Э. А., Круцик, П. О., и Нолан, Г. П. (2012). Одноклеточный фосфобелковый анализ методом проточной цитометрии. Curr. Protoc. Иммунол . Глава 8: Раздел 8. 17, 11–20. DOI: 10.1002 / 0471142735.im0817s96

    CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Шарма, С.В., Ли, Д. Ю., Ли, Б., Куинлан, М. П., Такахаши, Ф., Махесваран, С. и др. (2010). Опосредованное хроматином обратимое состояние лекарственной толерантности в субпопуляциях раковых клеток. Cell 141, 69–80. DOI: 10.1016 / j.cell.2010.02.027

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Spits, C., Le Caignec, C., De Rycke, M., Van Haute, L., Van Steirteghem, A., Liebaers, I., et al. (2006). Полногеномная амплификация множественного смещения из одиночных клеток. Nat.Протокол . 1, 1965–1970. DOI: 10.1038 / nprot.2006.326

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Сквайрс, Т. М., и Квейк, С. Р. (2005). Микрофлюидика: физика жидкости в нанолитровом масштабе. Ред. Мод. Phys . 77, 977–1026. DOI: 10.1103 / RevModPhys.77.977

    CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Шривастава Н., Бреннан Дж. С., Рензи Р. Ф., Ву М., Бранда С. С., Сингх А. К. и др. (2009). Полностью интегрированная микрофлюидная платформа, позволяющая автоматизировать фосфопрофилирование макрофагального ответа. Анал. Chem . 81, 3261–3269. DOI: 10.1021 / ac8024224

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Су, X., Кирквуд, С. Э., Гупта, М., Маркес-Кертис, Л., Цю, Ю., Яновска-Вичорек, А., и др. (2011). Микрофлюидная цитометрия без меток на основе микроскопа. Опт. Экспресс 19, 387–398. DOI: 10.1364 / OE.19.000387

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Таласаз, А.Х., Пауэлл, А.А., Хубер, Д.Э., Берби, Дж.Г., Ро, К. Х., Ю, В. и др. (2009). Изоляция высокообогащенных популяций циркулирующих эпителиальных клеток и других редких клеток из крови с помощью устройства магнитной очистки. Proc. Natl. Акад. Sci. США . 106, 3970–3975. DOI: 10.1073 / pnas.0813188106

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Телениус, Х., Картер, Н. П., Бебб, К. Э., Норденшельд, М., Пондер, Б. А., и Туннаклифф, А. (1992). ПЦР с вырожденными олигонуклеотидами: общая амплификация целевой ДНК с помощью одного вырожденного праймера. Геномика 13, 718–725. DOI: 10.1016 / 0888-7543 (92) -K

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Усоскин, Д., Фурлан, А., Ислам, С., Абдо, Х., Лоннерберг, П., Лу, Д. и др. (2015). Беспристрастная классификация типов сенсорных нейронов путем крупномасштабного секвенирования одноклеточной РНК. Nat. Neurosci . 18, 145–153. DOI: 10.1038 / nn.3881

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    VanDijken, J., Kaigala, G.В., Лаузон, Дж., Атражев, А., Адамия, С., Тейлор, Б. Дж. И др. (2007). Микрожидкостные чипы для обнаружения транслокации t (4; 14) и мониторинга заболевания во время лечения с использованием анализа обратной транскриптазы-полимеразной цепной реакции гибридных транскриптов IgH-MMSET. J. Mol. Диагностика . 9, 358–367. DOI: 10.2353 / jmoldx.2007.060149

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Wang, Y., Waters, J., Leung, M. L., Unruh, A., Roh, W., Shi, X., et al. (2014).Клональная эволюция рака груди, выявленная с помощью одноядерного секвенирования генома. Природа 512, 155–160. DOI: 10.1038 / природа13600

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Вельцель Г., Зейтц Д. и Шустер С. (2015). Магнитно-активированная сортировка клеток (MACS) может использоваться как крупномасштабный метод для создания культур нейрональных клеток рыбок данио. Sci. Реп . 5: 7959. DOI: 10.1038 / srep07959

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Ву, А.R., Neff, N.F., Kalisky, T., Dalerba, P., Treutlein, B., Rothenberg, M.E., et al. (2014). Количественная оценка методов секвенирования одноклеточной РНК. Nat. Методы 11, 41–46. DOI: 10.1038 / nmeth.2694

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Xu, X., Hou, Y., Yin, X., Bao, L., Tang, A., Song, L., et al. (2012). Секвенирование одноклеточного экзома выявляет характеристики однонуклеотидной мутации опухоли почки. Cell 148, 886–895.DOI: 10.1016 / j.cell.2012.02.025

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Yu, C., Yu, J., Yao, X., Wu, W. K., Lu, Y., Tang, S., et al. (2014). Открытие биклонального происхождения и нового онкогена SLC12A5 при раке толстой кишки путем одноклеточного секвенирования. Ячейка Res . 24, 701–712. DOI: 10.1038 / cr.2014.43

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Чжан, X., Марджани, С. Л., Ху, З., Вайсман, С. М., Пан, X., и Ву, С.(2016). Секвенирование отдельных клеток для точных исследований рака: успехи и перспективы. Cancer Res . 76, 1305–1312. DOI: 10.1158 / 0008-5472.CAN-15-1907

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Zong, C., Lu, S., Chapman, A. R., and Xie, X. S. (2012). Общегеномное обнаружение однонуклеотидных вариаций и вариаций числа копий одной клетки человека. Наука 338, 1622–1626. DOI: 10.1126 / science.1229164

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Разделение клеток и изоляция клеток: методы, методы, приложения


    Клеточная биология сложна, учитывая множество переменных, которые исследователи должны знать и учитывать, чтобы получить значимые результаты.Проведение экспериментов на изолированной популяции клеток, а не на гетерогенной смеси клеток, является распространенным подходом к снижению сложности эксперимента. Это позволяет клеточным биологам уверенно относить наблюдаемые эффекты и реакции к определенному типу клеток. Таким образом, владение основными методами выделения клеток - ценный навык для любого клеточного биолога. Вот все, что вам нужно знать о разделении клеток.


    Что такое разделение клеток?

    Разделение клеток, также обычно называемое изоляцией клеток или сортировкой клеток, представляет собой процесс выделения одной или нескольких специфических популяций клеток из гетерогенной смеси клеток.Существует ряд доступных методов разделения клеток, каждый из которых имеет свои плюсы и минусы.



    Как ученые готовят образцы для разделения клеток?

    Есть много разных способов подготовить образцы для оптимального выделения клеток. Выбранный вами метод зависит от исходного образца и может включать удаление из него определенных элементов или просто создание одноклеточной суспензии.

    Разделение клеток может быть выполнено на различных сложных биологических образцах, включая:


    Выделить клетки из крови

    Подробный обзор методов выделения различных популяций клеток из образцов крови.

    Подробнее>

    Выделить клетки из тканей

    Методы выделения клеток из таких тканей, как селезенка и лимфатические узлы.

    Подробнее>

    Какие методы и методы разделения клеток доступны?

    Есть много разных способов изолировать клетки из сложных биологических образцов. Общие характеристики, используемые для выделения клеток, включают размер клеток, плотность клеток, форму клеток и экспрессию поверхностных белков.Наиболее распространенные методы разделения клеток включают:

    Существуют также менее часто используемые методы разделения клеток, включая сортировку клеток с активацией плавучести, выделение клеток на основе аптамера, истощение комплемента и многое другое.

    Посмотреть все методы разделения клеток>


    Выбор метода разделения клеток, отвечающего вашим исследовательским потребностям

    Узнайте больше о методах разделения ячеек, описанных выше, чтобы выбрать лучший метод для вашего приложения.

    Сравнить методы>

    Некоторые методы могут использоваться в комбинации для повышения эффективности и улучшения характеристик изоляции ячеек. Например, клетки могут быть предварительно обогащены с использованием иммуномагнитного разделения клеток перед сортировкой клеток, активируемой флуоресценцией (FACS). Это может быть особенно полезно при выделении популяций редких клеток (например, предварительное обогащение врожденных лимфоидных клеток (ILC) перед сортировкой по потоку) или конкретных подмножеств в пределах данной популяции.


    Как выбрать лучший метод разделения клеток для своего исследования?

    Есть несколько факторов, которые можно использовать для определения того, какой метод выделения клеток использовать. В зависимости от предполагаемого последующего применения изолированных клеток, ученые должны учитывать производительность (т.е. чистоту и извлечение) и эффективность метода разделения клеток, а также жизнеспособность и функцию изолированных клеток.

    Производительность

    Ключевыми показателями эффективности методов разделения клеток обычно являются чистота и извлечение.

    • Чистота относится к доле желаемых клеток в конечной фракции выделенных клеток и обычно выражается в процентах от общего числа живых клеток. Чистоту чаще всего измеряют с помощью проточной цитометрии. Он показывает, может ли конечная выделенная популяция клеток в достаточной степени представлять характеристики этого конкретного типа клеток без мешающих эффектов других типов клеток.
    • Recovery отвечает на вопрос: из всех желаемых клеток, которые вы можете получить из своего образца, сколько вы действительно можете выделить? И наоборот, сколько желаемых клеток вы потеряли из-за метода разделения клеток? Узнайте, как оценить восстановление после процедур выделения клеток>

    Жизнеспособность и функции

    Как жизнеспособность, так и функция изолированных клеток важны, когда исследователям нужны живые очищенные клетки для последующего культивирования клеток и других приложений.

    • Жизнеспособность можно выразить как процент живых клеток в изолированном образце.
    • Функция клеток, которые вы изолируете, должны сохраняться на протяжении всего процесса разделения клеток, чтобы ваши последующие анализы точно отражали физиологическую функцию интересующего типа клеток.

    КПД

    Ученые часто работают сверхурочно и одновременно работают над несколькими проектами.Выбор эффективных методов поможет вам преодолеть потребности научных исследований и достичь большего за меньшее время. Пропускная способность, скорость, простота использования и автоматизация - все это важные переменные, которые следует учитывать для максимальной эффективности изоляции вашей ячейки.

    • Пропускная способность относится к скорости, с которой может быть выполнено разделение ячеек с точки зрения объема выборки, количества ячеек или количества выборок. Если вы работаете с большими объемами образцов или с несколькими образцами одновременно, вам нужно подумать, какая технология разделения клеток может обеспечить желаемую пропускную способность.
    • Скорость означает время, необходимое для завершения процедуры изоляции ячейки. Более быстрые протоколы разделения ячеек желательны, если вам нужно увеличить пропускную способность и добиться большего за время, проведенное в лаборатории. Некоторые из самых быстрых наборов для выделения клеток позволяют выделить высокоочищенные клетки всего за 8 минут.
    • Простота использования способствует надежности и воспроизводимости метода разделения клеток. Простые протоколы являются ключом к сокращению ошибок и изменчивости, вызываемых пользователем.
    • Автоматизация может уменьшить вариативность, ограничить количество необходимого рабочего времени и позволить вам больше тратить время в лаборатории. Инструменты автоматического разделения клеток также снижают риск контакта с опасными патогенами при работе с потенциально инфекционными образцами.

    Критерии оценки методов разделения клеток

    Есть много параметров, которые вы можете учитывать при выборе правильного метода выделения клеток для вашего исследования.

    Посмотреть больше параметров>

    Эффективные технологии разделения клеток

    Мы рекомендуем вам выбрать технологии разделения клеток, которые помогут вам добиться максимальной эффективности и получить высокоочищенные функциональные клетки, необходимые для ваших исследований. Более умные и продуманные технологии позволят вам добиться большего, проведя время в лаборатории.

    Ниже приведены некоторые из технологий изоляции клеток, которые мы разработали с расчетом на эффективность:

    EasySep ™ Иммуномагнитное отделение клеток

    Изолируйте клетки с помощью простой заливки всего за 8 минут.

    Узнать больше>

    Автоматическое иммуномагнитное разделение клеток RoboSep ™

    Изолируйте клетки до 16 образцов одновременно с минимальными затратами времени.

    Узнать больше>

    RosetteSep ™ Изоляция клеток иммунной плотности

    Изолируйте подмножества клеток человека непосредственно из цельной крови во время центрифугирования в градиенте плотности.

    Узнать больше>

    Изолирующие пробирки из РВМС SepMate ™

    Изолируйте PBMC всего за 15 минут.

    Узнать больше>

    Мой опыт работы с EasySep ™ был безупречным. Протокол прост и быстр, почти слишком прост и позволил мне успешно изолировать интересующие клетки с высокой степенью чистоты.Это дает мне дополнительное время для других экспериментов и дает мне уверенность в своих данных.

    У меня нет опыта работы с другими продуктами для изоляции клеток, но сейчас мне нет необходимости искать что-либо еще, поскольку EasySep ™ прост и выполняет свою работу безупречно!

    Мэтью Кормье, кандидат наук


    Изучите эти ресурсы

    Видео

    Как работает технология магнитного разделения клеток EasySep ™: быстрое и простое выделение клеток

    Видео

    Как работают изолирующие пробирки SepMate ™ PBMC: от цельной крови до PBMC за 15 минут

    Настенная диаграмма

    Частоты и процентное содержание типов иммунных клеток мышей

    Настенная диаграмма

    Частоты типов клеток в периферической крови человека

    Изоляционные барьеры | BioNinja

    Понимание:

    • Репродуктивная изоляция популяций может быть временной, поведенческой или географической


    Репродуктивная изоляция происходит, когда барьеры препятствуют скрещиванию двух популяций - сохраняя их генофонды отдельными

    Существуют две основные категории барьеров репродуктивной изоляции:

    • Презиготическая изоляция - происходит до того, как может произойти оплодотворение (потомство не производится)
    • Постзиготный изоляция - происходит после оплодотворения (потомство либо нежизнеспособно, либо бесплодно)


    Презиготные барьеры изоляции могут быть временными, поведенческими, географическими / экологическими или механическими; тогда как постзиготные барьеры изоляции включают неспособность, бесплодие или разрушение гибридных организмов

    Механизмы репродуктивной изоляции


    Временная изоляция

    • Временная изоляция происходит, когда две популяции различаются по периодам активности или репродуктивным циклам
    • Пример: Леопардовые лягушки и древесные лягушки достигают половой зрелости в разное время весной и, следовательно, не могут скрещиваться

    Поведенческая изоляция

    • Поведенческая изоляция происходит, когда две популяции демонстрируют разные специфические модели ухаживания
    • Пример: Определенные популяции сверчков могут быть морфологически идентичными, но реагировать только на определенные песни спаривания

    02 902 Изоляция

    • Географическая изоляция возникает, когда две популяции занимают разные места обитания или отдельные ниши в пределах одного региона
    • Пример: львы и тигры занимают разные места обитания и не скрещиваются (обычно)

    910 76 типов репродуктивной изоляции

    Выделение ДНК - обзор

    4.1 Отбор и хранение крови

    Из-за низкого содержания ctDNA крайне важно минимизировать фоновые уровни gDNA, чтобы обеспечить точные измерения уровней cfDNA. Преаналитические проблемы, которые возникают в период между забором крови и выделением ДНК, включают задержки в обработке крови, температуру хранения крови, перемешивание образца во время транспортировки и транспортировку крови, что может повлиять на уровни вкДНК и загрязнить цтДНК гДНК, высвобожденной из лизированных клеток крови. [102].В большинстве существующих исследований для забора крови обычно используются стандартные пробирки с ЭДТА. Однако было показано, что увеличение абсолютной концентрации ДНК в плазме наблюдалось, если время между забором крови и экстракцией плазмы превышало 6 ч [103]. Поэтому рекомендуется немедленно, но ни в коем случае не дольше 3 часов, центрифугировать, изолировать и замораживать плазму после отбора проб, чтобы предотвратить загрязнение вкДНК гДНК во время обработки, транспортировки и хранения образцов [104].Безусловно, существуют клинические сценарии, при которых немедленная обработка образца после венепункции не может быть гарантирована, и во многих случаях, в основном в ходе многоцентровых исследований, кровь берется в одном месте и анализируется в другом, что требует определенной транспортировки. Следовательно, возникла потребность в средствах стабилизации клеток, предотвращающих лизис клеток [105].

    Все большее число исследовательских групп в настоящее время используют пробирки cfDNA BCT Streck (Streck, Omaha, NE, USA) для стабилизации крови для бесклеточного анализа ДНК плазмы.Эти пробирки содержат консервант, который стабилизирует лейкоциты, а также консервант, не содержащий формальдегида, который стабилизирует ядросодержащие клетки крови, тем самым предотвращая высвобождение клеточной гДНК. Кроме того, он ингибирует опосредованную нуклеазой деградацию вкДНК, способствуя общей стабилизации вкДНК. По заявлению производителя, образцы, собранные в пробирки cfDNA BCT, стабильны до 14 дней при температуре от 6 до 37 ° C, что обеспечивает удобный сбор, транспортировку и хранение образцов [106].Однако серьезным недостатком является то, что пробирки намного дороже стандартных пробирок для забора крови. Добавление формальдегида (пробирка с ЭДТА, содержащая 225 мкл 10% формальдегида (4%, мас. / Об.)) Может обеспечить более дешевую альтернативу использованию пробирок с вкДНК BCT [57,58,88].

    Торо и др. сравнил свойства двух стабилизирующих клетки реагентов, пробирки BCT cfDNA (Streck) и пробирки PAXgene (Qiagen), используя цифровую ПЦР по каплям (ddPCR) для измерения геномных эквивалентов (GE) ДНК плазмы.Их данные показали, что кровь, хранившаяся в течение 7 дней в пробирках BCT, не показала доказательств лизиса клеток, тогда как пробирки PAXgene показали увеличение GE на порядок, что свидетельствует о значительном клеточном лизисе [107]. Совсем недавно проведенное исследование подтвердило пользу пробирок с вкДНК BCT [108]. При использовании различных методов обработки, таких как 72-часовая инкубация перед обработкой, пробирки cfDNA BCT лучше стабилизировали кровь по сравнению с пробирками для сбора EDTA, о чем свидетельствует снижение выхода ДНК. Основываясь на своих данных, авторы рекомендовали использовать пробирки с вкДНК BCT для клинических условий, в которых немедленная обработка (<2 ч) плазмы невозможна [108].Более того, было показано, что щадящий гемолиз образцов крови вызывает повышение уровня нуклеосом в плазме [109]. Аналогичные данные были получены от Norton et al. , который сообщил, что перемешивание образцов крови с ЭДТА привело к значительному увеличению концентрации вкДНК по сравнению с непоколебимыми образцами [105]. В этом контексте Qiagen представила систему ccfDNA крови PAXgene®, разработанную PreAnalytiX (совместное предприятие QIAGEN и BD), состоящую из пробирки ccfDNA крови PAXgene - пластиковой пробирки для забора крови с уникальным химическим составом, не образующим перекрестных связей, сохраняющим внеклеточные уровни вкДНК и предотвращающим выброс внутриклеточной ДНК из клеток в плазму, который был запущен в апреле этого года.Взятые вместе, существует тенденция к использованию стабилизирующих клетки реагентов, чтобы стать современным [110].


    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

    *
    *