Протеин

Протеин а: Ассоциированный с беременностью протеин А плазмы (PAPP-A)

alexxlab -- 06.05.202121.03.2021

Комментариев к записи Протеин а: Ассоциированный с беременностью протеин А плазмы (PAPP-A) нет

Содержание

PAPP-A (Ассоциированный с беременностью протеин-А плазмы, Pregnancy-associated)

Метод определения Иммуноанализ.

Исследуемый материал Сыворотка крови

Доступен выезд на дом

Ассоциированный с беременностью протеин-А плазмы. В пренатальном скрининге I триместра беременности – маркёр риска синдрома Дауна и других хромосомных аномалий плода.

PAPP-A — высокомолекулярный гликопротеин (м.в. около 800 кДа). При беременности вырабатывается в большом количестве трофобластом и поступает в материнскую систему циркуляции, концентрация его в сыворотке крови матери увеличивается с увеличением срока беременности. По биохимическим свойствам PAPP-A относят к металлопротеазам. Он обладает способностью расщеплять один из белков, связывающих инсулиноподобный фактор роста. Это вызывает повышение биодоступности инсулиноподобного фактора роста, который является важным фактором развития плода во время беременности. Предполагается, что РАРР-А участвует также в модуляции иммунного ответа материнского организма при беременности. Аналогичный белок в низких концентрациях присутствует также в крови мужчин и небеременных женщин. Физиологическая роль РАРР-А продолжает исследоваться.

Ряд серьёзных клинических исследований свидетельствует о диагностической значимости РАРР-А в качестве скринингового маркёра риска хромосомных аномалий плода на ранних сроках беременности (в первом триместре), что является принципиально важным в диагностике хромосомных аномалий. Уровень РАРР-А значительно снижен при наличии у плода трисомии 21 (синдром Дауна) или трисомии 18 (синдром Эдвардса). Кроме того, этот тест информативен также при оценке угрозы выкидыша и остановки беременности на малых сроках.

Изолированное исследовние уровня РАРР-А в качестве маркёра риска синдрома Дауна имеет диагностическое значение, начиная с 8 — 9 недель беременности. В комплексе с определением бета-ХГЧ (хорионического гонадотропина человека) определение РАРР-А оптимально проводить на сроке около 12 недель беременности (11 — 14 недель). После 14 недель беременности диагностическая значимость РАРР-А в качестве маркёра риска синдрома Дауна теряется.

Установлено, что комбинация данного теста с определением свободной бета-субъединицы ХГЧ (или общего бета-ХГЧ), данными УЗИ (толщина воротникового пространства), оценкой возрастных факторов риска существенно увеличивает эффективность пренатального скрининга синдрома Дауна в первом триместре беременности, доводя его до 85 — 90% уровня выявления синдрома Дауна при 5% ложноположительных результатов. Исследование РАРР-А в качестве биохимического маркёра врождённой и наследственной патологии у плода в комплексе с определением ХГЧ на сроке 11 — 13 недель беременности в настоящее время Приказом департамента здравоохранения г. Москвы № 144 от 04.04.2005 года включено в схему скрининговых обследований беременных женщин в первом триместре.

Выявление отклонений уровней биохимических маркёров в крови матери не является безусловным подтверждением патологии плода, но, в комплексе с оценкой других факторов риска является основанием для применения более сложных специальных методов диагностики аномалий развития плода.

Пределы определения: 0,03 мЕд/мл-100 мЕд/мл

PAPP-A (Ассоциированный с беременностью протеин-А плазмы, Pregnancy-associated

Исследуемый материал Сыворотка крови

Метод определения Иммуноанализ.

Ассоциированный с беременностью протеин-А плазмы. В пренатальном скрининге I триместра беременности маркёр риска синдрома Дауна и других хромосомных аномалий плода.

Пределы определения: 0,03 мЕд/мл-100 мЕд/мл

РАРР-А

РАРР-А (Pregnancy-associated Plasma Protein-A, ассоциированный с беременностью протеин А)

Ассоциированный с беременностью плазменный белок, А (PAPP-A), синтезируется фибробластами и плацентой. РАРР-А выявляется в тканях репродуктивных органов, в толстом кишечнике и почках.

В низких концентрациях он присутствует в крови мужчин и небеременных женщин. При нормально протекающей беременности уровень РАРР-А значительно возрастает (за счет синтеза плацентой), начиная с 7 недели беременности до родов, затем его уровень постепенно снижается.

PAPP-A обладает способностью расщеплять один из белков, связывающих инсулиноподобный фактор роста, это вызывает повышение его биодоступности, что необходимо для развития плода во время беременности. Кроме этого PAPP-A ингибирует (тормозит) пролиферативную активность лимфоцитов, поэтому он входит в группу белков-иммуносупрессоров, к которым относятся ХГЧ, АФП и др. Эти белки обеспечивают подавление иммунологической реактивности материнского организма по отношению к развивающемуся плоду.

Данный показатель в настоящее время считается лучшим биохимическим маркером первого триместра беременности для диагностики синдрома Дауна.

Уровень РАРР-А значительно снижен в крови беременной женщины при наличии у плода синдрома Дауна (трисомия 21 пары хромосом) или синдрома Эдвардса (трисомия 18 пары хромосом), а также при других врожденных пороках развития.

Для правильной интерпретации результатов скрининга необходима точная информация о сроке беременности, так как уровень РАРР-А очень быстро возрастает во время первого триместра.

Кроме того, этот тест информативен также при оценке угрозы выкидыша и остановки беременности на малых сроках.

Определять данный маркер рекомендуют параллельно с определением в крови свободной β-субъединицы ХГЧ (при патологии он повышен). Установлено, что комбинация данного теста с определением свободной β-субъединицы ХГЧ, данными УЗИ (ТВП — толщина воротникового пространства), оценкой возрастных факторов риска существенно увеличивает эффективность пренатального скрининга синдрома Дауна в I триместре беременности (до 85−90%).

Выявление отклонений уровней биохимических маркеров в крови матери не является безусловным подтверждением патологии плода, но, в комплексе с оценкой других факторов риска, является основанием для применения более сложных специальных методов диагностики.

Для интерпретации результатов определения РАРР-А его значение определяется в МоМ (multiples of median — кратное к медиане). Значения РАРР-А, выраженные в МоМ, можно сравнивать на разных сроках беременности или между разными лабораториями.

Для расчета риска врожденной патологии плода (синдром Дауна, синдром Эдварда, разви-тие пороков центральной нервной системы), с учетом данных гинекологических исследований (УЗ-исследование), сывороточных маркеров, а также влияние других факторов (возраст матери, срок беременности, вес тела, диабет и др.), рекомендовано использование совместно с компьютерной программой «PRISCA».

У больных сердечно-сосудистыми заболеваниями РАРР-А может выступать в роли более чувствительного маркера воспаления и повреждения атеросклеротической бляшки, чем тропонины или КФК. Выявление повышенных уровней PAPP-A в плазме крови связано с более высоким риском развития острого коронарного синдрома.

Уровни РАРР-А в норме
(данные значения могут варьировать в зависимости от используемых тест-систем и оборудования)
у беременных женщин референсные значения: МоМ = результат/норма

МоМ от 0. 5 до 2.0 — оптимальное значение

Понижение уровня РАРР-А
(при обследовании в I триместре беременности)

Повышенный риск хромосомных аномалий плода (синдром Дауна — трисомия 21, синдром Эдвардса — трисомия 18)
Угроза выкидыша и остановки беременности на малых сроках

Материал для исследования: кровь из вены

Подготовка к анализу

Условия подготовки и день, в который нужно сдать кровь определяются лечащим врачом. Если нет специальных рекомендаций, кровь для исследования беременными женщинами сдается с 10 по 13 неделю беременности совместно с другим маркером (свободной β-субъединицей ХГЧ)

Кровь рекомендуется сдавать в утренние часы, натощак. Если же Вы планируете сдать кровь днем или вечером, то необходимо воздержаться от пищи за 4−6 часов до сдачи крови и исключить из рациона жирную пищу.

При сдаче крови необходимо сообщить медсестре о приёме препаратов, влияющих на уровень гормонов в крови.

Сроки готовности: 2 рабочих дня. Данный анализ может быть выполнен в срочном режиме (результат — за 2 часа).

Методы исследования: хемилюминисцентный иммуноанализ на микрочастицах (ХИАМ)

PAPP-A (Ассоциированный с беременностью протеин-А плазмы, Pregnancy-associated)

Исследуемый материал Сыворотка крови

Метод определения иммунохемилюминисцентный

Установлено, что комбинация данного теста с определением свободной бета-субъединицы ХГЧ (или общего бета-ХГЧ), данными УЗИ (толщина воротникового пространства), оценкой возрастных факторов риска существенно увеличивает эффективность пренатального скрининга синдрома Дауна в первом триместре беременности, доводя его до 85 — 90% уровня выявления синдрома Дауна при 5% ложноположительных результатов. Исследование РАРР-А в качестве биохимического маркёра врождённой и наследственной патологии у плода в комплексе с определением ХГЧ на сроке 11 — 13 недель беременности в настоящее время Приказом департамента здравоохранения г. Москвы № 144 от 04. 04.2005 года включено в схему скрининговых обследований беременных женщин в первом триместре.

Ассоциированный с беременностью протеин А, PAPP-A в Москве недорого

Ассоциированный с беременностью протеин А, PAPP-A

Ассоциированный с беременностью протеин А — это белок, активная выработка которого приходится именно на период беременности. Показатели концентрации данного белка используются в дородовой диагностике для оценки риска хромосомных аномалий у плода.

Анализ на ассоциированный с беременностью протеин А является частью скрининга для выявления хромосомных аномалий плода, также его используют для оценки уровня угрозы преждевременного прерывания беременности или выкидыша, составления прогноза протекания беременности.

Когда назначается исследование?

Данный анализ назначается беременным в первом триместре, особенно при наличии высоких рисков развития патологий у плода. К ним относят возраст матери старше 35 лет, факты тяжелых осложнений беременности или ее невынашивания в анамнезе, наличие двух самопроизвольных абортов на ранних сроках беременности, перенесенные вирусные или бактериальные инфекции до беременности, врожденные пороки развития при предыдущих беременностях, хромосомные патологии или болезнь Дауна. Также анализ показан при наличии наследственных заболеваний в семье, перенесенных инфекциях и радиационных облучениях, приеме перед беременностью или на ранних сроках лекарственных препаратов, которые могут приводить к порокам и аномалиям плода.

Интерпретация результатов

Для проведения анализа производится забор крови из вены. Результаты анализа имеют количественные показатели. В них отображается выявленный в образце крови уровень ассоциированного с беременностью протеина А, а также его референсные значения, которые зависят от срока беременности.

Повышенный уровень ассоциированного с беременностью протеина А может выявляться в результате низкого расположения плаценты, крупных размеров плода и большой массы плаценты, многоплодной беременности.

Пониженный уровень ассоциированного с беременностью протеина А может быть вызван гипотрофией плода, фетоплацентарной недостаточностью, угрозой выкидыша, повышенным риском хромосомных аномалий.

ОБЩИЕ ПРАВИЛА ПОДГОТОВКИ К АНАЛИЗАМ КРОВИ

Кровь берется из вены. Необходимо соблюдать общие рекомендации:

кровь сдается утром натощак или не ранее, чем через 2–4 часа после приема пищи;
допускается употребление воды без газа;
накануне анализа следует отказаться от алкоголя, исключить физическое и эмоциональное перенапряжение;
отказаться от курения за 30 минут до исследования;
не стоит сдавать кровь в период приема медикаментов, если врач не назначил иное.

PAPP-A (Ассоциируемый с беременностью протеин-А плазмы)

Комплексные исследования

АЛЛЕРГОДИАГНОСТИКА

АУТОИММУННЫЕ МАРКЕРЫ АУТОИММУННЫХ НАРУШЕНИЙ

Аллергодиагностика Панели аллергенов

Аутоиммунные маркеры ЗАБОЛЕВАНИЙ ЖКТ И ПЕЧЕНИ

Аутоиммунные маркеры ЗАБОЛЕВАНИЙ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Аутоиммунные маркеры ПРИЧИН БЕСПЛОДИЯ

Аутоиммунные маркеры и РЕВМОПРОБЫ

БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

БИОХИМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Инфекции. БАКТЕРИИ.Определение антител в крови методом ИФА

Инфекции. БАКТЕРИИ.РНК/ДНК-диагностика. Выявление методом ПЦР

Инфекции. Вирусы. ГЕПАТИТЫ.Определение антител в крови

Инфекции. Вирусы. Определение антител в крови методом ИФА

Инфекции. Вирусы. РНК/ДНК-диагностика. Выявление методом ПЦР

Инфекции. Гельминты , простейшие и грибы

Исследование генетической предрасположенности в НЕОНАТОЛОГИИ и ПЕДИАТРИИ

Исследование генетической предрасположенности к ГАСТРОЭНТЕРОЛОГИЧЕСКИМ ЗАБОЛЕВАНИЯМ

Исследование генетической предрасположенности к ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИМ ЗАБОЛЕВАНИЯМ

Исследование генетической предрасположенности к ГИНЕКОЛОГИЧЕСКИМ/УРОЛОГИЧЕСКИМ ЗАБОЛЕВАНИЯМ

Исследование генетической предрасположенности к ДЕРМАТОЛОГИЧЕСКИМ ЗАБОЛЕВАНИЯМ

Исследование генетической предрасположенности к ЗАБОЛЕВАНИЯМ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ

Исследование генетической предрасположенности к ИММУНОЛОГИЧЕСКИМ ЗАБОЛЕВАНИЯМ

Исследование генетической предрасположенности к КАРДИОЛОГИЧЕСКИМ ЗАБОЛЕВАНИЯМ

Исследование генетической предрасположенности к ЛОР ЗАБОЛЕВАНИЯМ

Исследование генетической предрасположенности к НАРУШЕНИЮ ОБМЕНА ВЕЩЕСТВ

Исследование генетической предрасположенности к НЕФРОЛОГИЧЕСКИМ ЗАБОЛЕВАНИЯМ

Исследование генетической предрасположенности к ОНКОЛОГИЧЕСКИМ ЗАБОЛЕВАНИЯМ

Исследование генетической предрасположенности к ОРТОПЕДИЧЕСКИМ ЗАБОЛЕВАНИЯМ

Исследование генетической предрасположенности к ОФТАЛЬМОЛОГИЧЕСКИМ ЗАБОЛЕВАНИЯМ

Исследование генетической предрасположенности к РЕВМАТОЛОГИЧЕСКИМ ЗАБОЛЕВАНИЯМ

Исследование генетической предрасположенности к СТОМАТОЛОГИЧЕСКИМ ЗАБОЛЕВАНИЯМ

Исследование генетической предрасположенности к ЭНДОКРИННЫМ ЗАБОЛЕВАНИЯМ

Исследование клещей

МОНИТОРИНГ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ

ОНКОМАРКЕРЫ

ПРЕНАТАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА РАЗВИТИЯ ПЛОДА (PRISCA)

ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Аллергодиагностика бытовых аллергенов.

Аллергодиагностика инсектных аллергенов.

Аллергодиагностика лекарственных аллергенов.

Аллергодиагностика пищевых аллергенов.

Аллергодиагностика пыльцы цветущих деревьев.

Аллергодиагностика трав луговых.

Аллергодиагностика трав сорных.

Биохимические исследования витаминов и жирных кислот.

Биохимические исследования микроэлементов.

ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЕМОСТАЗИОГРАММА И ФАКТОРЫ СВЁРТЫВАНИЯ КРОВИ.

ГОРМОНЫ, БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА и ОНКОМАРКЕРЫ.

ИММУНИТЕТ. Исследование клеточного и гуморального компонентов.

ИССЛЕДОВАНИЯ МОЧИ.

ИССЛЕДОВАНИЯ ФЕКАЛИЙ.

Инфекции. БАКТЕРИИ.

Инфекции. ВИРУСЫ.

Инфекции. ГРИБКОВЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ. Определение антител в крови.

Инфекции. ГРИБКОВЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ. ПЦР(ДНК)-диагностика.

Инфекции. Гельминты , простейшие и грибы.

ЛАБОРАТОРНЫЕ КОМПЛЕКСЫ и НАБОРЫ.

МИКРОСКОПИЯ.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОТЦОВСТВА / РОДСТВА.

САХАРНЫЙ ДИАБЕТ диагностика: аутоиммунные и генетические маркеры.

Услуги забора биоматерилов.

АНТИФОСФОЛИПИДНЫЙ СИНДРОМ.

ГИСТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Сурфактантный протеин А (SP-A) — прогностический молекулярный биомаркер при остром респираторном дистресс-синдроме | Мороз

1. Мороз В.В., Голубев А.М.Общая реаниматология.

2. Мороз В.В, Голубев А.М.Принципы диагностики ранних проявлений острого повреждения легких.Общая реаниматология.2006; 2

3. (4): 5—7.

4. Мороз В.В, Власенко А.В, Голубев А.М, Яковлев В.Н., Алексеев В.Г, Булатов Н.Н., Смелая Т.В.Патогенез и дифференциальная диагностика острого респираторного дистресс-синдрома, обусловленного прямыми и непрямыми этиологическими факторами.Общая реаниматология.2011; 7 (3): 5—1

5. Мороз В.В, Власенко А.В, Голубев А.М, Яковлев ВН., Алексеев В.Г, Булатов Н.Н., Смелая Т.В.Дифференцированное лечение острого респираторного дистресс-синдрома, обусловленного прямыми и непрямыми этиологическими факторами. Общая реаниматология.2011; 7 (4): 5—15.

6. Голубев А.М, Мороз В.В., Сундуков Д.В.Патогенез острого респираторного дистресс-синдрома.Общая реаниматология.2012; 8 (4): 13—22.

7. Кузовлев А.Н., Мороз В.В., Голубев А.М., Половников С.Г., Смелая Т.В.Диагностика острого респираторного дистресс-синдрома при нозо-комиальной пневмонии.Общая реаниматология.2009; 5 (6): 5—12.

8. Марченков Ю.В., Власенко А.В., Мороз В.В., Яковлев В.Н.Эволюция диагностики и лечения острого респираторного дистресс-синдрома на основе новейших медицинских технологий.Общая реаниматология.2012; 8 (4): 22—30.

9. Кузьков В.В., Киров М.Ю.Инвазивный мониторинг гемодинамики в интенсивной терапии и анестезиологии. Архангельск: Правда Севера; 200

10. Flori H.R., Ware L.B., Glidden D., Matthay M.A.Early elevation of plasma soluble intercellular adhesion molecule-1 in pediatric acute lung injury identifies patients at increased risk of death and prolonged mechanical ventilation.Pediatr. Crit. Care Med.2003; 4 (3): 315-321.

11. Parsons P.E., Eisner M.D., Thompson B.T., Matthay M.A., Ancukiewicz M., Bernard G.R., Wheeler A.P.; NHLBIAcute Respiratory Distress Syndrome Clinical Trials Network.Lower tidal volume ventilation and plasma cytokine markers of inflammation in patients with acute lung injury.Crit. Care Med.2005; 33(1): 1-6.

12. Agrawal A., Zhuo H, Brady S., LevittJ., SteingrubJ., SiegelM.D., Soto G., Peterson M.W., Chesnutt M.S., Matthay MA., Liu K.D.Pathogenetic and predictive value of biomarkers in patients with ALI and lower severity of illness: results from two clinical trials. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol.2012; 303 (8): L634-L639.

13. Ware L.B., Matthay M.A., Parsons P.E., Thompson B.T., Januzzi J.L., Eisner M.D.; The National Heart, Lung and Blood Institute ARDS Clinical Trials Network.Pathogenetic and prognostic significance of altered coagulation and fibrinolysis in acute lung injury/acute respiratory distress syndrome.Crit. Care Med.2007; 35 (8): 1821-1828.

14. Suratt B.T., Eisner M.D., Calfee C.S., Allard J.B., Whittaker L.A., Engelken D.T., Petty J.M., Trimarchi T., Gauthier L., Parsons P.E.Plasma granulocyte colony-stimulating factor levels correlate with clinical outcomes in patients with acute lung injury.Crit. Care Med.2009; 37 (4): 1322—1328.

15. Proudfoot A., Hind M., Griffiths M.Biomarkers of acute lung injury: worth their salt?BMC Med.2011; 9: 132—140.

16. ГриппиМ.Патофизиология легких. М.: БИНОМ; 2001.

17. Ware L., Koyama T., Billheimer D., Wu W., Bernard G., Thompson B., Brower R., Standiford T., Martin T., Matthay M.Prognostic and patho-genetic value of combining clinical and biochemical indices in patients with acute lung injury.Chest.2010; 137 (2): 288—296.

18. Galsser J., Mallampalli R.Surfactants and its role in the pathology of pulmonary infection.Microbes Infect.2012; 14 (1): 17—25.

19. Calfee C.S., Ware L.B., Glidden D.V., Eisner M.D., Parsons P.E., Thompson B.T., Matthay MA.Use of risk reclassification with multiple biomarkers improves mortality prediction in acute lung injury. Crit. Care Med.2011; 39 (4): 711—717.

20. Doyle I.R., Bersten A.D., Nicholas T.E.Surfactant proteins-A and -B are elevated in plasma of patients with acute respiratory failure.Am. J. Resp. Crit. Care Med.1997; 156 (4 Pt 1): 1217—1229.

21. Wu T.T., Chen T.L., LoonW.S.,Tai Y.T., Cherng Y.G., Chen R.M.Lipopolysaccharide stimulates syntheses of toll-like receptor 2 and surfactant protein-A in human alveolar epithelial A549 cells through upregulating phosphorylation of MEK1 and ERK1/2 and sequential activation of NF-кВ.Cytokine.2011; 55 (1): 40—47.

22. Gnadt M, Kardziev B, Schmidt M., HoggerP.Surfactant protein A (SP-A) and angiotensin converting enzyme (ACE) as early biomarkers for pulmonary edema formation in ventilated human lung lobes.Lung.2012; 190 (4): 431—440.

23. Eisner M., Parsons P., Matthay M., Ware L., Greene K.Plasma surfactant protein levels and clinical outcomes in patients with acute lung injury.Thorax.2003; 589 (11): 983—988.

24. Greene K, Wright J., Steinberg K., RuzinskiJ., Caldwell E., Wong W., Hull W., WhitsettJ., Akino T., Kuroki Y., Nagae H., Hudson L., Martin T.Serial changes of surfactant-associated proteins in lung and serum before and after onset of ARDS.Am.J. Respir. Crit. Care Med.1999; 160 (6): 1843—1850.

25. Cross L., Matthay M.Biomarkers of acute lung injury: insights into the pathogenesis pf acute lung injury.Crit. Care Clin.2011; 27 (2): 355—377.

26. Wright J.R.Immunoregulatory functions of surfactant proteins. Nat. Rev. Immunol2005; 5 (1): 58—68.

27. Pastva A.M., WrightJ.R., Williams K.L.Immunomodulatory roles of surfactant proteins A and D: implications in lung disease.Proc. Am. Thorac. Soc.2007; 4 (3): 252—257.

28. Lin P.M., Wright J.R.Surfactant protein A binds to IgG and enhances phagocytosis of IgG-opsonized erythrocytes.Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol.2006; 291 (6): L1199—L1206.

29. Goto H., Ledford J.G., Mukherjee S., Noble P. W., Williams K.L., Wright J.R.The role of surfactant protein A in bleomycin-induced acute lung injury.Am.J. Resp. Crit. Care Med.2010; 181 (12): 1336—1344.

30. Mukherjee S., Giamberardino C., ThomasJ., Evans K., Goto H., LedfordJ.G., Hsia B., Pastva A.M., Wright J.R.Surfactant protein A integrates activation signal strength to differentially modulate T cell proliferation.J. Immunol.2012; 188 (3): 957—967.

31. Henning L.N., Azad A.K., Parsa K.V., Crowther J.E., Tridandapani S., Schlesinger L.S.Pulmonary surfactant protein A regulates TLR expression and activity in human macrophages.J. Immunol.2008; 180 (12): 7847—7858.

32. Kovach M.A., Standiford T.J.Toll like receptors in diseases of the lung.Int. Immunopharmacol.2011; 11 (10): 1399—1406.

33. ChengI.W., Ware L.B., Greene K.E., Nuckton TJ., Eisner M.D., Matthay MA.Prognostic value of surfactant protein a and D in patients with acute lung injury.Crit. Care Med.2003; 31 (1): 20—27.

Высвобождение протеина А из клеточной стенки Staphylococcus aureus

Значимость

Поверхностные белки связаны с клеточной стенкой грамположительных бактериальных патогенов с помощью механизма, требующего сигналов сортировки мотивов LPXTG и сортировки. Здесь мы показываем, что поверхностные белки также высвобождаются с бактериальной поверхности во внеклеточную среду и могут выполнять функции, аналогичные секретируемым полипептидам. Мы демонстрируем, что белок А Staphylococcus aureus , суперантиген В-клеток, высвобождается с пептидогликаном, связанным с его С-концом.Высвобождение протеина А включает муреин-гидролазы, которые удаляют иммуностимулирующие остатки N -ацетилмурамовой кислоты и GlcNAc и высвобождают полипептид из оболочки. Этот механизм высвобождения поверхностных белков может быть универсальным для поверхностных белков грамположительных бактерий.

Abstract

Стафилококковый белок A (SpA) прикреплен к оболочке клеточной стенки Staphylococcus aureus с помощью сортазы A, которая связывает треонил (T) своего С-концевого мотива LPXTG с пептидогликановыми поперечными мостиками (т.е.е., Gly ₅). SpA связывает Fcγ-домены IgG и защищает стафилококки от опсонофагоцитарной очистки. Более того, SpA перекрестно связывает рецепторы В-клеток для модификации адаптивных иммунных ответов хозяина. Механизмы, посредством которых SpA высвобождается с поверхности бактерий для доступа к иммунной системе хозяина, неизвестны. Здесь мы демонстрируем, что SpA высвобождается с тетрапептидом-тетраглицилом муреина [1-Ala-d-iGln- (SpA-Gly ₅) l-Lys-d-Ala-Gly ₄], связанным с его C-концевым треонилом.LytN, поперечная муреин-гидролаза, способствует высвобождению SpA путем удаления аминосахаров [т.е. N -ацетилмурамовая кислота- N -ацетилглюкозамин (MurNAc-GlcNAc)] из присоединенного пептидогликана, тогда как LytM, пентаглицил- эндопептидаза, запускает высвобождение полипептида из бактериальной оболочки. Предложена модель, согласно которой муреин-гидролазы расщепляют якорную структуру высвободившегося SpA для модификации иммунных ответов хозяина.

Грамположительная бактерия Staphylococcus aureus является патогеном человека (1). Ячейки S . aureus окружены толстым слоем сильно сшитого пептидогликана клеточной стенки (2). Слой пептидогликана образован из предшественников липида II, C ₅₅ — (PO ₃) ₂— N -ацетилмурамовая кислота (MurNAc) — (l-Ala-d-iGln- (Gly ₅) l-Lys-d-Ala-d-Ala) -GlcNAc (3) через реакции транспептидации и трансгликозилирования синтеза клеточной стенки с образованием [MurNAc- (l-Ala-d-iGln- (Gly ₅) l- Lys-d-Ala) -GlcNAc] _{n полимер} (4).Собранный пептидогликан представляет собой единую большую макромолекулу, которая защищает бактерии от осмотического лизиса (5), а также выполняет функцию каркаса для закрепления тейхоевых кислот (6) и белков (7) на стенке. Эти вторичные полимеры клеточной стенки способствуют специфическим взаимодействиям между стафилококками и тканями хозяина (8). Поверхностные белки, заякоренные в клеточной стенке, синтезируются как предшественники с N-концевыми сигнальными пептидами и сигналами сортировки мотивов LPXTG на C-концевых участках (9). После расщепления N-концевого сигнального пептида сигнальной пептидазой, C-концевой сигнал сортировки расщепляется сортазой A между треонилом (T) и глицилом (G) мотива LPXTG (10).Сортаза A образует ацильный фермент, захватывая C-концевую карбоксильную группу расщепленных поверхностных белков с помощью цистеинтиола в активном центре (11). Эти ацильные интермедиаты ослабляются нуклеофильной атакой аминогруппы пентаглицила в липиде II и включаются в клеточную стенку посредством реакций транспептидации и трансгликозилирования (7, 12).

Геномы S . Изоляты aureus несут от 17 до 22 генов, кодирующих поверхностные белки мотива LPXTG, которые в дальнейшем можно классифицировать как предшественники с каноническими сигнальными пептидами или сигнальными пептидами YSIRK-G / S (13).Поверхностные белки с каноническими сигнальными пептидами секретируются и иммобилизуются на пептидогликане вблизи полюсов клеток делящихся стафилококков (14). Напротив, предшественники сигнальных пептидов YSIRK-G / S секретируются в поперечную стенку, заключенный в мембрану компартмент для синтеза пептидогликана de novo, который разделяет дочерние клетки во время деления (14). Когда предшественники с сигнальными пептидами YSIRK-G / S и сигналами сортировки мотивов LPXTG откладываются на поперечной стенке и его пептидогликан расщепляется, поверхностные белки отображаются на стафилококковой поверхности (14).Предшественники YSIRK-G / S включают белки с важными функциями вирулентности, которые синтезируются в большом количестве, включая фактор слипания A (15), связывающие фибронектин белки (16, 17), регулируемый железом поверхностный белок B (18) и стафилококковый белок A. (SpA) (19).

SpA связывает человеческий или животный Ig через свои Ig-связывающие домены, которые захватывают Fcγ-домен IgG или Fab-домен V _H 3-кланового IgG и антител IgM (20, 21). Связывание SpA с доменом Fcγ блокирует способность антител со специфической связывающей активностью для поверхности стафилококков способствовать опсонофагоцитозу, опосредованному рецепторами Fc, и уничтожению бактерий (22).Связывание SpA с Fab-доменом V _H 3-clan IgM запускает перекрестное связывание рецепторов B-клеток и клональную экспансию B-лимфоцитов, которые в конечном итоге подвергаются апоптотическому коллапсу (23). Во время инфекции эта В-клеточная суперантигенная активность SpA устраняет адаптивные иммунные ответы хозяина против многих стафилококковых антигенов (24). Хотя S . aureus болезнь преимущественно проявляется как локализованная инфекция кожи или мягких тканей, его подавляющее действие на иммунную систему, по-видимому, носит общий характер (25).Если да, то мы задались вопросом, высвобождается ли SpA, ключевой фактор уклонения от стафилококкового иммунитета, с поверхности бактерий.

Результаты

Высвобождение протеина А из

S . золотистый .

Чтобы изучить судьбу протеина А с помощью иммуноблоттинга, S . aureus Newman, а также его изогенные мутанты spa , sbi и spa / sbi выращивали в виде культур триптического соевого бульона (TSB) и центрифугировали, внеклеточную среду отделяли от бактериального осадка. . S . aureus sbi кодирует стафилококковый связывающий Ig, секретируемый полипептид, который связывает Fcγ-домен IgG, аналогично белку A (кодируется spa ) (26). Белки обеих фракций, внеклеточной среды и бактериального осадка, осаждали трихлоруксусной кислотой (TCA). Белки, привязанные к оболочке, высвобождались лизостафином (27), а образцы анализировались иммуноблоттингом с помощью SpA _KKAA -mAb 3F6 (28). S . aureus культур Ньюмана насчитывало 84.90% (± 1,28) SpA в бактериальной оболочке, тогда как 15,10% (± 1,28) высвобождались во внеклеточную среду (рис. 1 A ). В качестве контролей мутанты spa и spa / sbi не экспрессировали spa . Вариант sbi не влиял на экспрессию spa , заякоривание SpA на клеточной стенке или высвобождение SpA во внеклеточную среду (рис. 1 A ). SrtA, мембранно-заякоренная транспептидаза (29), не высвобождалась во внеклеточную среду (рис.1 А ).

Рис. 1.

S . aureus высвобождает белок А из оболочки клеточной стенки. ( A ) S . aureus Newman WT или sbi , spa или spa / sbi культур центрифугировали и внеклеточную среду отделяли с супернатантом (обозначенным буквой «S») от бактериального осадка (обозначенным буквой «P»). ). После обработки оболочки стафилококковой клеточной стенки лизостафином белки в обеих фракциях анализировали иммуноблоттингом с поликлональными антителами против протеина A (αSpA) или сортазы A (αSrtA).( B ) S . aureus Клетки Ньюмана промывали в растворе PBS, метили импульсной меткой [³⁵ S] Met / Cys и смешивали со свежей культуральной средой. Через определенные интервалы времени после мечения (0, 30, 60, 120 мин) две аликвоты из культуры осаждали TCA. Один образец обрабатывали лизостафином для высвобождения белков, закрепленных за сортазой (клеточной стенкой) ( Left ), тогда как другой образец обрабатывали горячим SDS для солюбилизации высвобожденных молекул белка A ( Right ).Радиоактивные образцы подвергали иммунопреципитации с помощью αSpA и анализировали с помощью SDS / PAGE и PhosphorImager. Иммуноблоттинг с αSrtA использовали в качестве контроля фракционирования.

После рибосомного синтеза предшественники SpA секретируются через мембрану в течение 2 минут и обрабатываются сортазой A (9). Молекулы SpA изначально прикреплены к клеточной стенке, а затем высвобождаются в среду, или стафилококки постоянно высвобождают некоторую часть протеина А? Для решения этой проблемы S . aureus Newman метили в импульсном режиме с помощью [³⁵ S] метионина / цистеина.Через определенные промежутки времени аликвоты культур осаждали TCA, суспендировали в буфере и разделяли на два образца. Один образец обрабатывали горячим SDS для растворения белков, высвобожденных в среду; другой образец обрабатывали лизостафином для солюбилизации заякоренного белка А (30). Сразу после погони (0 мин) и 30 мин после этого весь меченый импульсами белок А требовал обработки лизостафином для достижения растворимости (фиг. 1 B ). Начиная с 60 мин было обнаружено, что 1,46% протеина А растворимо без обработки лизостафином, а 15%.2% SpA с импульсной меткой высвобождалось через 120 мин (рис. 1 B ). Сортаза A служила в качестве контроля загрузки и не растворялась без обработки лизостафином (фиг. 1 B ). Взятые вместе, эти данные показывают, что предшественники SpA сначала прикрепляются к оболочке клеточной стенки, а затем высвобождаются во внеклеточную среду.

Структура высвобожденного белка A.

SpA очищали из культуральной среды S . aureus Newman без sbi по данным аффинной хроматографии на IgG-сефарозе человека (31).При деградации по Эдману высвобождались аминокислотные остатки протеина А, соответствующие N-концевой последовательности зрелого SpA (32). Первый цикл Эдмана высвободил в четыре раза больше молярных количеств аминокислоты, то есть аланина, N-концевого остатка SpA и компонента пептидогликана, чем следующий цикл (глутамин). Эти данные предполагают, что фенилтиогидантоин отщепляет аланин от N-конца SpA и от пептидов стенки, связанных с его C-концом [NH ₂ -Ala-iGln- (Gly ₅) -Lys-Ala-COOH; Таблица S1].

Очищенные молекулы протеина А обрабатывали цианогенбромидом, который расщепляет полипептидные цепи по остаткам метионила. Пептидные фрагменты очищали с помощью RP-HPLC и анализировали деградацией по Эдману. Пик поглощения через 19 мин дает последовательность NH ₂ -IKPGQ, соответствующую С-концевому фрагменту протеина A (NH ₂ -IKPGQELVVDKKQPANHADANKAQALPET; фиг. 2 A ). MALDI-TOF MS идентифицировала ионный сигнал m / z как 4023,35, 4,706.46 и 5390,89 (рис.2 B ). Эти данные не могут быть объяснены на основе предсказанной последовательности белка, но должны быть учтены массой белка А плюс компонент клеточной стенки, с которым он связан. Поэтому мы построили модели для белка А, связанного с фрагментами пептидогликана, и интерпретировали m / z 4,023,35 как высвобожденный SpA (R = NH ₂ -IKPGQELVVDKKQPANHADANKAQALPET), связанный с пентаглициловым поперечным мостиком (Gly ₅) пептидогликана. тетрапептид-тетраглицин [NH ₂ -Ala-iGln- (R-Gly ₅) -Lys-Ala-Gly ₄; Инжир.2 C ]. Соединения m / z 4706,46 и 5,390,89 интерпретировались как SpA, связанный с поперечно сшитым пептидогликаном с такой же структурой [NH ₂ -Ala-iGln- (R-Gly ₅) -Lys-Ala-Gy ₄] _2–3; Рис. 2 C . Сигналы второстепенных ионов интерпретировали как SpA, привязанный к пептидам с более высокой поперечной сшивкой [NH ₂ -Ala-iGln- (R-Gly ₅) -Lys-Ala-Gy ₄] _n или к пептидогликану с пентапептиды клеточной стенки NH ₂ -Ala-iGln- (R-Gly ₅) -Lys-Ala-Ala соответственно (рис.2 C и D ).

Рис. 2.

Структура высвобожденного белка A. ( A ) Белок A очищали аффинной хроматографией из культуральной среды и расщепляли цианогенбромидом, а С-концевые пептиды выделяли с помощью RP-HPLC и идентифицировали деградацией по Эдману. (Таблица S2). ( B ) С-концевые пептиды SpA подвергали MALDI-TOF MS и регистрировали ионные сигналы. (C) Модель преобладающих сигналов ионов, генерируемых C-концевыми пептидами SpA.( D ) Наблюдаемые и прогнозируемые (MW) m / z и дифференциалы (Δ) для пептидов SpA, высвобождаемых WT S . aureus с их предсказанными структурами.

Белок А, выделенный из

S . aureus atl , sle1 и lytN Мутанты.

Структура высвобожденного SpA может быть сформирована муралитическими ферментами, которые расщепляют поперечный компартмент во время роста стафилококков, то есть Atl [ N -ацетилмурамоил-1-аланинамидаза (амидаза) и глюкозаминидаза] (33, 34), Sle1 (амидаза домена CHAP и эндопептидаза d-Ala-Gly) (35) и LytN (амидаза домена CHAP и эндопептидаза d-Ala-Gly) (36, 37) (рис.3 А ). Если да, то S . aureus Мутанты Ньюмана, лишенные структурных генов для этих муралитических ферментов, могут выделять белок А с измененной структурой пептидогликана. Это было проверено путем очистки SpA от среды культур, инокулированных S . aureus Newman atl вариант, в котором также отсутствует sbi (38). После расщепления цианогенбромидом и очистки RP-HPLC пептиды белка A из мутанта atl подвергали MALDI-TOF MS, которая идентифицировала ионные сигналы с m / z 3 339.86 и 3796,12 (рис.3 B ). Структурные модели для высвобожденного пептида, связанного с тетраглицилом (R-Gly ₄) и тетрапептидом пептидогликана [NH ₂ -Ala-iGln- (R-Gly ₅) -Lys-Ala], соответствуют наблюдаемым масс-сигналам (рис. 3 B и C ).

Рис. 3.

S . aureus гидролазы муреина влияют на высвобождение протеина A. ( A ) Структура S . aureus пептидогликан, состоящий из повторяющегося дисахарида N -ацетилглюкозамин- (β1-4) — N -ацетилмурамовая кислота (GN-MN) с пептидом со связанной стенкой (Ala-iGln-Lys-Ala) и поперечным мостиком (Gly ₅).Стрелки указывают сайты расщепления муреин-гидролаз, которые действуют на поперечной стенке (Atl, Sle1 и LytN) или которые функционируют как глицилэндопептидазы (LytM). ( B ) MALDI-TOF MS C-концевых пептидов SpA, высвобожденных из S . aureus atl мутант. ( C ) Наблюдаемые и прогнозируемые (MW) m / z соотношения и их различия (Δ) для пептидов SpA, высвобождаемых S . aureus atl мутант с их предсказанными структурами.

Sle1 секретируется в среду и впоследствии связывается с участком поперечной стенки пептидогликана через свои LysM-домены, соединяясь с гликановыми цепями (MurNAc-GlcNAc) _n, которые не были декорированы тейхоевыми кислотами на стенках (полирибитол-фосфат) при C6-гидроксил MurNAc (37). Предшественник LytN секретируется через свой сигнальный пептид мотива YSIRK-G / S в поперечную стенку, а его домен CHAP расщепляет пептидогликан за счет его амидазной и эндопептидазной активности (36). Мутанты Staphylococcal sle1 (35) и lytN обнаруживают дефекты разделения клеток с неадекватным расщеплением поперечно-клеточного пептидогликана (35, 36).Белок А очищали из внеклеточной среды S . aureus Newman sle1 и lytN мутантов (также не имеющих sbi ) и расщепленных цианогенбромидом, и C-концевые пептиды анализировали с помощью MS. SpA, высвобожденный из мутантов sle1 , генерировал ионные сигналы m / z 3,865,17 и 4,023,24, которые интерпретировались как NH ₂ -Ala-iGln- (R-Gly ₅) -Lys-Ala-Ala. и NH ₂ -Ala-iGln- (R-Gly ₅) -Lys-Ala-Gly ₄ (рис.4 A и C ). Мы также обнаружили пептидогликан с аналогичной структурой и двумя-четырьмя поперечными связями [NH ₂ -Ala-iGln- (R-Gly ₅) -Lys-Ala) _2–4] -Ala (рис. 4 A и C ). Пептиды SpA, высвобождаемые мутантом lytN , генерировали ионные сигналы m / z 4371,57 и 5 591,98, которые интерпретировались как MurNAc [Ala-iGln- (R-Gly ₅) -Lys-Ala-Gly ₂] -GlcNAc, а также [MurNAc (Ala-iGln- [R-Gly ₅] Lys-Ala) -GlcNAc] ₂ -Gly ₃ (фиг.5 B и C ). Эти данные предполагают, что LytN отвечает за расщепление амидных связей между MurNAc и пептидами стенки, что позволяет высвобождать белок А с поперечно сшитым пептидогликаном, в котором отсутствуют аминосахара клеточной стенки.

Рис. 4.

Поперечные муреин-гидролазы формируют структуру высвобождаемого белка A. MALDI-TOF масс-спектрометрия C-концевых пептидов SpA, высвобождаемых из S . aureus sle1 ( A ) и lytN ( B ) мутантов.( C ) Наблюдаемые ( m / z ) и прогнозируемые (MW) отношения массы к заряду и их различия (Δ) для пептидов SpA, высвобождаемых S . Мутанты aureus sle1 и lytN с их предсказанными структурами.

Рис. 5.

LytM эндопептидаза необходима для высвобождения протеина А из стафилококковой оболочки. ( A ) S . Центрифугировали мутантные культуры aureus WT и atl , sle1 , lytN , lytM или atl / sle1 / lytN .Белки в культуральной среде отделяли с надосадочной жидкостью (обозначено «S») от бактериального осадка (обозначено «P»). После обработки оболочки стафилококковой клеточной стенки лизостафином белки в обеих фракциях анализировали иммуноблоттингом с поликлональными антителами против протеина A (αSpA) или сортазы A (αSrtA). ( B ) Иммунореактивные сигналы от трех различных образцов, проанализированных, как показано в A , усредняли, определяли SEM и анализировали статистическую значимость с помощью двустороннего критерия Стьюдента t .Только мутантный штамм lytM выделял меньше белка А, чем WT S . aureus ( P = 0,002).

LytM высвобождает белок А из

S . aureus Конверт.

LytM представляет собой секретируемую глицилглицинэндопептидазу S . aureus (39), и мы задались вопросом, может ли этот фермент участвовать в высвобождении белка A. В отличие от Atl, Sle1 и LytN, которые нацелены на поперечную стенку, субклеточное расположение LytM еще не известно.Пептиды SpA, высвобождаемые мутантом lytM , не были многочисленны. Тем не менее, эти пептиды генерировали m / z 3795,87, 3866,87 и 4022,94, т.е. те же структуры, что и WT S . aureus : Ala-iGln- (R-Gly ₅) -Lys-Ala, Ala-iGln- (R-Gly ₅) -Lys-Ala-Ala и Ala-iGln- (R-Gly ₅) -Lys-Ala-Gly ₄ (Рис. S1).

Для количественной оценки выпуска SpA, S . штаммов aureus выращивали до аналогичных плотностей, и высвобождение протеина А анализировали иммуноблоттингом.Культуры центрифугировали и стафилококки обрабатывали лизостафином для определения общего количества SpA, связанного с оболочкой. Супернатант также осаждали TCA. Оба образца были проанализированы иммуноблоттингом в трех экземплярах, и были определены средние значения и SEM. По сравнению с S . aureus Newman (15,10% ± 1,28 высвобожденной SpA), atl (19,78% ± 1,72; P <0,1), LytN (16,69% ± 1,44; P <0.5), sle1 (16,88% ± 0,29; P <0,3) или atl / sle1 / lytN (17,80% ± 0,49; P <0,5) варианты высвобождали аналогичное количество белка A как стафилококки WT (рис. 5 A и B ). Напротив, мутантный штамм lytM высвобождает значительно меньше SpA в культуральную среду, чем WT S . aureus (3,96% ± 0,82; P <0,01; рис.5 A и B ).Эти данные показывают, что муреин-гидролазы с поперечной стенкой формируют якорную структуру клеточной стенки SpA, чтобы гарантировать отсутствие аминосахаров пептидогликана в высвобождаемых молекулах. Тем не менее, поперечные гидролазы муреина не ответственны за высвобождение протеина А из бактериальной оболочки. Эта функция может быть частично возложена на LytM, который разрезает пентаглицильный мостик в структуре якоря клеточной стенки белка А.

Высвобождение протеина А во время роста стафилококков.

Мы интересовались, происходит ли высвобождение SpA равномерно во время роста стафилококков, и следовали стационарной фазе S . aureus клеток, которые были промыты и разбавлены свежей средой через 30-минутные интервалы времени посредством логарифмического роста. Вскоре после его разбавления, то есть во время раннего логарифмического роста, S . aureus высвобождает большее количество SpA на КОЕ, чем на более поздних фазах роста (рис. 6). Эти результаты предполагают, что высвобождение SpA может контролироваться фазами роста стафилококков, предположительно с целью модификации иммунных ответов хозяина на ранней стадии инфекции, когда численность этого бактериального захватчика невелика.

Рис. 6. Высвобождение

SpA во время роста стафилококков. S . aureus Клетки Ньюмана ( sbi ) промывали и разводили в свежей среде TSB до A ₆₀₀ 0,05 и инкубировали при вращении при 37 ° C. С 30-минутными интервалами измеряли оптическую плотность (600 нм) и подсчитывали cfus. Высвобождение SpA количественно определяли иммуноблоттингом образцов культурального супернатанта и записывали как интенсивность сигнала, деленную на КОЕ (× 10 ^-3). Эксперименты проводили в трех экземплярах для расчета средних значений и SEM (планки погрешностей).

Обсуждение

Бактериальный пептидогликан является мощным активатором иммунной системы млекопитающих (40). Муропептиды, высвобождаемые во время роста бактерий, распознаются доменом связывания нуклеотидов и олигомеризации, содержащим белки 1 (NOD1) и 2 (NOD2), два члена семейства NLR в цитоплазме клеток млекопитающих, которые специализируются на распознавании фрагментов пептидогликана из грамотрицательных (т. Е. , NOD1) или грамположительных бактерий (например, NOD2) (41, 42). Активируемые муропептидами с помощью MurNAc, NOD1 и NOD2 инициируют внутриклеточные сигнальные пути, которые индуцируют NF-κB и экспрессию генов иммунного ответа, кодирующих провоспалительные цитокины и антимикробные пептиды (40, 43).Например, продукция IL-1β, полученная из нейтрофилов, является ключевой защитой от S . aureus (44), требует активации NOD2, индуцированной стафилококковыми пептидогликанами (45). Важность этого пути иллюстрируется дефектами передачи сигналов NOD2, которые повышают восприимчивость к заболеванию мутантных мышей до S . aureus инфекция (46).

Сигнальный путь NOD2 представляет собой проблему для патогенеза S . aureus инфекций, в частности подавление В-клеточных ответов (24, 25).Как может высвобождаемый патогеном белок А активировать клональную экспансию В-клеток и их последующий апоптотический коллапс, не вызывая одновременно системную активацию иммунной системы? Мы показываем здесь, что белок A высвобождается из оболочки со связанными фрагментами пептидогликана, то есть l-Ala-d-iGln- (Gly ₅) l-Lys-d-Ala-Gly ₄ и l-Ala-d -iGln- (Gly ₅) l-Lys-d-Ala-d-Ala. Следует отметить, что в этих пептидогликановых фрагментах отсутствуют аминосахары (MurNAc-GlcNAc) пептидогликана, которые действуют как мощные индукторы NOD2 (42).Эксперименты по импульсному мечению показывают, что белок А изначально привязан к бактериальной оболочке, которая находится на поперечной стенке между делящимися дочерними клетками (14). Мутанты без поперечных муреин-гидролаз — Atl, Sle1 или LytN — высвобождали SpA с измененными пептидогликановыми структурами, но не влияли на общее высвобождение протеина A. Таким образом, поперекостенные муреин-гидролазы формируют якорную структуру клеточной стенки протеина A без влияющие на его выпуск. Целью этих действий, по-видимому, является синтез якорных структур SpA, которые не могут стимулировать иммунные ответы хозяина.Когда эти задачи выполнены, белок А остается привязанным к саккулюмам муреина через свою точку якорения, пептидогликан-пентаглициновый поперечный мостик, который также соединяет пептиды соседних стенок (7). LytM в конечном итоге расщепляет эти поперечные мостики и высвобождает белок А во внеклеточную среду.

LytM представляет собой секретируемую глицилглициновую эндопептидазу, которая разрезает поперечные мостики стафилококкового пептидогликана, не способствуя автолизу (39). Недавняя работа показала, что lytM является регулируемым WalKR геном (47).В мутантах WalKR, в которых экспрессия важного двухкомпонентного регулятора ограничена, LytM может подавлять ассоциированные дефекты роста, по-видимому, путем ослабления поперечного сшивания пептидогликана (48). Здесь мы предлагаем важную функцию LytM: высвобождение биологически активных заякоренных сортазой белков из бактериальной оболочки. Поскольку мутанты lytM продолжают высвобождать небольшие количества протеина А из оболочки, мы предполагаем существование дополнительных ферментов с активностью гицил-глицинэндопептидазы, которые могут влиять на высвобождение поверхностных белков.

Материалы и методы

Бактериальные штаммы и условия роста.

S . aureus штаммов выращивали в TSB при 37 ° C при перемешивании. S . aureus Newman WT (49) и варианты с делециями в специфических гидролазах муреина atl , sle1 или lytN были получены путем аллельной замены с использованием челночного вектора pKOR1 (50). Вкратце, фланкирующие области размером 1 т.п.н. выше и ниже atl , sle1 или lytN были амплифицированы, лигированы и вставлены в pKOR1 посредством рекомбинации лямбда-красного (50).Рекомбинантные плазмиды электропорировали в S . aureus Newman для интеграции в хромосому и отбора делеционных мутантов. Мутант spa был описан ранее (51). Чтобы избежать контаминации протеина А стафилококковым связывающим веществом Ig во время экспериментов по аффинной хроматографии (52), аллель sbi :: erm , описанный ранее (53), был трансдуцирован фагом φ85 в S . aureus Newman, а также его варианты atl , sle1 и lytN .Трансдуктанты sbi :: erm , atl / sbi :: erm , sle1 / sbi :: erm и lytN / sbi :: erm были подтверждены PCR и Секвенирование ДНК. Мутация транспозона bursa aurealis ΦΝΞ02987 ( lytM :: erm) была трансдуцирована с помощью φ85 в WT S . aureus Newman для создания мутанта lytM . Обратите внимание, что этот мутант кодирует ген WT sbi .

Очистка SpA.

S . aureus Newman и его варианты выращивали в течение ночи в TSB и использовали для инокуляции 8 л свежего TSB посевным материалом в разведении 1: 100. Культуры выращивали в течение 4 часов при 37 ° C до поглощения при 600 нм (A600) 0,2, а затем центрифугировали при 9000 × g в течение 20 минут. Супернатант декантировали и охлаждали на льду до 4 ° C, и добавляли 200 мл 1,5 М трис · HCl (pH 8,8) для доведения pH до 7,5. Молекулы SpA в культуральном супернатанте очищали аффинной хроматографией.Вкратце, колонку с гравитационной загрузкой с объемом слоя 4 мл IgG Sepharose6 Fast Flow уравновешивали 14 мл элюирующего буфера (0,1 М глицин-HCl, pH 3,0), а затем 30 мл трис-физиологического раствора-твин 20 [TST; 50 мМ трис-HCl (pH 7,6), 150 мМ NaCl, 0,05% твин 20]. В общей сложности 8 л культурального супернатанта загружали в колонку при 4 ° C в течение 12 часов. Колонку промывали 100 мл TST и элюировали 14 мл элюирующего буфера. Элюат немедленно нейтрализовали 0,35 мл 1,5 М трис-HCl (pH 8,8). Молекулы SpA в 14 мл элюата концентрировали до объема 2 мл с помощью центробежного фильтра с отсечкой по молекулярной массе 10000 (Millipore), диализовали против раствора PBS при 4 ° C и хранили при -20 ° C до дальнейшего использования.Очистку SpA анализировали с помощью SDS / PAGE, окрашенного кумасси, и концентрацию белка определяли с помощью набора для анализа белка BCA (Pierce).

МС.

Для структурного анализа 150 мкг очищенного SpA сушили, растворяли в 50 мл 5% (об. / Об.) 2-меркаптоэтанола, 0,2 М NH ₄ HCO ₃ и инкубировали в течение ночи при комнатной температуре. Образец белка снова сушили и растворяли в 1 мл 70% муравьиной кислоты. К раствору добавляли приблизительно 1 мг цианогенбромида.Реакцию инкубировали 18 ч в темноте при комнатной температуре и гасили разбавлением смеси 1: 5 водой. Затем образец сушили, растворяли в 30% ацетонитриле и обессоливали обращенно-фазовой ВЭЖХ через градиент ацетонитрил / вода на твердофазной колонке C8 Hypersil. Пики элюата сушили и растворяли в 5-20 мкл 30% ацетонитрила. Пробы белка наносили на измельченную платиновую пластину-мишень (Bruker) и смешивали в соотношении 1: 1 на пластине с матрицей α-циано-4-гидроксикоричной кислоты (Sigma).Фракции анализировали на масс-спектрометре MALDI-TOF (Autoflex Speed; Bruker) с использованием метода обнаружения с положительным или линейно-положительным рефлектроном. Детектор калибровали перед каждым экспериментом со стандартами белка.

Измерение высвобождения SpA.

S . aureus штаммов инокулировали из замороженных исходных материалов в культуры TSB и выращивали в течение ночи. Культуру разбавляли до A ₆₀₀ 5,0 и 1 мл центрифугировали при 20 000 × g в течение 1 мин.Супернатант сливали, а стафилококки дважды промывали раствором PBS. Бактериальную суспензию инокулировали в 100 мл TSB с получением A ₆₀₀ 0,05 и инкубировали при 37 ° C. Перед инкубацией и через определенные промежутки времени после этого образцы 1,5 мл были удалены из культур и центрифугированы при 20 000 × g в течение 1 мин. Один миллилитр супернатанта удаляли, помещали в свежую пробирку и хранили на льду. Осадок клеток промывали 1 мл раствора PBS и суспендировали в 1.5 мл TSM-L [50 мМ Tris⋅HCl (pH 7,5), 0,5 M сахарозы, 10 мМ MgCl ₂, 5 мкг · мл ^-1 лизостафина (AMBI)] и помещали при 37 ° C на 15 мин, чтобы переваривать оболочку клеточной стенки лизостафином. Затем аликвоту суспензии протопластов стафилококка объемом 1 мл помещали на лед.

Белки в образцах супернатанта и протопластов осаждали добавлением 100% TCA / 0,1% дезоксихолевой кислоты до конечной концентрации 20%. Образцы встряхивали и инкубировали на льду в течение 20 мин. Осажденные белки осаждали центрифугированием при 22000 × g в течение 15 мин.Супернатант отбрасывали, и осадок белка дважды промывали ледяным ацетоном, сушили на воздухе и растворяли в 25 мкл 0,5 М трис · HCl (pH 8,0), 4% SDS при 4 ° C в течение ночи. Добавляли равный объем буфера для образца [125 мМ трис-HCl (pH 6,8), 4% SDS, 20% глицерин, 10% 2-меркаптоэтанол, 0,01% бромфенолового синего] и образцы белка кипятили в течение 10 мин. Белки разделяли на 10% геле SDS / PAGE и электропереносили на PVDF-мембрану. Мембрану инкубировали в блокирующем буфере (TBS, 5% молоко) в течение 1 ч при комнатной температуре.SpA _KKAA моноклональное антитело 3F6 использовали в разведении 1: 10 000 в TBS-Tween 20. Через 1 ч мембрану промывали три раза и инкубировали в растворе козьего антимышиного антитела 680 (1: 10 000) (Licor). Через 1 ч мембрану промывали трижды и измеряли флуоресценцию при 700 нм на инфракрасном сканере (Licor Odyssey). Интеграция сигналов была выполнена с помощью программного обеспечения Licor. Для обеспечения согласованности между блотами в каждый блот были включены два стандартных разведения очищенного SpA в качестве контроля флуоресценции.

Высвобождение SpA во время роста стафилококков.

Ночные культуры S . aureus Newman sbi центрифугировали, бактериальные клетки промывали и разводили в свежей среде TSB до A ₆₀₀ 0,05 и инкубировали при вращении при 37 ° C. С 30-минутными интервалами измеряли оптическую плотность при 600 нм и высевали аликвоты культур для подсчета cfus. Кроме того, отбирали аликвоты культуры объемом 1,5 мл для количественного определения высвобождения протеина А. После центрифугирования образцов культуры отбирали 1 мл супернатанта и осаждали белки с помощью TCA.Осадок солюбилизировали в буфере для образцов и подвергали иммуноблоттингу для количественного определения содержания SpA. Скорость высвобождения SpA рассчитывали путем деления интенсивности SpA-иммунореактивных сигналов на измерения КОЕ для каждого временного интервала. Эксперименты проводили в трех экземплярах для расчета средних значений и SEM.

Благодарности

Авторы благодарят сотрудников своей лаборатории за критическое обсуждение. Работа поддержана Национальным институтом аллергии и инфекционных заболеваний США, отделением инфекционных заболеваний, грантами AI052474 и AI038897 (О.С.). D.M. и О.С. выражаем признательность за членство в Консорциуме Регионального центра передового опыта в области биозащиты и возникающих инфекционных заболеваний и поддержку со стороны Регионального центра V Великих озер (Премия Национальных институтов здравоохранения 1-U54-AI-057153).

Сноски

Вклад авторов: S.B., O.S., and D.M. спланированное исследование; С. и О.С. проведенное исследование; M.B.F. и Д. внесены новые реагенты / аналитические инструменты; С.Б., М.Б.Ф., О.С. и Д.М. проанализированные данные; и С.Б., О.С. и Д.М. написал статью.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Эта статья представляет собой прямое представление PNAS.
Эта статья содержит вспомогательную информацию на сайте www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1317181111/-/DCSupplemental.

Связывание протеина A, протеина G, протеина L и якалина

Антитело-связывающие белки, такие как белок A и белок G, часто используются при очистке антител и в таких приложениях, как иммунопреципитация (IP) и иммунопреципитация хроматина (ChIP).Каждый связывающий антитело белок различается по своей способности связываться с антителами разных подтипов и видов. Поэтому важно, чтобы вы соответствовали специфичности связывания иммобилизованного связывающего антитела белка с видами и подтипом антитела, которое вы хотите захватить. Здесь мы перечисляем свойства связывания антител протеина A, протеина G, протеина A / G, протеина L и якалина.

Просмотрите наши шарики / смолы и столбцы, прикрепленные к связывающим антитела белкам, в таблице ниже.

Узнайте больше об аффинной очистке здесь.

Свойства связывания антител протеина A, протеина G, протеина A / G и протеина L в зависимости от вида и подтипа антитела.

Ключ: +++ сильное связывание; ++ средняя привязка; + слабая привязка; — без привязки; ? не определено

Виды	Подтип антитела	Белок A	Белок G	Белок A / G	Белок L ***
Человеческий	IgG1 IgG 9077 Общий IgG 9077 IgG4 IgM IgD IgA1 IgA2 Fab scFv	+++ +++ +++ + +++ + — + + + +	+++ +++ +++ +++ +++ — — — — + —	+++ +++ +++ +++ +++ + — + + + +	+++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
Мышь	Общий IgG IgM IgG1 IgG2a IgG2b IgG3	+++ — + +++ +++ +++	+++ 907 77 — ++ +++ +++ +++	+++ — ++ +++ +++ +++	+++ +++ + ++ +++ +++ +++
Крыса	Общий IgG IgG1 IgG2a IgG2b IgG2c	+ + — — +++	+ + ++ +++ + +++	++ ++ +++ + +++	+++ +++ +++ + ++ +
Кролик	Общий IgG	+++	+++	+++	+
Коза	Общий IgG	+	+++	—
Овцы	Общий IgG	+	+++	+++	—
Морская свинка	Всего IgG	+++	?
Хомяк	Общий IgG	++	++	++	+++
Осел	Общий IgG	++	+++	?
Свинья	Общий IgG	+++	+	+++	+++
Собака	Общий IgG	+++	+	?
Кот	Общий IgG	+++	+	+++	?
Цыпленок	Общий IgY	—	—	—	—
Корова	Общий IgG	+	+++	+++	+++ Лошадь	Общий IgG	+	+++	+++	?

*** Связывание с белком L ограничено антителами, которые содержат правильные подтипы легких цепей

каппа .Белок L связывается с подтипами VκI, VκIII и VκIV человека, но не с VκII, и связывается только с мышиными антителами, содержащими VκI.

Свойства связывания антител джакалина в зависимости от вида и подтипа антител
Виды Подтип антитела Jacalin
Человеческий Общий
IgG1
IgG3 IgG3
IgG3 IgM
IgD
IgA1
IgA2
Fab
scFv
Каппа легкая цепь
Лямбда легкая цепь —
—
—
—
—
—
++
+++
+
+/-
?
—
—
Мышь Общий IgG
IgA —
—
Крыса Общий IgG
IgA ?
—
Кролик IgA +
Коза IgA —
Овца IgA ?
Морская свинка IgA —
Хомяк IgA ?
Осел IgA ?
Свинья IgA —
Собака IgA —
Кот IgA ?
Курица IgY ?
Cow IgA —
Horse IgA —
_{^{Sepharose ® является зарегистрированным товарным знаком GE Healthcare.}}
границ | Стафилококковый протеин А способствует колонизации и иммунному уклонению от эпидемического MRSA, связанного с оказанием медицинской помощи ST239
Введение
Staphylococcus aureus — серьезный патоген, вызывающий серию инфекций как в больницах, так и за их пределами. Под высоким давлением отбора антибиотиков S. aureus выработал свою собственную тактику выживания и быстро превратился в патоген с множественной лекарственной устойчивостью, особенно устойчивый к метициллину S.aureus (MRSA). Общее количество инвазивных инфекций MRSA оценивается в 80 461 только в Соединенных Штатах в 2011 году (Dantes et al., 2013). Примечательно, что около 20% здоровой человеческой популяции также имеют постоянную колонизацию носовой полости S. aureus , что представляет собой серьезный риск оппортунистических инфекций (Weidenmaier et al., 2012).
Проблема MRSA является международной проблемой здравоохранения, и Азия входит в число регионов с самыми высокими показателями распространенности MRSA, связанного с оказанием медицинской помощи (HA), и MRSA, ассоциированного с населением (CA), в мире (Chen and Huang, 2014) .Распространенность MRSA в Китае достигла от 50 до 70% от общего числа изолятов S. aureus (Liu et al., 2009; Xiao et al., 2011). Лабораторные надзорные исследования показали, что ST239-SCC mec III является наиболее распространенным клоном HA-MRSA в ряде географически разбросанных китайских больниц, при этом ST5-SCC mec II является вторым по распространенности (Li et al. , 2013; Xiao et al., 2013). Напротив, основным штаммом CA-MRSA является ST59-SCC mec IV у детей (Geng et al., 2010), и также происходит международное распространение ассоциированного с домашним скотом MRSA ST398 между людьми и животными, а также между люди и люди (Huijsdens et al., 2006; ван Белкум и др., 2008; Wang et al., 2015). В материковом Китае наиболее распространенным клоном CA-SA при инфекциях кожи и мягких тканей у взрослых является ST398, не имеющий очевидной связи с контактом с животными (Zhao et al., 2012). Весьма успешная инфильтрация и адаптация MRSA ST239 в условиях больниц широко известна во всем мире; самые ранние сообщения о нем были опубликованы в конце 1970-х годов в Соединенном Королевстве и Соединенных Штатах (Cookson and Phillips, 1988; Dubin et al., 1992). С 1990-х годов ST239 также является наиболее доминирующим нозокомиальным клоном MRSA в Китае (Aires de Sousa et al., 2003; Chen et al., 2010).
Недавние исследования изучали глобальную эпидемиологию ST239 (Harris et al., 2010) и вклад других мобильных генетических элементов, таких как sasX , в распространение и выживаемость этого клона (Li et al., 2012). Учитывая, что существует много принципиальных различий между CA-MRSA и HA-MRSA, включая типичных пациентов и клинические инфекционные особенности (Nathwani et al., 2008), наиболее вероятно, что механизм, лежащий в основе инфекций, вызванных HA-MRSA, с ослабленным вирулентность отличается от CA-MRSA.Хотя MRSA ST239 является преобладающим клоном HA-MRSA во всем мире, из-за его успешной адаптации и выживания в условиях больницы факторы, способствующие адаптации и устойчивому распространению эпидемического клона ST239 в Китае, остаются неизвестными. Мы обнаружили, что экспрессия HA-MRSA ST239 в spa намного выше, чем у CA-SA ST398. Стафилококковый белок A (SpA), консервативный структурный белок, закрепленный на поверхности, экспрессируемый всеми штаммами S. aureus , как давно известно, блокирует опсонофагоцитоз за счет своей Fc ɤ-связывающей способности в присутствии антитела хозяина (Peterson et al., 1977), а также для связывания Fab-участков рецептора В-клеток (заякоренный в мембране IgM; Graille et al., 2000), перекрестного связывания IgM клана V _H 3 (Goodyear and Silverman, 2003) и индукции V _H 3-смещенные плазмобласты. Суперантигенная активность SpA ведет к иммунодоминантности, ограничивая ответы хозяина на другие факторов вирулентности S. aureus (Pauli et al., 2014). SpA индуцирует пролиферацию B-клеток без цитокиновых стимулов и надлежащей помощи T-клеток из-за анергических процессов, опосредованных другими суперантигенами, что приводит к SpA-активированной делеции B-клеток и анергии (Pozzi et al., 2015). SpA также вызывает раннее отделение рецептора 1 TNF-α (TNFR1) от фагоцитарных клеток. Повышенные уровни растворимого TNFR1, присутствующего во время экспериментальных инфекций S. aureus , могут нейтрализовать циркулирующий TNF-α и ослабить воспалительный ответ хозяина (Giai et al., 2013). Прежде всего, SpA играет важную роль в уклонении от иммунитета в патогенезе стафилококковых инфекций. Здесь мы подтвердили, что более высокая экспрессия SpA способствует длительной колонизации и уклонению от иммунитета в клоне ST239.Кроме того, SpA может служить важным фактором долгосрочной адаптации и постоянного распространения клона HA-MRSA ST239 в условиях больницы.
Материалы и методы
Заявление об этике
Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных Китайской ассоциации наук о лабораторных животных (CALAS) и одобрены этическим комитетом больницы Хуашань Медицинской школы Фуданьского университета, Шанхай, Китай.Гепаринизированная венозная кровь человека была взята у здоровых людей в соответствии с протоколом, одобренным этическим комитетом больницы Хуашань Медицинской школы Университета Фудань, Шанхай, Китай. Все люди дали письменное информированное согласие перед сдачей крови.
Бактерии и условия роста
Бактерии были идентифицированы как стафилококки классическими микробиологическими методами, включая окрашивание по Граму и активность каталазы и коагулазы в плазме кроликов. штаммов S. aureus были дополнительно классифицированы с помощью автоматизированных систем VITEK2 (BioMérieux, Франция).Связанный с сообществом S. aureus был определен как изолят, который был получен либо от амбулаторного, либо от стационарного пациента через ≤24 ч после поступления в больницу и лишенный следующих факторов риска: контакт с больничной средой в течение 6 месяцев до посева, S. aureus в анамнезе или пребывание в учреждении длительного ухода в течение 12 месяцев до посева, наличие центрального сосудистого катетера во время инфекции, недавнее употребление антибиотиков, инъекционное употребление наркотиков; связанные со здравоохранением S.aureus был определен как изолят, который был получен от стационарного пациента> 24 ч после поступления в больницу или имеющего хотя бы один из этих факторов риска. штаммов S. aureus , использованных для ОТ-ПЦР и вестерн-блоттинга экспрессии SpA, были случайным образом отобраны из клинических изолятов с типичными инфекционными проявлениями в клинических больницах Шанхая в 2005–2012 годах. Клинический изолят MRSA Ji99 (штамм HA-MRSA ST239), который использовали для разработки мутанта spa , был выделен из мокроты стационарного пациента с пневмонией.Изолят 1059 (штамм CA-SA ST398) был извлечен из кожного абсцесса амбулаторного пациента в больнице Шанхая, Китай. Эти два штамма были использованы для следующих исследований, поскольку уровень экспрессии spa был средним как по РНК, так и по уровню белка. Изоляты выращивали в триптическом соевом бульоне (TSB; Oxoid, Basingstoke, Hampshire, UK) при 37 ° C при перемешивании и использовали во всех работах с животными. Escherichia coli TOP10 выращивали в бульоне Лурия-Бертани (LB; Oxoid). При необходимости в среду добавляли ампициллин (100 мкг / мл) для E.coli или хлорамфеникол (10 мкг / мл) для S. aureus .
Тесты на устойчивость к антибиотикам
Профили чувствительности к противомикробным препаратам изолятов S. aureus были определены методом разведения на агаре Мюллера-Хинтона в соответствии с рекомендациями и определениями Института клинических и лабораторных стандартов (CLSI). Протестированные противомикробные агенты были приобретены у Oxoid и включали гентамицин, пенициллин, цефокситин, цефазолин, левофлоксацин, эритромицин, клиндамицин, триметоприм / сульфаметоксазол (TMP / SMX), фосфомицин, рифампицин, теикопланин, линезолид и ванезолид.ATCC29213 ( S. aureus ) и ATCC29212 ( Enterococcus faecalis ) использовали в качестве контроля качества.
Мультилокусное типирование последовательностей (MLST)
MLST выполняли, как описано ранее (Maiden et al., 1998). ПЦР-ампликоны семи генов домашнего хозяйства S. aureus ( arcC, aroE, glpF, gmk, pta, tpi и yqiL) были получены из хромосомной ДНК. Последовательности продуктов ПЦР сравнивали с существующими последовательностями, доступными на веб-сайте MLST (http: // www.mlst.net), и для каждой последовательности определяли номер аллеля.
Spa Набор текста
Амплификацию и секвенирование полиморфной области X гена spa проводили, как описано (Koreen et al., 2004). Тип spa был присвоен с использованием базы данных типов S. aureus spa (http://www.ridom.de/spaserver/).
Замена аллельного гена путем гомологической рекомбинации и генетической комплементации
С.aureus ST239 (Ji99) / ST398 (1059) и варианты с делецией spa были созданы путем аллельной замены с использованием челночного вектора pKOR1 (Bae and Schneewind, 2006). Вкратце, фланкирующие области размером 1 т.п.н. выше и ниже spa были амплифицированы, лигированы и вставлены в pKOR1 с использованием набора BP Clonase II (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA; Bae and Schneewind, 2006). Рекомбинантные плазмиды трансдуцировали с помощью Φ85 в S. aureus ST239 (Ji99) / ST398 (1059) для интеграции в хромосому и отбора мутантов с делецией (дополнительная таблица 1).Для комплементации spa фрагменты ДНК амплифицировали с парами праймеров spa -Sma1-F / spa -Bamh2-R (дополнительная таблица 2), используя геномную ДНК ST239 (Ji99) и ST398 (1059) в качестве шаблон соответственно. Амплифицированные фрагменты расщепляли Sma 1 и BamH 1 и вставляли в pCL55, подвергали циркуляризации с помощью лигазы Т4 и затем трансформировали в E . coli DH5α. После проверки все плазмиды подвергали электропорации в S . aureus штамм RN4220 и впоследствии трансдуцированный в мутант spa -делеции S . aureus штамм Ji99 (ST239Δ spa ) с Φ85 для создания комплементации: Ji99Δ spa (p239), Ji99Δ spa (p398) и Ji99Δ spa (pCL55).
Модель колонизации носа
Самок мышей BALB / c использовали для модели назальной колонизации (восемь мышей на группу). Все мыши были в возрасте 6-8 недель на момент использования и получали питьевую воду, содержащую ампициллин (100 мкг / мл). штаммов S. aureus выращивали до фазы среднего экспоненциального роста, промывали и ресуспендировали в стерильном PBS из расчета 1 × 10 ¹⁰ КОЕ на мл. Мышей анестезировали изофлураном. Посевной материал, который содержал 1 × 10 ⁸ КОЕ в 10 мкл PBS или только PBS, медленно пипетировали в ноздри анестезированных мышей, не касаясь носа кончиком пипетки. Через три дня после инокуляции по восемь мышей в группе умерщвляли и оценивали носительство S.aureus . Носовую область протирали снаружи 70% этанолом и ткань носа гомогенизировали в 0,5 мл TSB. Общее количество КОЕ S. aureus на нос оценивали путем посева 100 мкл разбавленных назальных суспензий на агар TSB, содержащий ампициллин (100 мкг / мл; Li et al., 2012).
ОТ-ПЦР и вестерн-блот экспрессии SpA
Для выделения РНК ночные культуры разводили 1: 100 в 50 мл TSB и инкубировали при 37 ° C со встряхиванием при 220 об / мин в течение 8 часов. Комплементарную ДНК (кДНК) синтезировали из общей РНК с использованием системы обратной транскрипции QuantiTect (Qiagen, Hilden, Германия) в соответствии с инструкциями производителя.Олигонуклеотидные праймеры были сконструированы с использованием Primer Express (дополнительная таблица 2). Полученные образцы кДНК и отрицательного контроля амплифицировали с использованием набора для ПЦР QuantiTect SYBR green (Qiagen). Реакции проводили в 96-луночном реакционном планшете MicroAmp Optical с использованием детектора последовательности 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Стандартные кривые были определены для каждого гена с использованием очищенной хромосомной ДНК в концентрациях 0,005–50 нг / мл. Все количественные эксперименты qRT-PCR были выполнены в двух экземплярах с gyrB в качестве внутреннего контроля (Li et al., 2012).
штаммов S. aureus инокулировали из замороженных запасов в TSB и выращивали в течение ночи. Культуру разбавляли 1: 100 и инкубировали при 37 ° C до постэкспоненциальной фазы (8 ч). Образцы удаляли из культур в соответствии с показаниями OD ₆₀₀ (OD ₆₀₀ = 2) и центрифугировали при 20000 × g в течение 1 мин. Осадок клеток промывали 1 мл раствора PBS и суспендировали в 20 мкл TSM [50 мМ Трис · HCl (pH 7,5), 0,5 М сахарозы, 10 мМ MgCl ₂] и помещали при 37 ° C на 30 минут для переваривания. оболочка клеточной стенки с лизостафином (100 мкг · мл ^-1).Перевариваемый продукт центрифугировали при 20000 × g в течение 1 мин и супернатант использовали в качестве белков клеточной стенки. Белки, высвобожденные в культуру, собирали в супернатантах и добавляли к 1/5 объема 100% TCA. Образцы встряхивали и инкубировали при -20 ° C в течение 30 мин. Осажденные белки собирали центрифугированием при 22000 × g в течение 15 мин. Супернатант отбрасывали, а белковые осадки дважды промывали ледяным ацетоном, сушили на воздухе и солюбилизировали в 25 мкл 4% SDS в 0,5 М трис · HCl (pH 8.0), собранных в виде высвободившихся белков в культуру. Добавляли равный объем буфера для образцов SDS-PAGE [125 мМ Трис · HCl (pH 6,8), 4% SDS, 20% глицерин, 10% 2-меркаптоэтанол, 0,01% бромфенолового синего] и образцы белка кипятили в течение 10 мин. . Белки разделяли на 12% SDS-PAGE гелях и переносили электропереносом на PVDF-мембрану. Мембрану обрабатывали блокирующим буфером (5% сухого молока в PBST), затем кроличьими анти-SpA (1: 1000), затем инкубировали при комнатной температуре и вторичным антителом против кроличьего иммуноглобулина G (IgG), конъюгированным с HRP (1: 2000, Cell Signaling, Technology, Дэнверс, Массачусетс, США).Реакции были сделаны видимыми с помощью диаминобензидина. Чтобы гарантировать согласованность между блотами, SrtA использовали в качестве контроля фракционирования. Денситометрический анализ выполняли с помощью программного обеспечения ImageJ для каждой полосы белка по отношению к соответствующей полосе сортировки А.
S. aureus Инфекция кератиноцитов и эпителиальных клеток
Для анализа адгезии S. aureus культивировали в TSB, а осадок клеток дважды промывали средой RPMI1640 или F12K (модификация Kaighn для среды Ham’s F-12).Клетки бессмертных кератиноцитов человека HaCaT культивировали в среде RPMI 1640 с добавлением фетальной бычьей сыворотки (FBS, 10%) в колбах T75 при 37 ° C и 5% CO ₂. Клетки высвобождали из колб с использованием раствора трипсин-ЭДТА (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США), ресуспендировали в культуральной среде и высевали из расчета 2 × 10 ⁶ клеток / лунку при множественности инфицирования (MOI) 100. в конечном объеме 500 мкл в течение 120 мин при 37 ° C с 5% CO ₂. Клетки промывали 3 раза в RPMI 1640 и 10 ⁸ КОЕ S.aureus и инкубировали с клетками в течение 120 мин. Покровные стекла, которые использовались для определения общего количества ассоциированных КОЕ (прилипших и интернализованных), промывали погружением три раза и впоследствии лизировали добавлением 500 мкл 0,1% раствора дезоксинатрийхолата. Бактериальные КОЕ подсчитывали серийными разведениями лизатов эпителиальных клеток и высевали на чашки с TSA. Процедура инфицирования эпителиальных клеток A549 S. aureus была такой же, как описано выше, за исключением того, что клетки культивировали в среде F12K с добавлением фетальной бычьей сыворотки (FBS, 10%) и L-глутамина (2 мМ).
Фагоцитоз и выживаемость бактерий в цельной крови
штаммов S. aureus выращивали до средней фазы экспоненциального роста, промывали и ресуспендировали в стерильном PBS при 10 ⁸ КОЕ / мл. 10 ⁷ КОЕ S. aureus в 100 мкл PBS медленно вносили пипеткой в 10 мл гепаринизированной крови, осторожно перемешивали в течение 30 с и инкубировали при 37 ° C. Готовили мазки крови из каждой временной точки (0, 15, 30, 45, 60 и 90 мин), и клетки окрашивали модифицированным красителем Райта-Гимзы.Общее количество S. aureus (связанных, проглоченных и находящихся на расстоянии 10 мкм от нейтрофилов) оценивали с использованием 50 нейтрофилов на анализ. Поскольку клинические штаммы ST239 обладают высокой устойчивостью к гентамицину (Li et al., 2013), выжившими при существующем гентамицине 100 мкг / мл, расчет фагоцитированных бактерий в анализе защиты от гентамицина не проводился. Процент фагоцитоза рассчитывали с использованием уравнения: количество проглоченных бактерий / (PMN-ассоциированные бактерии, PMN-связанные бактерии, проглоченные бактерии) × 100.Для определения выживаемости 100 мкл гепаринизированной крови помещали на TSA, содержащий 5% овечьей крови, для обнаружения S. aureus (Li et al., 2012).
Инфекция клеток RAW 264.7
S. aureus и обнаружение растворимого TNFR1 Клетки
RAW 264.7 (линия клеток макрофагов мыши) культивировали в среде RPMI 1640 (Life Technologies, Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США) с добавлением 10% FBS, 0,11 мг / мл пирувата (Sigma-Aldrich), 0,29 мг / мл GlutaMAX. (Life Technologies) и 1 × заменимые аминокислоты (Life Technologies).Клетки RAW 264.7, культивированные до слияния, отделяли от сыворотки за 24 ч до воздействия стимулов. штаммов S. aureus выращивали в TSB и суспендировали в среде RPMI 1640 в концентрации 1 × 10 ⁸ КОЕ / мл. Клетки RAW 264.7 добавляли к подготовленным штаммам S. aureus и центрифугировали при 1000 × g в течение 5 минут перед инкубацией в 5% CO ₂ при 37 ° C. Супернатанты собирали и использовали для обнаружения растворимого TNFR1 через 30, 60 и 120 минут после заражения (Giai et al., 2013). Растворимый TNFR1 количественно определяли в супернатантах культур с помощью иммуноферментного анализа (ELISA) с использованием пар антител DuoSet (Abcam, Cambridge, MA, USA).
Бактериемия
S. aureus в мышином сепсисе, модель
Ночные культуры 10 клинических изолятов S. aureus ST239 и ST398 разводили 1: 100 в свежем TSB и выращивали в течение 4 часов при 37 ° C. Стафилококки осаждали, промывали и суспендировали в PBS до OD ₆₀₀ 4 (~ 1 × 10 ⁹ КОЕ / мл).Посевной материал определяли количественно, нанося аликвоты образца на TSA и подсчитывая образование колоний. Мышей BALB / c (возраст 4-6 недель, самки) анестезировали путем ингаляции изофлураном (100 мг / мл на килограмм массы тела). Мышей инфицировали 100 мкл бактериальной суспензии (1 × 10 ⁸ КОЕ) с помощью ретроорбитальной инъекции и наблюдали за выживаемостью.
Почечный абсцесс Модель
Ночные культуры S. aureus ST239-Ji99 и его изогенный мутант разводили 1: 100 в свежем TSB и выращивали в течение 4 ч при 37 ° C.Стафилококки осаждали, промывали и суспендировали в PBS до OD ₆₀₀ 0,4 (~ 1 × 10 ⁸ КОЕ / мл). Мышей сублетально заражали 100 мкл бактериальной суспензии (1 × 10 ⁷ КОЕ). Животных умерщвляли на 7 и 15 день после заражения. Обе почки были удалены, и стафилококковая нагрузка в почках была проанализирована после гомогенизации почечной ткани с помощью PBS и 0,1% Triton X-100. Серийные разведения гомогената наносили на TSA и инкубировали для образования колоний.Левая почка исследована гистопатологически. Вкратце, почки фиксировали в 10% формалине в течение 24 часов при комнатной температуре. Затем ткани заключали в парафин, делали тонкие срезы (4 мкм), окрашивали гематоксилином и эозином и исследовали с помощью световой микроскопии для наблюдения за абсцессами. Поражения абсцесса были идентифицированы как очаги инфильтрированных иммунных клеток (в основном нейтрофилов) и / или бактериальных сообществ (сообщество стафилококковых абсцессов; Kim et al., 2011).
Статистический анализ
Непарные двусторонние тесты Стьюдента t были выполнены для анализа статистической значимости носовой колонизации, экспрессии spa , бактериальной адгезии, данных выживаемости в крови, данных ELISA, показателей выживаемости и бактериальной нагрузки в экспериментальных моделях инфекции животных.Все данные были проанализированы с использованием Prism (GraphPad Software, Inc., Ла-Хойя, Калифорния, США), и P <0,05 считали статистически значимыми.
Результаты
Скорость носовой колонизации клинических изоальтов HA-MRSA ST239 намного выше, чем изоальтов CA-SA ST398
Было доказано, что колонизация носовых ходов MRSA, присутствующая при поступлении в больницу или приобретенная во время госпитализации, является фактором риска последующих инфекций MRSA (Davis et al., 2004; Wertheim et al., 2004). ST239 — это широко распространенный во всем мире MRSA, приобретенный в медицинских целях, и особенно распространен в Китае (Li et al., 2013; Xiao et al., 2013). Чтобы изучить способность ST239 к носовой колонизации, мы установили носовую колонизацию у мышей BALB / c, свободных от конкретных патогенов, с помощью случайно выбранных клинических штаммов ST239 и ST398. Перед инокуляцией мышам вводили ампициллин (все штаммы были устойчивы к ампициллину) с питьевой водой в течение 24 часов и на время эксперимента, чтобы уменьшить влияние комменсальной бактериальной флоры.На 3 день после инокуляции ткань носа вырезали, гомогенизировали и подсчитывали количество КОЕ на нос. Было замечено, что наблюдалась значительная разница в количестве колонизированных ST239 по сравнению с ST398 ( p = 0,0091), предполагая, что носовая колонизация ST239 была намного выше, чем ST398 (Рисунок 1). Это соответствовало постоянному распространению, вызванному ST239. Однако фактор, способствующий колонизации ST239 MRSA, еще предстоит определить.
Рисунок 1.Скорость носовой колонизации клинических изоальтов HA-MRSA ST239 намного выше, чем изоальтов CA-SA ST398 Мышей интраназально инокулировали клинически изолированными изолятами HA-MRSA ST239 и CA-SA ST398 (1 × 10 ⁸ КОЕ на мышь) . Через 3 дня мышей умерщвляли и устанавливали носовую бактериальную нагрузку. Инокуляция изолятами HA-MRSA ST239 приводила к значительно большей колонизации, чем изоляты CA-SA ST398. Статистический анализ проводился с использованием непараметрического критерия t- ( n = 8 на группу), ** p <0.01.
spa Экспрессия повышена в клинических изолятах HA-MRSA ST239, как на уровне РНК, так и на уровне белка, по сравнению с изолятами CA-SA ST398 Экспрессия
spa была проанализирована с помощью количественной ОТ-ПЦР в реальном времени на серии клинически изолированных штаммов ST239 и ST398 с типичными инфекционными проявлениями в клинических больницах Шанхая в 2005–2012 годах, 14 изолятов, соответственно. После 8 часов культивирования уровень транскрипции spa в изолятах HA-MRSA ST239 был выше, чем у изолятов CA-SA ST398 (рис. 2C).Затем мы исследовали уровень экспрессии белка с помощью вестерн-блоттинга. SpA как закреплен на клеточной стенке, так и частично секретируется в супернатант (Becker et al., 2014). Примечательно, что оба компонента были обнаружены. Мы обнаружили, что большая часть штаммов HA-MRSA ST239 экспрессировала больше SpA по сравнению с CA-SA ST398 как в клеточной стенке, так и в секретируемых фрагментах (рисунки 2A, B), указывая на то, что в целом штаммы HA-MRSA ST239 экспрессировали больше SpA, что может способствовать к стойкой колонизации штаммами HA-MRSA ST239.
Рисунок 2. spa Экспрессия повышена в клинических изолятах HA-MRSA ST239 как на уровне РНК, так и на уровне белка, по сравнению с изолятами CA-SA ST398 . (A) Клинические изоляты HA-MRSA ST239 и CA-SA ST398 культивировали в течение 8 часов, затем центрифугировали для отделения внеклеточного белка A (обозначенного буквой «S») от белка А, связанного с бактериальной клеточной стенкой (обозначенного буквой «W»). »). После обработки оболочки стафилококковой клеточной стенки лизостафином белки в обеих фракциях анализировали иммуноблоттингом с поликлональными антителами против белка А.Исходные гели представлены на дополнительном рисунке 1. (B) Полуколичественный денситометрический анализ каждой полосы белка по отношению к соответствующей полосе сортировки A проводили с использованием программного обеспечения ImageJ. (C) РНК-транскриптов определяли количественно относительно транскрипции гена домашнего хозяйства gyrB через 8 часов (постэкспоненциальная фаза) культур клинических изолятов HA-MRSA ST239 и CA-SA ST398. Каждая точка представляет собой различную деформацию. Указаны статистически значимые различия между ST239 и ST398: * p <0.05, *** р <0,001
SpA улучшает способность к носовой колонизации
S. aureus ST239
Нос человека является основным резервуаром S. aureus . Некоторые молекулярные факторы S. aureus были идентифицированы как потенциально ответственные за носовую колонизацию, включая тейхоевые кислоты (Weidenmaier et al., 2004), специфические поверхностные белки (Wertheim et al., 2008; Corrigan et al., 2009) и иммуномодулирующие факторы (Jin et al., 2004; Кларк и др., 2007). SpA также является важным фактором, блокирующим активацию и опсонизацию комплемента (Rooijakkers et al., 2005), который обнаруживается на уровне РНК в мазках из носа (Burian et al., 2010). Это побудило нас исследовать взаимосвязь между SpA и носовой колонизацией. Мы сконструировали мутантные штаммы Δ spa ST239-Ji99 и ST398-1059. Кроме того, ген spa Ji99 [Ji99Δ spa (p239)] и 1059 [Ji99Δ spa (p398)] был дополнен мутантным штаммом Ji99Δ spa , и были созданы модели носовой колонизации диким типом, Δ spa мутант и комплементарные штаммы.Как показано на Фигуре 3, колонизация носовой полости резко снижалась с обоими мутантными штаммами Δ spa по сравнению со штаммами дикого типа, комплементация либо Ji99 spa , либо 1059 spa обращала назальную колонизацию ST239 дикого типа. Кроме того, было также статистическое различие между двумя штаммами с делецией spa (рис. 3), что указывает на то, что SpA — не единственный фактор, влияющий на колонизацию между ST239 и ST398.
Рисунок 3.SpA улучшает назальную колонизирующую способность S. aureus ST239 . Мышам интраназально инокулировали WT ST239-Ji99, ST398-1059, их мутантные штаммы Δ spa (Ji99Δ spa , 1059Δ spa ) и дополнительные штаммы [Ji99Δ spa (p239), Ji99Δ spa )] (1 × 10 ⁸ КОЕ на мышь). Через 3 дня мышей умерщвляли и определяли бактериальную нагрузку в носу. Статистический анализ проводился с использованием непараметрического критерия t ( n = 8 на группу), ** p <0.01.
SpA улучшает адгезионную способность кератиноцитов и эпителиальных клеток
S. aureus ST239
Поскольку SpA представляет собой связанный с поверхностью белок в составе компонентов микробной поверхности, распознающих молекулы адгезивного матрикса (MSCRAMM) (Speziale et al., 2009), мы задались вопросом, играет ли этот белок также роль во взаимодействии с кератиноцитами и эпителиальными клетками. Были сконструированы мутант spa (Ji99Δ spa , 1059Δ spa ) и комплементарные штаммы [Ji99Δ spa (p239), Ji99Δ spa (p398)] с векторным комплементом pCL55 [Ji9966Δ spa pCL55)] используется в качестве контроля.Экспрессия SpA в штаммах комплемента была подтверждена вестерн-блоттингом (рис. 4А). Все штаммы добавляли к культивированным монослоям кератиноцитов человека (HaCaT) и эпителиальных клеток легких (A549) на 2 ч для измерения прикрепления бактерий. Как и ожидалось, количество прикрепленных и интернализованных бактерий Ji99 дикого типа было больше, чем количество 1059 бактерий, и оба были заметно уменьшены в штаммах с делецией spa . Штаммы комплемента SpA из ST239 (Ji99) или ST398 (1059) могут изменить способность бактерий к адгезии (рис. 4B).Похоже, что разница между двумя клиническими штаммами мало связана с различными структурами генов spa . Эти результаты свидетельствуют о том, что белок А усиливает адгезию кератиноцитов и эпителиальных клеток штаммов HA-MRSA ST239 и, в свою очередь, способствует колонизации. Статистическая разница в двух штаммах с делецией spa показала, что SpA не был единственным фактором, влияющим на адгезию бактерий (рис. 4В).
Рисунок 4.SpA улучшает адгезию кератиноцитов и эпителиальных клеток S. aureus ST239. (A) Вестерн-блоттинг против SpA бактерий WT, мутант Δ spa , мутант Δ spa , дополненный геном ST239 spa [Δ spa (p239)], ген ST398 spa [Δ spa (p398)] или вектор [Δ spa (pCL55)]. (B) Подсчет колоний адгезивных и интернализованных бактерий в кератиноцитах HaCaT и эпителиальных клетках A549, инфицированных в течение 2 часов.Для ST239 можно было наблюдать ~ 0,25-кратное увеличение по сравнению с ST398 и ~ 1-кратное увеличение по сравнению с мутантом Δ spa . Статистические различия определяли с помощью однофакторного дисперсионного анализа с тестом множественного сравнения Тьюки, * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001. Данные представляют из трех независимых экспериментов.
Устойчивость к фагоцитозу снижена у штамма ST239 Δ
spa
Нейтрофилы играют центральную роль в защите человека от S.aureus инфекция. Поступление и репликация стафилококков в тканях хозяина приводит к высвобождению бактериальных продуктов, которые производят воспалительные сигналы. Нейтрофилы отвечают на этот призыв, выходя из кровеносных сосудов, мигрируя к месту инфекции, чтобы фагоцитировать и убивать бактерии или иммобилизовать и повредить патоген (Thammavongsa et al., 2015). При столкновении с нейтрофилами большинство бактерий легче фагоцитируется по сравнению с S. aureus . Освободившийся SpA вместе с заякоренной стенкой может взаимодействовать с Fcɤ-областью IgG (Peterson et al., 1977) через IgG-связывающие домены (Deisenhofer, 1981), покрывая поверхность клетки молекулами IgG, неспособными распознаваться рецептором Fc нейтрофилов, и блокируя фагоцитоз нейтрофилов S. aureus . Более того, штаммы, богатые протеином А, фагоцитируются медленнее, чем штаммы с низкой экспрессией протеина А (Peterson et al., 1977). Поэтому мы исследовали антифагоцитарный эффект протеина A у WT ST239-Ji99 с высоким уровнем протеина A и мутантного штамма Δ spa без протеина A.После 15 мин инкубации с нормальной цельной кровью человека мутантный штамм Δ spa претерпел более высокую степень фагоцитоза, чем WT ( p <0,0001). Этот эффект также можно было наблюдать через 30 минут инкубации ( p = 0,0031), как видно из мазка крови через 15–45 минут после фагоцитоза (рисунки 5A, B). Комплементация гена Ji99 spa и гена 1059 spa привела к такой же выживаемости в крови человека, как и у Ji99 WT после 15 минут фагоцитоза, что было намного выше, чем у мутанта Δ spa (фиг. 5C).Более высокая антифагоцитозная способность ST239, в основном из-за его высокой экспрессии протеина А, увеличивала его иммунное уклонение от иммунных клеток хозяина.
Фигура 5. Устойчивость к фагоцитозу, опосредованному белком А, повышена в штаммах HA-MRSA ST239 . (A) Анализ фагоцитоза. Фагоцитоз нейтрофилов человека ST239 или мутантных бактерий Δ spa исследовали с помощью световой микроскопии. Значительные различия наблюдались при 15 и 30 мин инкубации. (B) Микроскопическое исследование фагоцитоза. Срезы окрашивали с использованием модифицированного красителя Райта-Гимзы через 0, 15, 45 и 90 мин. Было меньше фагоцитированных бактерий S. aureus ST239 в нейтрофилах по сравнению с мутантным штаммом через 15–45 мин. (C) Выживаемость в крови человека при t = 15 мин (другое время, такое как 30- и 45-минутные временные точки, являются статистически значимыми, но не так много по сравнению с 15-минутными временными точками). Указаны статистически значимые различия, ** p <0.01, *** p <0,001.
Белок А ослабляет воспалительный ответ, вызванный ST239, посредством раннего выделения TNFR1
Уклонение от иммунного ответа хозяина является жизненно важной стратегией для обеспечения продолжительности инфекции S. aureus . Белок А играет еще одну ключевую роль в подрыве иммунного ответа хозяина благодаря своей способности вызывать раннее высвобождение рецептора 1 TNF-α (TNFR1). Повышенные уровни растворимого TNFR1, присутствующего во время экспериментальной инфекции S. aureus , могут нейтрализовать циркулирующий TNF-α и ослабить воспалительный ответ хозяина (Giai et al., 2013). Было показано, что среди индуцированных провоспалительных цитокинов TNF-α имеет решающее значение для уничтожения бактерий в других экспериментальных моделях (Nakane et al., 1995). Что касается наших клинических изолятов ST239 с высокой экспрессией протеина А, конкретный задействованный механизм еще предстоит выяснить. Мы предположили, что более низкая вирулентность ST239 может быть связана с более высокой экспрессией SpA, что может ослабить воспалительный ответ. Следовательно, кинетика выделения TNFR1 в ответ на цельные живые клинические изоляты S.aureus ST239 и ST398 исследовали на макрофагах.
Выделение TNFR1, а также очевидное различие между штаммами ST239 и ST398 произошло уже через 30 минут после воздействия на макрофаги S. aureus . Разница в выделении была еще больше при воздействии 120 мин (рис. 6А). У мутанта Δ spa было гораздо меньше шедевра TNFR1 по сравнению с WT ST239-Ji99. Когда ген spa был дополнен мутантом, либо Ji99 spa , либо 1059 spa , выделение TNFR1 вернулось к уровню дикого типа через 30–120 минут после заражения (Фигуры 6B – D).Таким образом, эффект выделения TNFR1 протеина A был выше в ST239, что составляет решающую стадию иммунного уклонения от инфекций S. aureus .
Фигура 6. Белок А вызывает раннее выделение TNFR1, ослабляя воспалительную реакцию после инфицирования HA-MRSA ST239 . Клетки RAW 264.7 стимулировали клиническими изолятами HA-MRSA ST239, CA-SA ST398 (A) или ST239-Ji99 дикого типа, мутантом Δ spa и комплементарными штаммами (B – D) на время указано.Концентрацию sTNFR1 определяли с помощью ELISA. Данные представляют собой средние значения и стандартные отклонения совокупных данных трех независимых экспериментов ( n = 3 для каждого эксперимента). Звездочки указывают на значительные различия (** p <0,01) по непараметрическому критерию t-.
SpA Может способствовать длительному повреждению хозяина, инфицированного HA-MRSA ST239
SpA способствует вирулентности S. aureus при инфекциях, таких как артрит и сепсис (Palmqvist et al., 2002). Устойчивость HA-MRSA к метициллину влияет на сенсорную систему бактерий agr , что приводит к снижению вирулентности и неспособности перемещаться в сообщество, в то время как возникающий MRSA, связанный с сообществом (CA-MRSA), обычно экспрессирует меньше пенициллин-связывающего белка 2a (кодируется mecA), что позволяет им сохранять полную вирулентность и преуспевать в среде сообщества (Rudkin et al., 2012). Для проверки смертности от инфекции между эпидемическим HA-MRSA ST239 с высокой экспрессией SpA и CA-SA ST398 была разработана модель острого сепсиса на мышах BALB / c.Группы мышей инокулировали внутривенно клиническими изолятами ST239 или ST398. Штаммы ST398 вызвали значительно более высокий ( p <0,001) уровень смертности, чем ST239 (фигура 7A). Смертность ST239 была относительно ниже, чем ST398.
Рис. 7. SpA способствует длительному повреждению хозяина, инфицированного HA-MRSA ST239 . (A) Процент выживших мышей в модели сепсиса мышей, зараженных 1 × 10 ⁹ КОЕ клинически изолированных ST239 и ST398.Смертность в течение экспериментального периода была значительно ниже у мышей, инфицированных HA-MRSA ST239, по сравнению с мышами, инфицированными штаммами CA-SA ST398, по оценке логарифмического рангового теста ( p <0,05 после поправки Бонферрони для множественного тестирования. n = 10 / группа). (B) Когорты мышей BALB / c ( n = 8–10) получали инъекцией в ретроорбитальное сплетение либо 1 × 10 ⁸ КОЕ S. aureus ST239, либо Δ spa мутант.На 7 или 15 день после заражения животных умерщвляли для подсчета количества стафилококков в тканях почек. Во время сублетального заражения смертности не наблюдалось. (C-E ‘) Репрезентативные гистопатологические препараты, окрашенные гематоксилином и эозином, почек на 15-й день после заражения. Белые стрелки указывают на сообщества стафилококкового абсцесса. Гистопатологические изображения получали с помощью световой микроскопии при увеличении × 40 (C – E) и × 200 (C ′ –E ′ ) .Масштабные линейки представляют 100 мкм (C – E) и 25 мкм (C ′ –E ′ ) соответственно. Данные на животных являются репрезентативными для 3 независимых экспериментов. * p <0,05, *** p <0,001.
CA-SA ST398 может продуцировать множество внешних токсинов, увеличивая его инвазивную способность и легко вызывая более серьезные инфекции у здоровых людей, в то время как ST239 производит большее количество белка A. Чтобы исследовать более высокую экспрессию белка A в патогенности ST239 После инфекций мы разработали модель абсцесса почки на мышах с сублетальными зараженными бактериями WT Ji99 и его изогенным мутантным штаммом spa и оценили тяжесть инфекции путем подсчета КОЕ стафилококков на почку.Как через 7, так и через 15 дней после инокуляции количество стафилококков на почку было снижено у мышей, инфицированных мутантом Δ spa , по сравнению с мышами, инфицированными WT (фигура 7B). Повреждение тканей при развитии образования абсцесса в почках у инфицированных мутантами мышей также уменьшалось в отличие от мышей, инфицированных WT (Фигуры 7C’ – E ‘). Эти данные свидетельствуют о том, что белок А является важным фактором, воздействующим на абсцессы, в значительной степени способствуя длительному повреждению при инфекции HA-MRSA ST239.
Обсуждение
S. aureus — распространенный патоген, вызывающий множество инфекций. MRSA, ответственный за бесчисленное количество лекарственно-устойчивых инфекций, связанных со здоровьем во всем мире, эволюционировал с постепенной адаптацией к окружающей среде. Недавние исследования продемонстрировали решающие адаптивные реакции HA-MRSA на высокоселективную среду системы здравоохранения и эволюцию изолятов HA-MRSA до еще более высоких уровней устойчивости к антибиотикам за счет ослабления вирулентности (Baines et al., 2015), что повышает его способность стать успешным внутрибольничным патогеном. Высокий уровень экспрессии mecA в HA-MRSA влияет на сенсорную систему бактерий agr , что приводит к снижению вирулентности и неспособности перемещаться в сообщество, в то время как появляющиеся CA-MRSA обычно экспрессируют меньше пенициллин-связывающего белка 2a (кодируемого mecA), что позволяет они сохраняют полную вирулентность и преуспевают в среде сообщества (Рудкин и др., 2012). Штаммы HA-MRSA менее вирулентны как прямое следствие высокой экспрессии гена mecA (Rudkin et al., 2012) в дополнение к экспрессии psm-mec , предполагаемого регуляторного локуса вирулентности, а также цитолитического фенолорастворимого модулялина, идентифицированного в связанном со здравоохранением элементе SCC mec типа II (Queck et al., 2009; Kaito et al., 2011).
В нашем исследовании мы сосредоточились на глобальном распространении HA-MRSA ST239, преобладающей больничной инфекции в Китае на протяжении десятилетий и совершенно отличной от появляющейся CA-SA ST398, инфицирующей здоровое население без контакта с медицинскими учреждениями и без связи с животными (Чжао и другие., 2012). Чтобы выяснить, что позволяет HA-MRSA ST239 успешно колонизировать в условиях больницы и постепенно переходить к серии широко распространенных инвазивных инфекций, мы искали дополнительные факторы, помимо существующей экспрессии psm-mec и mecA , которые ослабляют вирулентность и способствовать ее распространению в нозокомиальных условиях. Мы обнаружили более высокую экспрессию протеина A с помощью HA-MRSA ST239 по сравнению с CA-SA ST398. Примечательно, что белок А, высококонсервативный белок, экспрессируемый всеми S.aureus , является важным иммуномодулирующим фактором, блокирующим опсонофагоцитоз через Fc-связывающий домен и индуцирующим апоптоз В-клеток путем связывания с доменами Fab и перекрестного связывания IgM клана V _H 3 в В-клетках. В значительной степени SpA-нейтрализующие антитела не могут вырабатываться во время инфекций. Суперантигенная активность SpA ведет к иммунодоминантности, ограничивая ответы хозяина на другие факторов вирулентности S. aureus (Pauli et al., 2014). SpA может являться решающим фактором колонизации и распространения эпидемического клона HA-MRSA ST239 в больничных условиях.
Protein A, белок, заякоренный в клеточной стенке, также может высвобождаться во внеклеточное окружение для доступа к иммунной системе хозяина (Becker et al., 2014). spa экспрессируется всеми клиническими изолятами S. aureus с консервативными доменами связывания иммуноглобулина. Однако его экспрессия в разных клонах может быть очень разнообразной, как показано в нашем исследовании. SpA также обнаруживается на уровне РНК в мазках из носа (Burian et al., 2010). Экзопротеом носового штамма S.aureus сравнивали с генетически подобным штаммом, не являющимся носителем, что показало, что стафилококковый белок А присутствовал в значительно более высоких уровнях в штаммах-носителях, чем в штаммах, не являющихся носителем, что предполагает связь белка А с носительством через нос (Muthukrishnan et al., 2011 ). Мы наблюдали, что повышенная экспрессия протеина A в HA-MRSA ST239 усиливала назальную колонизацию этого клона. Механизмом стимулирования колонизации может быть последовательное гликозилирование SpA в штаммах носителей через нос, в то время как гликозилирование экзопротеинов, таких как SpA, может играть решающую роль в бактериальном патогенезе и иммуноэвазии (Schmidt et al., 2003; Muthukrishnan et al., 2011). За исключением носовой полости, S. aureus колонизируют кожу, подмышки и криссум. Колонизация может быть связана с взаимодействием между SpA и кератиноцитами эпидермиса. Существуют исследования, открывающие важную роль протеина А в адгезии стафилококков к эпидермальным клеткам человека (Cole and Silverberg, 1986; Mempel et al., 1998). Это было подтверждено низкой адгезионной способностью штаммов мутантных белков A-отрицательных Ji99Δ spa и 1059Δ spa к культивируемым монослоям.Его аналогом на кератиноцитах человека может быть β-актин цитоскелета. Связывание SpA с эпителиальными актиновыми филаментами млекопитающих играет роль в интернализации и распространении S. aureus (Jung et al., 2001). Затем мы проверили это сродство связывания SpA в эпителиальных клетках человека, которое участвует в регуляции инвазии S. aureus эпителиальными клетками с удлинением актиновых филаментов за счет их полимеризации. Здесь мы видим, что увеличенный SpA ST239 усиливает адгезию к кератиноцитам, а также к эпителиальным клеткам.И это помогает стимулировать колонизацию ST239 у человека путем получения положительной обратной связи. Кроме того, два штамма spa с делецией ST239 и ST398 статистически различались по колонизации и адгезии, что указывает на то, что в этом процессе участвуют и другие факторы, кроме белка A.
Факторы риска инфицирования S. aureus включают недавнюю операцию, госпитализацию или госпитализацию, использование антибиотиков, диализ и постоянный постоянный катетер (Nathwani et al., 2008). При попадании в хозяина HA-MRSA ST239 защищает от иммунного ответа за счет раннего сопротивления фагоцитозу нейтрофилов и индукции апоптоза активированных В-клеток за счет экспрессии закрепленного на поверхности и высвобожденного SpA, подавляя выработку нейтрализующих антител против SpA и многих других антигенов. , что способствует его распространению из очагов заражения в другие регионы.
Предыдущие исследования показали, что эндогенный TNF играет важную роль в устойчивости хозяина к S.aureus , в то время как эндогенный IFN-β обеспечивает защиту на ранней стадии инфекции и играет пагубную роль на поздних стадиях инфекции (Nakane et al., 1995). Было показано, что TNF изменяет многие свойства нейтрофилов in vitro : усиление фагоцитоза, индукцию дегрануляции, стимуляцию присоединения и стимуляцию образования супероксидов. Мыши, лишенные способности продуцировать TNF-α, имеют более высокую смертность и неэффективный бактериальный клиренс в модели артрита и абсцесса мозга S. aureus (Hultgren et al., 1998; Kielian et al., 2004). Белок A распознает TNFR1 на эпителиальных клетках и вызывает воспаление через TNFR1 путем активации передачи сигналов TNF-α-TNFR1, что приводит к рекрутированию и активации нейтрофилов и бактериальному клиренсу из дыхательных путей, хотя и за счет PMN-ассоциированного повреждения эпителия и дыхательных путей. компромисс (Gomez et al., 2004). Белок А играет еще одну ключевую роль в индукции раннего высвобождения TNFR1 на макрофагах. Повышенные уровни растворимого TNFR1, присутствующего во время систематической инфекции HA-MRSA ST239, могут нейтрализовать циркулирующий TNF-α и ослабить воспалительный ответ хозяина (Giai et al., 2013). Комбинация препаратов против TNF-α и антибиотика облегчает исход артрита и сепсиса S. aureus в модели на мышах (Fei et al., 2011; Ali et al., 2015). Действие растворимого TNFR1 во многом напоминает действие препаратов против TNF-α, что позволяет предположить, что блокирование TNF-α действительно увеличивает выживаемость бактерий при инфекциях и приносит пользу хозяину, уменьшая повреждение, вызванное воспалением. Возможно, это также частично объясняет, почему ST239 кажется менее вирулентным и может колонизировать хозяев в течение более длительного времени.Это новая стратегия ST239, подрывающая иммунный ответ хозяина. Регуляция TNFα-TNFR1 усложняется после инфекции S. aureus in vivo , в значительной степени зависит от типа и стадии заболевания и различается по локализованным и системным инфекциям (Giai et al., 2013). Затем нам нужно провести больше экспериментов, чтобы прояснить этот процесс в наших следующих исследованиях.
Существует разница в структуре гена spa между клонами ST239 и ST398: длина гена spa в ST239 короче, чем у ST398, который в основном существует в домене D, домене A и области Xr.Связано ли различие между двумя клиническими штаммами с их разными структурами генов spa , кроме разных уровней продукции протеина А? Чтобы ответить на этот вопрос, мы сконструировали два штамма с дополнением spa : Ji99Δ spa (p239), дополненный геном ST239 spa , и 1059Δ spa (p398) с геном ST398 spa . Данные вестерн-блоттинга показали, что экспрессия протеина A в Ji99Δ spa (p239) и 1059Δ spa (p398) была почти на одном уровне (фиг. 4A).Кроме того, два комплементарных штамма spa могут полностью изменить фенотипы, включая носовую колонизацию у мышей, способность адгезии к клеткам, антифагоцитоз и выделение TNFR1, до уровня дикого типа (Рисунки 3, 4B, 5C, 6B – D). ), предполагая, что разница обусловлена не отдельными структурами spa между ST239 и ST398, а экспрессией этого белка.
Белок А также действует как фактор вирулентности при инфекциях S. aureus и необходим для развития образования абсцесса (Palmqvist et al., 2002; Cheng et al., 2009). Palmqvist et al. сообщили, что повышенные уровни TNF-α при инфекциях вызваны мутантами с дефицитом белка A, что согласуется с нашими результатами о SpA-выделении TNFR1 на макрофаги. В модели острого сепсиса (с высокой бактериальной нагрузкой: 1 × 10 ⁹ КОЕ) смертность, вызванная ST239, была значительно ниже, чем ST398 (рис. 7A), что позволяет предположить, что SpA может способствовать низкой смертности при инфекциях ST239 с более высоким SpA. экспрессии, а не острой инфекции, вызванной CA-ST398, в то время как продукция множества внешних токсинов в ST398 может повысить его патогенность.Согласно отчету Cheng et al. SpA необходим для развития абсцессов. Затем мы протестировали функцию SpA, используя сублетальную дозу бактериальной инфекции (с низкой бактериальной нагрузкой: 1 × 10 ⁸ КОЕ), зараженной ST239 вместе с его изогенным мутантным штаммом spa , и наблюдали его роль в формировании тканевого абсцесса. . Наши данные свидетельствуют о том, что SpA точно способствует длительному повреждению почек, поскольку изогенный spa мутантный штамм ST239 имел относительно более низкую бактериальную нагрузку и облегчал повреждение тканей в почках (Фигуры 7B-E ‘).Все вышеперечисленные данные предполагают, что SpA не является ключевым фактором вирулентности при острых инфекциях S. aureus , он может вносить вклад в длительное повреждение хозяина, инфицированного HA-MRSA ST239.
Белок А — это исключительный фактор вирулентности, единственный белок, который может воздействовать на несколько иммунологически важных эукариотических рецепторов. Вероятно, это не совпадение, что белок А является одним из наиболее консервативных экспрессируемых факторов вирулентности стафилококков, а также то, что его уровни экспрессии значительно повышены в стафилококках, выделенных в результате инвазивных инфекций человека (Gomez et al., 2007). Подводя итог, мы предполагаем, что белок А может служить решающим фактором в колонизации и уклонении от иммунитета при инфекциях HA-MRSA ST239, тем самым способствуя устойчивому распространению в условиях больницы.
Очень успешный адаптивный HA-MRSA ST239 вызывает растущее беспокойство во всем мире. Комбинация препаратов против TNF-α и антибиотика может иметь мало пользы в лечебной терапии против инфекций ST239. Исследователи сосредоточили свое внимание на иммунизации нетоксигенным протеином A (SpA _KKAA) или введении моноклональных антител, нейтрализующих протеин A, таким образом вызывая у мышей защитные антитела против высоковирулентных штаммов MRSA (Kim et al., 2010, 2012). Кроме того, было высказано предположение, что SpA _KKAA представляет собой защитный антиген для разработки стафилококковой вакцины (Falugi et al., 2013). Мы надеемся, что вакцина может послужить основой для новой политики профилактики в медицинских учреждениях и для разработки новых антител для лечения инфекций HA-MRSA.
Авторские взносы
Авторы исследования —
ML и YL. XH, JQ, TL, YD, YW и QL проводили эксперименты. XH, TL, LH и ML проанализировали данные. XH и ML составили рукопись.XH, JQ, HL, QG, YL и ML пересмотрели и одобрили рукопись.
Заявление о конфликте интересов
Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.
Благодарности
Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (гранты 81322025 и 81371875, ML), Shanghai Shuguang Talent Project (грант 12SG03, ML), Шанхайским комитетом науки и технологий, Китай (гранты 141400, 15411960500, ML). ) и Фонд инновационных исследовательских групп Национального фонда естественных наук Китая (грант 81421001, ML).
Дополнительные материалы
Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2016.00951
Дополнительная фигура 1. Исходные гели, относящиеся к вестерн-блоттингу против SpA различных клинических изолятов в ST239 и ST398 . Количество изолятов ST398: 1–14. Количество изолятов ST239: 15–28.
Дополнительная таблица 1. Бактериальные штаммы и плазмиды, использованные в этом исследовании .
Дополнительная таблица 2. Олигонуклеотиды, использованные в этом исследовании .
Список литературы
Айрес де Соуза М., Крисостомо М. И., Санчес И. С., Ву Дж. С., Фучжун Дж., Томаш А. и др. (2003). Частое выявление одного клонального типа Staphylococcus aureus с множественной лекарственной устойчивостью у пациентов в двух больницах на Тайване и в Китае. J. Clin. Microbiol. 41, 159–163. DOI: 10.1128 / JCM.41.1.159-163.2003
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Али, А., Велин, А., Шварце, Дж. К., Свенссон, М. Н., На, М., Ярнеборн, А., и др. (2015). Иммуноглобулин CTLA4, но не терапия противоопухолевым фактором некроза, способствует развитию стафилококкового септического артрита у мышей. J. Infect. Дис. 212, 1308–1316. DOI: 10.1093 / infdis / jiv212
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Бейнс, С. Л., Холт, К. Э., Шульц, М. Б., Земанн, Т., Хауден, Б. О., Йенсен, С. О. и др. (2015). Конвергентная адаптация доминирующего глобального больничного клона ST239 метициллин-устойчивого Staphylococcus aureus . МБио 6: e00080. DOI: 10.1128 / mbio.00080-15
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Беккер, С., Франкель, М. Б., Шнеуинд, О., и Миссиакас, Д. (2014). Высвобождение белка А из клеточной стенки Staphylococcus aureus . Proc. Natl. Акад. Sci. США 111, 1574–1579. DOI: 10.1073 / pnas.1317181111
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Burian, M., Wolz, C., and Goerke, C. (2010).Регулирующая адаптация Staphylococcus aureus во время носовой колонизации человека. PLoS ONE 5: e10040. DOI: 10.1371 / journal.pone.0010040
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Чен Х., Лю Ю., Цзян Х., Чен М. и Ван Х. (2010). Быстрая замена метициллин-устойчивых клонов Staphylococcus aureus в китайской больнице третичного уровня в течение 15 лет. Антимикробный. Агенты Chemother. 54, 1842–1847.DOI: 10.1128 / AAC.01563-09
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ченг, А.Г., Ким, Х.К., Бертс, М.Л., Краус, Т., Шнеуинд, О., и Миссиакас, Д.М. (2009). Генетические требования к образованию и сохранению абсцесса Staphylococcus aureus в тканях хозяина. FASEB J. 23, 3393–3404. DOI: 10.1096 / fj.09-135467
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Кларк, С. Р., Мохамед, Р., Биан, Л., Routh, A.F., Kokai-Kun, J.F., Mond, J.J., et al. (2007). Поверхностный белок IsdA Staphylococcus aureus обеспечивает устойчивость к врожденным защитным силам кожи человека. Клеточный микроб-хозяин 1, 199–212. DOI: 10.1016 / j.chom.2007.04.005
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Корриган, Р. М., Миайлович, Х., Фостер, Т. Дж. (2009). Поверхностные белки, которые способствуют прикреплению Staphylococcus aureus к слущенным клеткам носового эпителия человека. BMC Microbiol. 9:22. DOI: 10.1186 / 1471-2180-9-22
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Дантес, Р., Му, Ю., Белфлауэр, Р., Арагон, Д., Думяти, Г., Харрисон, Л. Х. и др. (2013). Национальное бремя инвазивных метициллин-устойчивых инфекций Staphylococcus aureus , США, 2011 г. JAMA Intern. Med. 173, 1970–1978. DOI: 10.1001 / jamainternmed.2013.10423
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Дэвис, К.А., Стюарт, Дж. Дж., Крауч, Х. К., Флорез, К. Э. и Хоспенталь, Д. Р. (2004). Метициллин-резистентный Staphylococcus aureus (MRSA) вызывает колонизацию носа при госпитализации и его влияние на последующую инфекцию MRSA. Clin. Заразить. Дис. 39, 776–782. DOI: 10.1086 / 422997
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Deisenhofer, J. (1981). Кристаллографическое уточнение и атомные модели фрагмента человеческого Fc и его комплекса с фрагментом B белка A из Staphylococcus aureus at 2.Разрешение 9 и 2,8 А. Биохимия 20, 2361–2370. DOI: 10.1021 / bi00512a001
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Дубин Д. Т., Чикраман С. Г., Инглис Б., Мэтьюз П. Р. и Стюарт П. Р. (1992). Физическое картирование области mec австралийской метициллин-устойчивой линии Staphylococcus aureus и близкородственного американского штамма. J. Gen. Microbiol. 138, 169–180. DOI: 10.1099 / 00221287-138-1-169
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Фалуги, Ф., Ким, Х. К., Миссиакас, Д. М., и Шнеуинд, О. (2013). Роль белка А в уклонении от адаптивных иммунных ответов хозяина с помощью Staphylococcus aureus . MBio 4: e00575 – e00513. DOI: 10.1128 / mbio.00575-13
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Fei, Y., Wang, W., Kwiecinski, J., Josefsson, E., Pullerits, R., Jonsson, I.M, et al. (2011). Комбинация ингибитора фактора некроза опухоли и антибиотика облегчает лечение стафилококкового артрита и сепсиса у мышей. J. Infect. Дис. 204, 348–357. DOI: 10.1093 / infdis / jir266
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Geng, W., Yang, Y., Wu, D., Huang, G., Wang, C., Deng, L., et al. (2010). Молекулярные характеристики внебольничного метициллин-устойчивого Staphylococcus aureus , выделенного от китайских детей. ФЭМС Иммунол. Med. Microbiol. 58, 356–362. DOI: 10.1111 / j.1574-695X.2009.00648.x
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Giai, C., Гонсалес, К., Ледо, К., Гарофало, А., Ди Хенаро, М. С., Сорделли, Д. О. и др. (2013). Выделение рецептора 1 фактора некроза опухоли, индуцированное белком А, снижает доступность фактора некроза опухоли альфа и уменьшает воспаление во время системной инфекции Staphylococcus aureus . Заражение. Иммун. 81, 4200–4207. DOI: 10.1128 / IAI.00593-13
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Гомес, М. И., Ли, А., Редди, Б., Мьюир, А., Сунг, Г., Питт, А., и другие. (2004). Staphylococcus aureus белок A индуцирует воспалительные реакции эпителия дыхательных путей путем активации TNFR1. Nat. Med. 10, 842–848. DOI: 10,1038 / нм1079
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Гомес, М. И., Сигда, М. О., и Принс, А. С. (2007). Staphylococcus aureus белок А активирует ТАСЕ посредством EGFR-зависимой передачи сигналов. EMBO J. 26, 701–709. DOI: 10.1038 / sj.emboj.7601554
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Goodyear, К.С., Сильверман, Г. Дж. (2003). Смерть от суперантигена B-клеток: in vivo VH-направленная апоптотическая супраклональная делеция B-клеток стафилококковым токсином. J. Exp. Med. 197, 1125–1139. DOI: 10.1084 / jem.20020552
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Graille, M., Stura, E.A., Corper, A. L., Sutton, B.J., Taussig, M.J., Charbonnier, J. B., et al. (2000). Кристаллическая структура домена A белка Staphylococcus aureus в комплексе с Fab-фрагментом человеческого антитела IgM: структурная основа для распознавания B-клеточных рецепторов и суперантигенной активности. Proc. Natl. Акад. Sci. США 97, 5399–5404. DOI: 10.1073 / pnas.97.10.5399
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Харрис, С. Р., Фейл, Э. Дж., Холден, М. Т., Квейл, М. А., Никерсон, Э. К., Чантратита, Н. и др. (2010). Эволюция MRSA во время госпитальной передачи и межконтинентального распространения. Science 327, 469–474. DOI: 10.1126 / science.1182395
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Huijsdens, X.W., van Dijke, B.J., Spalburg, E., van Santen-Verheuvel, M. G., Heck, M. E., Pluister, G. N., et al. (2006). Приобретенные сообществом MRSA и свиноводство. Ann. Clin. Microbiol. Противомикробный. 5:26. DOI: 10.1186 / 1476-0711-5-26
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст
Халтгрен, О., Эугстер, Х. П., Седжвик, Дж. Д., Кёрнер, Х., и Тарковски, А. (1998). Мыши с двойным мутантом TNF / лимфотоксин-альфа устойчивы к септическому артриту, но демонстрируют повышенную смертность в ответ на Staphylococcus aureus . J. Immunol. 161, 5937–5942.
PubMed Аннотация | Google Scholar
Джин Т., Бокарева М., Фостер Т., Митчелл Дж., Хиггинс Дж. И Тарковски А. (2004). Staphylococcus aureus сопротивляется человеческим дефензинам за счет выработки стафилокиназы, нового механизма уклонения бактерий. J. Immunol. 172, 1169–1176. DOI: 10.4049 / jimmunol.172.2.1169
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Юнг, К. Ю., Ча, Дж.Д., Ли, С. Х., Ву, В. Х., Лим, Д. С., Чой, Б. К. и др. (2001). Участие стафилококкового протеина А и актина цитоскелета в инвазии Staphylococcus aureus культивированных эпителиальных клеток ротовой полости человека. J. Med. Microbiol. 50, 35–41. DOI: 10.1099 / 0022-1317-50-1-35
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Кайто К., Сайто Ю., Нагано Г., Икуо М., Омаэ Ю., Ханада Ю. и др. (2011). Продукты транскрипции и трансляции гена цитолизина psm-mec на мобильном генетическом элементе SCCmec регулируют вирулентность Staphylococcus aureus . PLoS Pathog. 7: e1001267. DOI: 10.1371 / journal.ppat.1001267
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Килиан Т., Бирден Э. Д., Болдуин А. К. и Эсен Н. (2004). IL-1 и TNF-альфа играют ключевую роль в иммунном ответе хозяина на мышиной модели экспериментального абсцесса мозга, вызванного Staphylococcus aureus . J. Neuropathol. Exp. Neurol. 63, 381–396. DOI: 10.1093 / jnen / 63.4.381
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ким, Х.К., Ченг, А. Г., Ким, Х. Ю., Миссиакас, Д. М., и Шнеуинд, О. (2010). Нетоксигенная протеиновая вакцина против метициллин-резистентных инфекций Staphylococcus aureus у мышей. J. Exp. Med. 207, 1863–1870. DOI: 10.1084 / jem.200
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ким, Х. К., Эмоло, К., ДеДент, А. К., Фалуги, Ф., Миссиакас, Д. М., и Шнеуинд, О. (2012). Моноклональные антитела, специфичные к белку А, и профилактика болезни Staphylococcus aureus у мышей. Заражение. Иммун. 80, 3460–3470. DOI: 10.1128 / IAI.00230-12
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ким, Х. К., Ким, Х. Ю., Шнеуинд, О., и Миссиакас, Д. (2011). Идентификация защитных антигенов Staphylococcus aureus , патогена, подавляющего иммунные ответы хозяина. FASEB J. 25, 3605–3612. DOI: 10.1096 / fj.11-187963
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Кореен, Л., Рамасвами, С. В., Грависс, Э. А., Найдич, С., Массер, Дж. М., и Крейсвирт, Б. Н. (2004). Метод спа-типирования для различения изолятов Staphylococcus aureus : значение использования одного маркера для выявления генетической микро- и макровариации. J. Clin. Microbiol. 42, 792–799. DOI: 10.1128 / JCM.42.2.792-799.2004
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Крайсвирт, Б. Н., Лёфдаль, С., Бетли, М. Дж., О’Рейли, М., Шливерт, П.М., Бергдолл, М. С. и др. (1983). Структурный ген экзотоксина синдрома токсического шока не передается профагом. Природа 305, 709–712. DOI: 10.1038 / 305709a0
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ли, М., Ду, X., Вильяруз, А.Э., Диеп, Б.А., Ван, Д., Сонг, Ю. и др. (2012). Эпидемия MRSA связана с быстро распространяющейся детерминантой колонизации и вирулентности. Nat. Med. 18, 816–819. DOI: 10,1038 / нм.2692
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ли Т., Сун, Ю., Чжу, Ю., Ду, X., и Ли, М. (2013). Текущее состояние инфекции Staphylococcus aureus в центральной клинической больнице в Шанхае, Китай. BMC Microbiol. 13: 153. DOI: 10.1186 / 1471-2180-13-153
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Лю Ю., Ван, Х., Ду, Н., Шен, Э., Чен, Х., Ниу, Дж. И др. (2009). Молекулярные доказательства распространения двух основных метициллин-устойчивых клонов Staphylococcus aureus с уникальным географическим распределением в больницах Китая. Антимикробный. Агенты Chemother. 53, 512–518. DOI: 10.1128 / AAC.00804-08
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Maiden, M.C., Bygraves, J.A., Feil, E., Morelli, G., Russell, J.E., Urwin, R., et al. (1998). Мультилокусное типирование последовательностей: портативный подход к идентификации клонов в популяциях патогенных микроорганизмов. Proc. Natl. Акад. Sci. США 95, 3140–3145. DOI: 10.1073 / pnas.95.6.3140
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Мемпель, М., Schmidt, T., Weidinger, S., Schnopp, C., Foster, T., Ring, J., et al. (1998). Роль поверхностно-ассоциированных белков Staphylococcus aureus в прикреплении к культивированным кератиноцитам HaCaT в новом анализе адгезии. J. Invest. Дерматол. 111, 452–456. DOI: 10.1046 / j.1523-1747.1998.00293.x
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Мутукришнан, Г., Куинн, Г. А., Ламерс, Р. П., Диаз, К., Коул, А. Л., Чен, С. и др. (2011). Экзопротеом Staphylococcus aureus показывает предполагаемые факторы носительства. J. Proteome Res. 10, 2064–2078. DOI: 10.1021 / pr200029r
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Накане А., Окамото М., Асано М., Коханава М. и Минагава Т. (1995). Эндогенный гамма-интерферон, фактор некроза опухоли и интерлейкин-6 при инфекции Staphylococcus aureus у мышей. Заражение. Иммун. 63, 1165–1172.
PubMed Аннотация | Google Scholar
Натвани Д., Морган М., Мастертон Р.Г., Драйден М., Куксон Б. Д., Френч Г. и др. (2008). Рабочая группа Британского общества антимикробной химиотерапии по руководящим принципам ИМ с началом в сообществе для практики Великобритании по диагностике и лечению метициллин-резистентных инфекций Staphylococcus aureus (MRSA), присутствующих в сообществе. J. Antimicrob. Chemother. 61, 976–994. DOI: 10.1093 / jac / dkn096
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Палмквист, Н., Фостер, Т., Тарковски, А., и Йозефссон, Э. (2002). Белок А является фактором вирулентности золотистого стафилококка артрита и септической смерти. Microb. Патог. 33, 239–249. DOI: 10.1006 / mpat.2002.0533
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Паули, Н. Т., Ким, Х. К., Фалуги, Ф., Хуанг, М., Дулак, Дж., Генри Дананд, К. и др. (2014). Staphylococcus aureus вызывает у людей опосредованное белком А иммунное уклонение. J. Exp. Med. 211, 2331–2339.DOI: 10.1084 / jem.20141404
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Петерсон П. К., Верхоф Дж., Сабат Л. Д. и Куи П. Г. (1977). Влияние протеина А на опсонизацию стафилококков. Заражение. Иммун. 15, 760–764.
PubMed Аннотация | Google Scholar
Поцци, К., Лофано, Г., Манчини, Ф., Солдаини, Э., Специя, П., Де Грегорио, Э. и др. (2015). Подмножества фагоцитов и клональная делеция лимфоцитов, лежащая в основе неэффективного иммунного ответа на Staphylococcus aureus . FEMS Microbiol. Ред. 39, 750–763. DOI: 10.1093 / femsre / fuv024
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Queck, S.Y., Khan, B.A., Wang, R., Bach, T.H., Kretschmer, D., Chen, L., et al. (2009). Цитолизин, кодируемый мобильными генетическими элементами, связывает вирулентность с устойчивостью к метициллину у MRSA. PLoS Pathog. 5: e1000533. DOI: 10.1371 / journal.ppat.1000533
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Рудкин, Ю.К., Эдвардс, А. М., Боуден, М. Г., Браун, Э. Л., Поцци, К., Уотерс, Э. М. и др. (2012). Устойчивость к метициллину снижает вирулентность связанного со здравоохранением метициллин-устойчивого Staphylococcus aureus , вмешиваясь в систему распознавания кворума агр. J. Infect. Дис. 205, 798–806. DOI: 10.1093 / infdis / jir845
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Speziale, P., Pietrocola, G., Rindi, S., Provenzano, M., Provenza, G., Di Poto, A., и другие. (2009). Структурная и функциональная роль поверхностных компонентов Staphylococcus aureus , распознающих молекулы адгезивного матрикса хозяина. Future Microbiol. 4, 1337–1352. DOI: 10.2217 / fmb.09.102
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Тхаммавонгса В., Ким Х. К., Миссиакас Д. и Шнеуинд О. (2015). Стафилококковые манипуляции с иммунными ответами хозяина. Nat. Rev. Microbiol. 13, 529–543. DOI: 10.1038 / nrmicro3521
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
ван Белкум, А., Melles, D. C., Peeters, J. K., van Leeuwen, W. B., van Duijkeren, E., Huijsdens, X. W., et al. (2008). Метициллин-устойчивый и чувствительный к Staphylococcus aureus тип последовательности 398 у свиней и людей. Emerging Infect. Дис. 14, 479–483. DOI: 10.3201 / eid1403.070760
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Wang, D., Wang, Z., Yan, Z., Wu, J., Ali, T., Li, J., et al. (2015). Мастит крупного рогатого скота Staphylococcus aureus : профиль чувствительности к антибиотикам, гены устойчивости и молекулярное типирование метициллин-устойчивых и метициллин-чувствительных штаммов в Китае. Заражение. Genet. Evol. 31, 9–16. DOI: 10.1016 / j.meegid.2014.12.039
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Weidenmaier, C., Kokai-Kun, J.F., Kristian, S.A., Chanturiya, T., Kalbacher, H., Gross, M., et al. (2004). Роль тейхоевой кислоты в Staphylococcus aureus носовой колонизации, главном факторе риска внутрибольничных инфекций. Nat. Med. 10, 243–245. DOI: 10,1038 / нм991
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Вертхайм, Х.F., Vos, M.C., Ott, A., van Belkum, A., Voss, A., Kluytmans, J.A., et al. (2004). Риск и исход нозокомиальной бактериемии Staphylococcus aureus у носителей через нос по сравнению с лицами, не являющимися носителями. Ланцет 364, 703–705. DOI: 10.1016 / S0140-6736 (04) 16897-9
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Wertheim, H.F., Walsh, E., Choudhurry, R., Melles, D.C., Boelens, H.A., Miajlovic, H., et al. (2008). Ключевая роль фактора слипания B в Staphylococcus aureus носовой колонизации человека. PLoS Med. 5: e17. DOI: 10.1371 / journal.pmed.0050017
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Сяо, М., Ван, Х., Чжао, Ю., Мао, Л. Л., Браун, М., Ю, Ю. С. и др. (2013). Национальный эпиднадзор за устойчивым к метициллину Staphylococcus aureus в Китае подчеркивает все еще развивающуюся эпидемиологию с 15 новыми появляющимися мультилокусными типами последовательностей. J. Clin. Microbiol. 51, 3638–3644. DOI: 10.1128 / JCM.01375-13
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Сяо, Ю.Х., Гиске, К. Г., Вэй, З. К., Шен, П., Хеддини, А., и Ли, Л. Дж. (2011). Эпидемиология и характеристика устойчивости к противомикробным препаратам в Китае. Drug Resist. Updat. 14, 236–250. DOI: 10.1016 / j.drup.2011.07.001
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Zhao, C., Liu, Y., Zhao, M., Liu, Y., Yu, Y., Chen, H., et al. (2012). Характеристика приобретенного сообщества Staphylococcus aureus , связанного с инфекцией кожи и мягких тканей в Пекине: высокая распространенность PVL + ST398. PLoS ONE 7: e38577. DOI: 10.1371 / journal.pone.0038577
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Все индивидуальные домены стафилококкового белка А обнаруживают связывание Fab | Возбудители и болезни
430″ data-legacy-id=»ss1″> 1 Введение
Стафилококковый протеин A (SPA) широко используется в качестве иммунологического инструмента и как механизм сродства для производства рекомбинантных белков посредством его связывания с иммуноглобулинами [1–4]. Фактически, взаимодействие SPA и иммуноглобулинов является одним из наиболее изученных межбелковых взаимодействий. SPA содержит пять гомологичных доменов, демонстрирующих сильное сродство к Fc-области человеческого иммуноглобулина G, «классическое» взаимодействие протеина A [5].Однако также было показано, что SPA связывается с определенными фрагментами Fab в «альтернативном» взаимодействии [6,7]. На сегодняшний день были предприняты ограниченные усилия по анализу относительной силы связывания пяти отдельных гомологичных SPA-доменов с Fab и Fc, соответственно. Было указано, что не все домены участвуют во взаимодействии Fab [8]. Недавно было продемонстрировано, что домен D связывается с Fab, но другие индивидуальные домены не были включены в исследование [9].
Настоящее исследование было предпринято для индивидуального изучения каждого из пяти отдельных доменов SPA на предмет их взаимодействия с человеческим Fab.Домен Z, широко используемый моновалентный аналог SPA на основе домена B [10], также был включен в исследование. Домены были индивидуально продуцированы в Escherichia coli , фланкированы партнером слияния по аффинности связывания сывороточного альбумина и уникальным остатком цистеина, соответственно, что облегчает их очистку с помощью аффинности HSA и иммобилизацию для анализа связывания. Эксперименты по связыванию были выполнены с использованием анализа биоспецифического взаимодействия с поддержкой поверхностного плазмонного резонанса (BIA), который дает быстрые измерения связывания в реальном времени [11].В ходе исследования были проанализированы и сопоставлены взаимодействия между отдельными производными SPA доменами и рекомбинантными фрагментами Fc человека, одноцепочечным фрагментом Fv (scFv) и поликлональным F (ab ‘) человека ₂.
434″ data-legacy-id=»ss2-1″> 2.1 Методы рекомбинантной ДНК
Соблюдали общие методы рекомбинантной ДНК [12], если не указано иное. Трансформации выполняли либо как электропорацию с использованием Gene Pulser (Bio-Rad), либо для замораживания компетентных бактерий.Плазмидную ДНК очищали с использованием колонок QIA20 или QIA100 и соответствующих буферов от Diagen (Германия).
441″ data-legacy-id=»ss2-3″> 2.3 Построение вектора
Векторы для экспрессии фрагментов SPA, слитых с альбуминовой связывающей областью SPG, собирали в два этапа. Сначала была сконструирована плазмида pBJ100, и этот вектор использовали для клонирования различных доменов SPA. Плазмиду pB2T [15] использовали в качестве матрицы в ПЦР-амплификации с праймерами LAMA17 и LAMA18 (таблица 1).Полученный продукт ПЦР, кодирующий моновалентную область связывания сывороточного альбумина SPG, очищали с использованием фильтров Millipore Ultrafree NMWL 30,000. Продукт ПЦР расщепляли эндонуклеазами рестрикции Nhe I и Kpn I, и полученный фрагмент длиной 160 п.н. лигировали с фрагментом вектора из pT7-ABP [16], рестриктированного Nhe I и Kpn I. Смесь для лигирования трансформировали в E. coli RRIΔM15 [17] с помощью электропорации. Очищенную плазмидную ДНК из полученных трансформантов получали и анализировали с использованием рестрикционных ферментов для выделения правильного pBJ100 (рис.1).
фрагментов ПЦР, кодирующих различные домены SPA, затем вставляли в вектор pBJ100 с использованием сайтов Kpn I и Hin dIII. После трансформации в E. coli RRI M15 [17] плазмидную ДНК из полученных трансформантов получали и анализировали с помощью расщепления рестрикционными ферментами перед твердофазным секвенированием ДНК положительных клонов [18,19]. Полученные экспрессионные векторы были обозначены pBJ100E, pBJ100D, pBJ100A, pBJ100B, pBJ100C и pBJ100Z соответственно.
446″ data-legacy-id=»ss2-5″> 2,5 Экспрессия и очистка фрагментов антител
Одноцепочечный Fv-фрагмент белка р53 человека (клон № 30) [21] был экспрессирован из плазмидной конструкции на основе вектора pHEN1 [22]. Экспрессированная конструкция scFv содержит цепь V _H 3 зародышевой линии DP-53 [21, 23], связанную с цепью V _L через спейсер (GGGGS) ₃, за которой следует C-конец c-. последовательность тегов myc [21,22].Конструкция scFv, которая секретируется с использованием сигнального пептида PelB, экспрессировалась в E. coli HB2151 [24], как описано ранее [22]. Вкратце, 400 мл 2 × YT с 0,1% глюкозы и ампициллина (100 мг / л ^-1) инокулировали из замороженного глицеринового раствора и встряхивали при 30 ° C до тех пор, пока OD _{600 нм} не достигала 0,6 и бактерии не размножались. осаждают центрифугированием. Осадок ресуспендировали в 350 мл свежего 2 × YT, содержащего ампициллин (100 мг / л ^-1) и IPTG (0.8 мМ). Колбу с перегородкой встряхивали при 30 ° C в течение 13 ч, после чего клетки удаляли центрифугированием и прозрачную среду фильтровали через фильтр 0,45 мкм. Фильтрат очищали на колонке с протеином AG-сефарозой. Аффинную колонку промывали 20 объемами колонки 1 × TST и уравновешивали 5 мМ ацетатом аммония (pH 5) перед элюированием 0,5 М уксусной кислотой, pH 2,8. Элюированные фракции лиофилизировали, и чистоту контролировали с помощью SDS-PAGE. Выход scFv-фрагмента после очистки составлял приблизительно 2.6 мг на литр питательной среды. Колонку с белком AG-сефарозой изготавливали из CNBr-активированной сефарозы 4B (Pharmacia Biotech) в соответствии с протоколом производителя. Рекомбинантный белок AG представляет собой слияние иммуноглобулин-связывающих доменов из SPA и SPG, описанных ранее [25].
Константные области IgG1 и 3 человека (Fc1 * и Fc3) были экспрессированы в штамме E. coli KS476 [26] из плазмид pEFc1 * и pEFc3, соответственно, производных pEZZ18 [27] с кодировкой ZZ фрагмент заменен фрагментами, кодирующими белки Fc1 * или Fc3.Fc1 * функционально эквивалентен Fc1 с точки зрения связывания SPA, но содержит шарнир и каркас Fc3. Два аминокислотных остатка, критические для отсутствия связывания SPA в Fc3, были мутированы на соответствующие остатки из Fc1 (R466H, F467Y), давая Fc1 * (нумерация согласно [28]). Связывание SPA с Fc1 * ранее использовалось в анализах связывания [29], но более подробное описание конструкции и характеристики Fc1 * представлено в другом месте [30].
E.Клетки coli KS476, содержащие плазмиды pEFc1 * и pEFc3, соответственно, инокулировали из чашек с агаром в 500 мл TSB с добавлением дрожжевого экстракта (5 г на 100141 -1 ) и ампициллина (200 мг на 100141 -1 ). Колбы встряхивали при 30 ° C в течение 40–45 ч, после чего клетки осаждали центрифугированием и подвергали осмотическому шоку. Вкратце, осадок ресуспендировали в пятой части исходного объема раствора сахарозы (20% (мас. / Об.) Сахарозы, 0,3 М трис-HCl pH 8,0, 1 мМ ЭДТА) и выдерживали на льду в течение 20 мин, осаждали центрифугированием после который был добавлен в равном объеме воды.После 5 мин инкубации при 0 ° C раствор центрифугировали при 16 000 × g в течение 15 мин. Супернатант фильтровали через фильтр 0,45 мкм перед тем, как пропустить через колонку с белком G-сефарозой 4 FF (Pharmacia Biotech). После связывания образца колонку промывали 20 объемами 1 × TST, уравновешенными 5 мМ ацетатом аммония (pH 6,0). Элюирование проводили 0,5 М уксусной кислотой, pH 2,8, и фракции пика затем лиофилизировали. Выходы после очистки соответствовали примерно 8 мг на литр культуры для каждого фрагмента Fc.Лиофилизированные белковые пулы затем ресуспендировали в 6 M гидрохлорид гуанидиния / HBS или 6 M GuHCl / 50 мМ ацетат аммония и подвергали диализу против HBS или 50 мМ ацетата аммония, соответственно, с использованием мембран Spectra / Por с отсечкой по молекулярной массе 6-8. кДа.
452″ data-legacy-id=»ss2-7″> 2.7 Определение концентрации белка
Предварительные измерения концентрации белка были выполнены спектрофотометрически при 280 нм.Точные измерения концентраций аналита для экспериментов BIAcore были выполнены с помощью аминокислотного анализа с использованием анализатора аминокислот Beckman 6300. Гидролиз проводили в 6 M HCl при 155 ° C в течение 45 мин, после чего образец анализировали на ионообменной колонке и отдельные аминокислоты определялись нингидрином.
455″ data-legacy-id=»ss3-1″> 3.1 Дизайн, экспрессия и очистка белков
Гены, кодирующие домены E, D, A, B и C SPA и аналог Z домена B, были отдельно выделены с помощью ПЦР из плазмидных матриц с использованием олигонуклеотидных праймеров, вводящих сайты рестрикции эндонуклеаз для дальнейшего клонирования (рис.1). Индивидуальные домены были продуцированы в E. coli в виде C-концевых слияний с 5 кДа сывороточным альбуминсвязывающим доменом (ABD), полученным из стрептококкового белка G [20,31]. Кроме того, чтобы сделать возможной направленную иммобилизацию различных белков для исследований связывания, кодон для уникального остатка цистеина был сконструирован на С-концах различных белков. Эта стратегия позволила очистить слитые белки с помощью HSA-аффинной хроматографии без использования их активности связывания IgG (фиг.1 и 2Б). Таким образом, избегали любого загрязнения IgG, которое могло возникнуть в результате использования IgG-аффинной хроматографии. Выходы различных гибридных белков после HSA-аффинной хроматографии находились в диапазоне 6–30 мг на ^–1 культуры. Анализ с помощью SDS-PAGE показал, что очищенные белки были полной длины и что примерно половина материала образовывала димеры с дисульфидными мостиковыми связями в невосстанавливающих условиях (данные не показаны).
Рисунок 2
A: Выравнивание аминокислотных последовательностей пяти природных SPA-доменов и синтетического аналога Z [10].Полная последовательность для домена B записана, и прочерк (-) означает, что аминокислотный остаток идентичен остатку в B. Три a-спирали [43] заключены в рамку. Домены B, C, A и Z состоят из 58 аминокислотных остатков каждый, домена E из 56 остатков и домена D из 61 остатка. Нумерация соответствует Нильссону и соавторам [10]. B: Полная аминокислотная последовательность слитого белка между связывающим альбумин доменом стрептококкового белка G и доменом B SPA. Обратите внимание на С-концевое удлинение, содержащее остаток цистеина.Все последовательности даны однобуквенным кодом.
Рисунок 2
A: Выравнивание аминокислотных последовательностей пяти природных SPA-доменов и синтетического аналога Z [10]. Полная последовательность для домена B записана, и прочерк (-) означает, что аминокислотный остаток идентичен остатку в B. Три a-спирали [43] заключены в рамку. Домены B, C, A и Z состоят из 58 аминокислотных остатков каждый, домена E из 56 остатков и домена D из 61 остатка. Нумерация соответствует Нильссону и соавторам [10].B: Полная аминокислотная последовательность слитого белка между связывающим альбумин доменом стрептококкового белка G и доменом B SPA. Обратите внимание на С-концевое удлинение, содержащее остаток цистеина. Все последовательности даны однобуквенным кодом.
460″ data-legacy-id=»ss3-3″> 3.3 Относительное связывание SPA-доменов с Fc, поликлональным F (ab ‘) 2 и scFv
Чтобы получить ранжирование относительной силы связывания отдельных производных SPA доменов с рекомбинантным фрагментом Fc человеческого IgG1 (Fc1 *), поликлональными фрагментами иммуноглобулина F (ab ‘) ₂ и scFv, иммобилизованные слитые белки подвергали воздействию однократные инъекции соответствующих аналитов в высокой концентрации и ответы записываются. Чтобы иметь возможность сравнивать данные, ответы были нормализованы в отношении способности различных иммобилизованных лигандов связывать HSA, введенный в одной концентрации, 1200 нМ («внутренний стандарт»).Таким образом, любые различия в изменении пропорций функционально иммобилизованных лигандов были компенсированы. Все SPA-домены, включая домен Z, показали сопоставимое связывание с фрагментом Fc1 *, подтверждая правильную укладку SPA-производных частей слитых белков (фиг. 3A). Чтобы убедиться, что наблюдаемое связывание было специфическим, было проанализировано связывание с рекомбинантным человеческим Fc3. Как и ожидалось, ни один из доменов не показал связывания с фрагментом Fc3 (данные не показаны).
Рисунок 3
Диаграммы, показывающие относительное связывание различных аналитов (отдельные концентрации) с иммобилизованными гибридными белками, содержащими указанные SPA-домены.Для каждого взаимодействия полученный ответ был нормализован относительно способности иммобилизованного лиганда связывать HSA, введенный в одной концентрации. Введенные аналиты представляли собой: (A) Fc1 *, (B) человеческий поликлональный F (ab ‘) ₂ и (C) scFv. Подробности см. В тексте.
Рисунок 3
Диаграммы, показывающие относительное связывание различных аналитов (отдельные концентрации) с иммобилизованными гибридными белками, содержащими указанные SPA-домены. Для каждого взаимодействия полученный ответ нормализовали относительно способности иммобилизованного лиганда связывать HSA, введенный в одной концентрации.Введенные аналиты представляли собой: (A) Fc1 *, (B) человеческий поликлональный F (ab ‘) ₂ и (C) scFv. Подробности см. В тексте.
Интересно, что инъекции человеческого поликлонального F (ab ‘) ₂ аналита через различные иммобилизованные лиганды показали, что все пять нативных SPA-доменов способны связываться также с Fab (фиг. 3B). Напротив, Fc1 * -связывающий домен Z, содержащий единственную замену глицина на аланин по сравнению с доменом B, показал значительно более низкое связывание F (ab ‘) ₂ (рис.3Б). Наложенный график полученных сенсограмм подчеркивает разницу в связывании с поликлональным аналитом F (ab ‘) ₂ для тесно связанных доменов B и Z (фиг. 4A). Этот анализ показал, что из пяти природных SPA-доменов B и C наиболее прочно связываются с аналитом F (ab ‘) ₂. Поскольку фактическая концентрация SPA-связывающих фрагментов F (ab ‘) ₂ в поликлональном препарате неизвестна, константы сродства для взаимодействий не могут быть определены.
Рисунок 4
Наложенный график сенсограмм, полученных при инъекции 2600 нМ поликлонального F (ab ‘) человека ₂ на поверхность BIAcore с иммобилизованными гибридными белками, содержащими домены B и Z, соответственно.
Рисунок 4
Наложенный график сенсограмм, полученных при инъекции 2600 нМ поликлонального F (ab ‘) человека ₂ на поверхность BIAcore с иммобилизованными гибридными белками, содержащими домены B и Z, соответственно.
Кроме того, были проведены эксперименты по связыванию, в которых поликлональный препарат F (ab ‘) ₂ был заменен рекомбинантным моноклональным белком scFv, содержащим последовательность V _H, принадлежащую человеческому семейству V _H 3.Предыдущие исследования показали, что определенные фрагменты Fv, содержащие этот подкласс последовательностей V _H, связывают SPA и что домены C _H 1 или C _L не вносят вклад в связывание [32–34]. Анализ связывания с различными доменами с использованием инъекций одной концентрации этого фрагмента иммуноглобулина scFv показал, что все пять нативных SPA-доменов, но не домен Z, в значительной степени связывают аналит. Кроме того, аналогичное ранжирование доменов с точки зрения силы связывания наблюдали с использованием scFv или F (ab ‘) ₂, предполагая, что этот фрагмент scFv был функционально эквивалентен F (ab’) ₂ для этого сравнительного исследования. .Чтобы дополнительно охарактеризовать взаимодействия, последовательные разведения scFv-фрагмента пропускали через различные слитые белки с иммобилизованным SPA-доменом и отслеживали ответы. Из данных были определены как начальные, так и отрицательные скорости взаимодействий, что позволило рассчитать соответствующие кажущиеся константы сродства. Результаты, представленные в таблице 2, показывают, что домены E, B, A и C связывают scFv-фрагмент с несколько более высокое сродство, чем у домена D. Эти результаты коррелируют с результатами, полученными с использованием одной концентрации аналита (рис.3С). Для доменов E, A, B и C кажущиеся константы сродства имеют тот же порядок величины, что и для связывания между фрагментами Fc1 человека и моновалентным доменом SPA [35].
Таблица 2
Взаимодействие между гибридными белками и scFv («Fab»)

nd.
SPA-домен в лиганде Assoc. скорость конст. × 10 ⁻⁴ (M ⁻¹ с ⁻¹) Dissoc. постоянная скорости × 10 ³ (с ⁻¹) Константа сродства.× 10 ⁻⁶ (M ⁻¹)
E 1,7 1,7 9,6
D 0,43 1,7 1,5 1,1 14
B 0,82 0,69 12
C 0,91 1,1 8,6
нет данных нет данных
59 9,6 907
SPA-домен в лиганде Assoc. скорость конст. × 10 ⁻⁴ (M ⁻¹ с ⁻¹) Dissoc. постоянная скорости × 10 ³ (с ⁻¹) Константа сродства × 10 ⁻⁶ (M ⁻¹)
E 1,7 1,7
D 0,43 1.7 2,6
A 1,5 1,1 14
B 0,82 0,69 12
0,9 C 9075 Z nd нет данных нет данных
Таблица 2
Взаимодействие между гибридными белками и scFv («Fab»)
59 9,6 90
SPA-домен в лиганде Assoc.скорость конст. × 10 ⁻⁴ (M ⁻¹ с ⁻¹) Dissoc. постоянная скорости × 10 ³ (с ⁻¹) Константа сродства × 10 ⁻⁶ (M ⁻¹)
E 1,7 1,7
D 0,43 1,7 2,6
A 1,5 1,1 14
B 0.82 0,69 12
C 0,91 1,1 8,6
Z н.о. нет данных нет данных
SPA-домен в лиганде Assoc. скорость конст. × 10 ⁻⁴ (M ⁻¹ с ⁻¹) Dissoc. постоянная скорости × 10 ³ (с ⁻¹) Константа сродства × 10 ⁻⁶ (M ⁻¹)
E 1.7 1,7 9,6
D 0,43 1,7 2,6
A 1,5 1,1 14
C 0,91 1,1 8,6
Z nd нет данных нет данных
474″> Благодарности
Авторы выражают благодарность Ahuva Nissim (MRC, Кембридж, Великобритания) за любезный подарок вектора, экспрессирующего антитело scFv против p53.Кроме того, мы благодарим Петера Нильссона, Анну-Лену Андерссон, Элизабет Самуэльссон, Магнуса Ларссона, Йоакима Нильссона, Лену Йендеберг, Бьорна Нильссона и Стефана Столя за различный научный и технический опыт и ценные обсуждения. Особая благодарность Лене Андерссон из Pharmacia and Upjohn, Стокгольм, за аминокислотный анализ. B.J. был поддержан грантом программы иммунотехнологий, финансируемой Шведским национальным советом по промышленному и технологическому развитию.
ABD
альбумин-связывающий домен белка G
SPA
SPG
Заметки автора
© 1998 Федерация европейских микробиологических обществ.
Белок А | IBA Lifesciences
Продукт Содержание Кат. Номер Цена Заказ
Протеин А агароза 50% суспензия; 1 мл 1 мл 6-2010-001 40,00 евро
50% (об. / Об.) Суспензия агарозы с белком А разработана для очистки моноклональных и поликлональных антител с использованием аффинной хроматографии….
Дополнительная информация, руководства, спецификации, сопутствующие товары и многое другое
Протеин А агароза 50% суспензия; 3 мл 3 мл 6-2010-002 92,00 евро
50% (об. / Об.) Суспензия агарозы с белком А разработана для очистки моноклональных и поликлональных антител с использованием аффинной хроматографии….
Дополнительная информация, руководства, спецификации, сопутствующие товары и многое другое
Протеин А агароза 50% суспензия; 10 мл 10 мл 6-2010-005 236,00 евро
50% (об. / Об.) Суспензия агарозы с белком А разработана для очистки моноклональных и поликлональных антител с использованием аффинной хроматографии….
Дополнительная информация, руководства, спецификации, сопутствующие товары и многое другое
Протеин А агароза 50% суспензия; 50 мл 50 мл 6-2010-025 936,00 евро
50% (об. / Об.) Суспензия агарозы с белком А разработана для очистки моноклональных и поликлональных антител с использованием аффинной хроматографии….
Дополнительная информация, руководства, спецификации, сопутствующие товары и многое другое
Протеин А агароза 50% суспензия; 200 мл 200 мл 6-2010-100 2,996,00 евро
50% (об. / Об.) Суспензия агарозы с белком А разработана для очистки моноклональных и поликлональных антител с использованием аффинной хроматографии….
Дополнительная информация, руководства, спецификации, сопутствующие товары и многое другое
Колонка с агарозой, протеин А, гравитационный поток; 0,5 мл 6-2015-001 30,00 евро
Колонка Gravity Flow Protein A Agarose для очистки моноклональных и поликлональных антител с использованием аффинной хроматографии….
Дополнительная информация, руководства, спецификации, сопутствующие товары и многое другое
Картридж с белком А и агарозой 1 мл 6-2021-001 143,00 евро
Картридж Protein A Agarose для очистки моноклональных и поликлональных антител с помощью ВЭЖХ или FPLC …
Дополнительная информация, руководства, спецификации, сопутствующие товары и многое другое
Картридж с белком А и агарозой 5 мл 6-2022-001 565,00 евро
Картридж Protein A Agarose для очистки моноклональных и поликлональных антител с помощью ВЭЖХ или FPLC …
Дополнительная информация, руководства, спецификации, сопутствующие товары и многое другое
Структурная и динамическая модель сборки репликационного белка A на одноцепочечной ДНК
ДНК-конструкции
Вектор экспрессии гетеротримеров RPA был сконструирован с использованием синтезированных генов RFA1, RFA2 и RFA3 , оптимизированных по кодонам для экспрессии в Escherichia coli (GeneArt, Invitrogen).Rfa1 ( RFA1 ) клонировали в рамке считывания в MCS1 pRSF-Duet-1, чтобы получить расщепляемую TEV метку His ₆ в рамках службы синтеза генов (GeneArt). И Rfa2 ( RFA2 ), и Rfa3 ( RFA3 ) были клонированы в pMA после синтеза (GeneArt), и фрагмент ДНК, содержащий оба гена, был вырезан эндонуклеазами рестрикции NdeI и AvrII (NEB), очищен экстракцией из геля и лигирован с использованием Т4-лигаза (NEB) в предварительно расщепленную и очищенную pRSF-Duet-1- Rfa1 .Полученная плазмида содержала Rfa1 в MCS1 и Rfa2 / Rfa3 в MCS2. Конечная конструкция экспрессии была проверена перед использованием.
Для создания доменов RPA для исследований взаимодействий фрагменты ДНК, кодирующие остатки 178–294 из Rfa1 и 1–99 из Rfa3, были амплифицированы с использованием плазмиды экспрессии RPA (или мутантов) в качестве матрицы и мастер-микса высокоточной ДНК-полимеразы Phusion (NEB). ) в соответствии с инструкциями производителя. Используемые праймеры перечислены в дополнительной таблице 1. Фрагменты ДНК очищали и клонировали в вектор pOPINJ (любезный подарок от Ray Owens, плазмида Addgene 26045) с использованием фермента In-Fusion (Clonetech, Takara) в соответствии с инструкциями производителя и исх.⁴⁷. Последовательность в нижнем регистре в праймерах относится к гомологичной области, необходимой для клонирования In-Fusion в pOPINJ. Последовательность плазмид проверяли перед их использованием.
Мутагенез
Точечные мутанты DBD-A и DBD-E были получены с использованием направленного мутагенеза на основе обратной ПЦР с использованием основной смеси ДНК-полимеразы CloneAmp (Takara) и вектора экспрессии комплекса RPA в качестве матрицы. Используемые олигонульцеотиды перечислены в дополнительной таблице 1. Мутагенез был достигнут с помощью ПЦР с использованием смеси полимераз CloneAmp (Takara) и инструкций производителя при температуре отжига 55 ° C.Продукты обрабатывали DpnI (NEB) для удаления матрицы и очищали ДНК с помощью очистки ПЦР (GeneJet, Thermo) с последующим In-Fusion (Takara) перед трансформацией в химически компетентный NEB10-Beta E. coli (NEB). Клоны культивировали на агаре LB с добавлением канамицина (35 мг / л). ДНК из нескольких клонов очищали и проверяли секвенированием на предмет введения мутаций. Фосфомиметический мутант Rfa1 ^-S178D был получен с использованием сайт-направленного мутагенеза на основе ПЦР с использованием ДНК-полимеразы Pfu Turbo (Stratagene) и вектора экспрессии RPA в качестве матрицы.Используемые олигонульцеотиды перечислены в дополнительной таблице 1. ПЦР мутагенеза была достигнута с использованием 18 циклов при 95 ° C в течение 1 мин; 95 ° C в течение 50 с; 55 ° C в течение 50 с; 68 ° C, 9 мин, последний цикл с временем продления 7 мин. Продукты обрабатывали Dpn1 (NEB) для удаления родительской метилированной матрицы и проверяли электрофорезом в агарозном геле перед трансформацией в эффективность клонирования DH5α E. coli . Клоны культивировали на агаре LB с добавлением канамицина (35 мг / л). ДНК из нескольких клонов очищали и проверяли секвенированием на предмет введения мутации.
Одноцепочечные олигонуклеотиды поли-Т были приобретены у IDT в виде 5’6-FAM или 5’Cy5 dT ₁₀₀ или немодифицированного dT ₁₀₀, а также 5’Cy5-dT ₇.
Экспрессия и очистка RPA
Вектор экспрессии RPA (или его мутанты) трансформировали в BL21 (DE3) E. coli . Трансформанты отбирали с использованием канамицина, и одну колонию на литр использовали для инокуляции LB с добавлением канамицина (34 мг / л) и инкубировали в течение ночи при 37 ° C без встряхивания.После достижения OD _{600 нм} между 0,1 и 0,3 культуру встряхивали при 190 об / мин в течение нескольких часов до OD _{600 нм} 0,5–0,8. Экспрессию RPA индуцировали добавлением 0,3 мМ (конечный) IPTG при 37 ° C в течение 3 часов. Клетки собирали центрифугированием при 5000 × g и либо замораживали при -80 ° C до дальнейшего использования, либо ресуспендировали в буфере J0 (30 мМ HEPES pH 7,8, 0,5% myo -инозитол, 0,02% Tween-20 ) с добавлением 500 мМ NaCl и лизировали ультразвуком.Лизат осветляли высокоскоростным центрифугированием в течение 1 ч при 20000 × g . Осветленный лизат фильтровали с использованием шприцевого фильтра 0,45 мкм перед загрузкой на предварительно уравновешенную (с J0 с 500 мМ NaCl) колонку Ni-NTA. После того, как образец был загружен в NiNTA, колонку промывали 10 объемами колонки (CV) уравновешивающего буфера (J0, с добавлением 500 мМ NaCl), затем 10CV промывочного буфера (J0 с добавлением 750 мМ NaCl и 40 мМ имидазола. ) и, наконец, 10CV от J0.RPA элюировали элюирующим буфером (J0 с добавлением 250 мМ имидазола, pH 8,0). Фракции, содержащие RPA, объединяли и диализовали в течение ночи при 4 ° C в буфере J0. Диализованный раствор RPA дополнительно очищали анионообменом. Образец загружали в колонку HiTrap Q (GE healthcare), уравновешенную буфером J0, и промывали последовательно 1CV буфером J0, содержащим 50 мМ KCl, и 1CV J0 с добавлением 100 мМ KCl. Белок элюируют буфером J0, содержащим 400 мМ KCl. На этом этапе чистота RPA составила> 95% с помощью SDS-PAGE.Наконец, RPA полировали гель-фильтрацией (S200 16/60) в 20 мМ HEPES, pH 7,8, 1,5 М NaCl, 2 мМ DTT. Пиковые фракции, содержащие RPA, объединяли и концентрировали ультрафильтрацией вместе с заменой буфера, чтобы удалить высокую концентрацию NaCl, в результате чего получали концентрированный белок в 20 мМ HEPES, pH 7,8, 300 мМ NaCl, 1 мМ DTT и 0,5% глицерина. Присутствие контаминирующей эндогенной ДНК E.coli контролировали по коэффициенту поглощения между 260 нм / 280 нм, который составлял ~ 0,6 для очищенных белков RPA.Белок мгновенно замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° C до использования.
Экспрессия и очистка флуоресцентных вариантов RPA
Плазмида, экспрессирующая все три субъединицы RPA (любезный подарок доктора Марка С. Уолда, Университет штата Айова), была модифицирована для замены двух исходных стоп-кодонов Amber стоп-кодоном Охры. (TAA) с использованием сайт-направленного мутагенеза Q5 (EANP-scRPA-70-32-14). Для создания плазмиды для очистки RPA-Dbd-A ^4AZP, треонин 211 в RPA 70 был заменен стоп-кодоном TAG, и 6x полигистидиновая метка была включена в C-конец RPA 70 (EANP-scRPA-70 ^А-4АЗП-32-14).Аналогичным образом, для создания плазмиды для очистки RPA-Dbd-D ^4AZP, триптофан в положении 101 RPA32 был заменен стоп-кодоном TAG и 6x полигистидиновый тег был включен на C-конец RPA 32 (EANP-scRPA70 -32 ^4AZP-14). Серин в положении 178 RPA 70 был заменен аспарагиновой кислотой (S178D) с использованием сайт-направленного мутагенеза Q5. EANP-scRPA-70 ^A-4AZP-32-14 и EANP-scRPA70-32 ^4AZP-14 использовали в качестве матричных плазмид для создания RPA-S178D-DBD-A ^4AZP и RPA-S178D-DBD-D ^4AZP соответственно.
Соответствующая плазмида RPA (упомянутая выше) котрансформировалась с pDule2-pCNF в клетках BL21Ai. Все варианты RPA были экспрессированы и очищены почти до гомогенности с использованием аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом, анионного обмена с использованием колонок Q-сефарозы и гепарина, последовательно и, наконец, с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC) с использованием колонки Superdex S200 ⁴⁸. Все стадии хроматографии выполнялись при 4 ° C.
Мечение белков с помощью флуорофоров
вариантов RPA, несущих 4-AZP, были помечены Cy3 или Cy5 ^39,48.Приблизительно 3 мл RPA ^4-AZP (10 мкМ) инкубировали на качалке с 1,5-кратным молярным избытком (15 мкМ) либо DBCO-Cy3, либо DBCO-Cy5 в течение 2 часов при 4 ° C. Меченые варианты RPA отделяли от избытка красителя с использованием гель-фильтрационной колонки Biogel-P4 (объем слоя 65 мл) с использованием буфера для хранения (30 мМ HEPES, pH 7,8, 100 мМ KCl и 10% (об. / Об.) Глицерина). Фракции, содержащие меченый RPA, объединяли, концентрировали с использованием центрифуги для центрифугирования 30 кДа и мгновенно замораживали с использованием жидкого азота. Флуоресцентный RPA хранили при -80 ° C.Эффективность маркировки рассчитывалась с использованием значений поглощения, измеренных при 280 нм и ε ₂₈₀ = 98,500 M ⁻¹ см ⁻¹ для RPA, при 555 нм с ε ₅₅₅ = 150000 M ⁻¹ см ⁻¹ для DBCO-Cy3 и при 650 нм с ε ₆₅₀ = 250,000 M ⁻¹ см ⁻¹ для флуорофоров DBCO-Cy5.
Экспрессия и очистка DBD-A и DBD-E
И GST-DBD-A, и GST-DBD-E, и их мутанты экспрессировались в BL21 (DE3) E.coli . Вследствие конститутивной сверхэкспрессии этих конструкций в E. coli была собрана единственная колония трансформантов, инокулированная в литр LB с добавлением ампициллина (50 мг / л) и инкубированная при 37 ° C без встряхивания в течение ночи. На следующее утро культуры перемешивали со скоростью 180 об / мин до средне-логарифмической фазы (OD _{, 600 нм,} = 0,5–0,8), температуру снижали до 20–16 ° C и инкубировали в течение ночи при встряхивании. Клетки собирали центрифугированием при 5000 × g и замораживали при -80 ° C до дальнейшего использования.Клетки ресуспендировали в модифицированном трис-буферном физиологическом растворе (TBS; 50 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, 0,5 мМ TCEP, pH 7,4) и лизировали ультразвуком. Учитывая, что эти конструкции представляют собой 3C-расщепляемые слитые GST, белки очищали с использованием глютахион-сефарозы 4B (GE Healthcare) и стандартных процедур. После адсорбции слитых с GST белков домены высвобождали с использованием расщепления на колонке 3C в течение ночи при 4 ° C, а полученный элюент дополнительно очищали с помощью SEC при 4 ° C. Белок концентрировали и хранили в 20 мМ Трис, pH 7.4, 150 мМ NaCl, и его либо использовали немедленно, либо мгновенно замораживали в жидком азоте для хранения при -80 ° C.
Получение комплексов нуклеопротеидов RPA-ssDNA
Очищенный ScRPA смешивали с dT ₁₀₀, ресуспендировали в воде в молярном соотношении 5: 1 для RPA: ДНК и инкубировали на льду в течение 20 мин. Комплексы RPA-оцДНК очищали от свободного RPA с помощью SEC с использованием Superose 6 (10/30) в 20 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, 1 мМ TCEP, pH 7,4 при 4 ° C. Мы контролировали две длины волны, 260 и 280 нм, чтобы оценить содержание белка и ДНК в пиках элюирования.
SEC-MALS
Образцы белка SEC (в два раза превышающий объем петли, 200 мкл) вводили либо в колонку увеличения Superose 6 (10/30 GE Healthcare) для комплексов RPA-ssDNA, либо в Superdex S200 (10.30 GE Heathcare) для Apo-RPA, установленного в системе жидкостной хроматографии высокого давления (1260 Infinity; Agilent). Образцы белка были взяты из фракции центрального пика предыдущей препаративной гель-фильтрации и были разделены с использованием 20 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 150 мМ NaCl, 0,5 мМ TCEP при 25 ° C.Одновременно измерялись рассеяние света и показатель преломления в реальном времени (Helios-II, T-rEX; Wyatt). Для анализа данных использовался программный пакет Astra (Wyatt).
Подготовка сетки для электронной микроскопии
Сетки для сбора крио-ЭМ данных были приготовлены путем внесения 3 мкл свежеочищенного комплекса RPA-dT ₁₀₀ (концентрация ~ 0,5 мг / мл) в 20 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl , 1 мМ DTT, pH 7,4) на медные сетки Quantifoil R2 / 2 из тлеющего разряда из дырчатого углерода. Образцы застекловывали в жидком этане при температуре жидкого азота с использованием набора Vitrobot Mk IV (FEI) с временем ожидания 30 с и временем блоттинга 1 с.Погружное замораживание проводили при 4 ° C и 100% влажности.
Сбор данных CryoEM
Для комплексов RPA ^WT -dT ₁₀₀ набор из 1300 микрофотографий (набор данных 1), разделенных на 24 кадра, был получен в NeCEN (Лейден, Нидерланды) на микроскопе Titan Krios. Для комплексов RPA ^S178D -dT ₁₀₀ другой набор из 2700 микрофотографий (набор данных 2), разделенных на 41 кадр, был получен в eBIC (Оксфордшир, Великобритания) на Titan Krios.Для обоих наборов данных микроскопы работали при ускоряющем напряжении 300 кВ с образцом при криогенных температурах (приблизительно -180 ° C) с изображениями, записанными при недостаточной фокусировке 1–4 мкм на прямом электронном детекторе K2 Summit при номинальном увеличении ~ 130000, что дает размер пикселя 1,06 Å и совокупную полную дозу электронов 50 e ^— / Å ².
Обработка изображений CryoEM
Первоначально качество микрофотографий и их спектр мощности оценивали путем визуального осмотра.Любые изображения с ненормальным фоном, сильным загрязнением, толстым льдом или низкой контрастностью были отброшены. Отдельные кадры фильмов с хорошими микрофотографиями были выровнены и взвешены по дозе с использованием MotionCor2 ⁴⁹. Параметры CTF оценивались с помощью Gctf ⁵⁰ для суммированных микрофотографий, а качество изображений оценивалось визуальным осмотром суммированного изображения вместе со спектром мощности. Сбор частиц выполнялся с помощью Gautomatch с использованием средних значений классов, полученных из изображений отрицательных пятен, собранных в доме, или из более поздних 2D-классов из подмножества вручную выбранного набора данных о частицах.Последующая обработка изображений была выполнена в Relion 2.1 (ref. ⁵¹).
Реконструкции RPA
Хотя WT и S178D немного отличаются, область Tri-C согласована между этими наборами данных, и поэтому мы используем оба набора данных для восстановления структуры Tri-C RPA с высоким разрешением. Приблизительно 600 000 частиц были собраны с помощью Gautomatch из набора данных 1 (WT) и извлечены в блоки размером 160 × 160 пикселей. Изображения были дважды объединены и подвергнуты нескольким циклам двухмерной классификации, удаляя ненужные и зашумленные частицы после каждого цикла.Выбор лучших 2D-классов привел к набору из ~ 310 000 частиц, которые были дополнительно обработаны трехмерной классификацией на четыре класса с использованием ab initio модели, созданной в CryoSPARC ⁵² и отфильтрованной до 60 Å в качестве начальной модели. Частицы, дающие наиболее подробные классы, были объединены перед автоматическим 3D-уточнением. Частицы, которые использовались для окончательной очистки, повторно экстрагировали 120 × 120 коробок. Окончательная реконструкция была уточнена с использованием 180 723 частиц с разрешением 5.8 Å с использованием мягкой маски и постобработки в Relion. Для набора данных 2 (S178D) ~ 1,3 млн частиц было отобрано с помощью gautomatch с шаблонами, перепроецированными из предыдущей реконструкции. Частицы извлекались в ящики размером 120 × 1620 пикселей. Изображения были объединены дважды и подверглись раунду 2D-классификации, показавшей хорошие классы, аналогичные набору данных 1. После удаления мусора и шумных частиц после этого шага осталось ~ 1M частиц. Из-за большого количества частиц мы разделили файл particle.star на партии, содержащие ~ 110 тыс. Частиц в каждой, и подвергли их этапам 3D-классификации (четыре класса в партии), используя предыдущую модель (отфильтрованную до 15 Å) в качестве эталона. .Были выбраны 3D-классы с хорошими характеристиками, и файлы particle.star каждого хорошего 3D-класса были объединены в Relion, в результате чего получился окончательный набор из ~ 161K частиц. Мы уточнили этот набор данных и после постобработки достигли глобального разрешения 5,5 Å, которое показало спирали и узнаваемые особенности этого белка. Впоследствии мы объединили два набора данных вместе и выполнили глобальное уточнение с отфильтрованной маской с мягким краем. Это привело к окончательной реконструкции после постобработки в Relion с глобальным разрешением 4.7 Å, который имеет более четкие особенности вторичной структуры и случайную боковую цепь, ожидаемую при таком разрешении. Схема реконструкции и уточнения представлена на дополнительном рисунке 3. Глобальные оценки разрешения, а также локальное разрешение были рассчитаны в Relion с использованием золотого стандарта корреляционного критерия оболочки Фурье (FSC = 0,143) ⁵³.
Реконструкция димера RPA ^WT следовала той же стратегии обработки, что и Tri-C, и она кратко представлена на дополнительном рис.3. Вкратце, частицы собирали с помощью Gautomatch и извлекали в ящики размером 240 × 240 пикселей. Несколько раундов двухмерной и трехмерной классификаций дали единый набор частиц, который использовался для трехмерного уточнения. По аналогии с реконструкцией Tri-C в качестве начальной модели использовалась модель CryoSPARC ab initio, отфильтрованная до 60 Å. Один класс (класс 1), содержащий 32 583 частицы, был уточнен в Relion до разрешения 7,5 Å. Структурные особенности были улучшены с использованием алгоритма фильтрации локального соглашения для ЭМ-реконструкций передачи (https: // github.com / StructuralBiology-ICLMedicine — личное сообщение Кайлаша Рамлаула и Кристофера Х. С. Айлетта). Глобальные оценки разрешения были рассчитаны в EMAN с использованием золотого стандарта критерия корреляции Фурье-оболочки (FSC = 0,143) и оценок местного разрешения с использованием ResMap.
Построение модели
Карта S. cerevisiae RPA Tri-C 4,7 Å показала четкие элементы вторичной структуры и β-цилиндры OB-складок, что позволило однозначно подобрать твердотельные кристаллические структуры человека и грибов.Чтобы интерпретировать нашу плотность с помощью модели дрожжей, мы создали несколько моделей гомологии Rfa1 (DBD-A, DBD-B и DBD-C), Rfa2 (DBD-D) с использованием швейцарской модели или Phyre2 ⁵⁴. Модель гомологии Rfa3 (DBD-E) была получена с использованием сервера Rosetta ⁵⁵. Субъединицы кристаллической структуры человека (pdb 1L1O) были заменены на модели гомологии дрожжей путем суперпозиции. Олигонуклеотид poly-dT был взят из pdb 4GOP, дополнен дополнительными нуклеотидами в COOT и слит с моделями белковых субъединиц.Модель Tri-C с оцДНК была гибко подогнана к плотности с использованием MDFF ³³ с использованием NAMD и реализована в VMD. Для MDFF карта была преобразована в формат Situs с использованием IMAGIC ⁵⁶ и ограничений начальной структуры и вторичной структуры для NAMD, подготовленных с использованием VMD. Моделирование MDFF 50 пс было выполнено до того, как полученная структура с минимизированной энергией была дополнительно уточнена с использованием 150 циклов очистки Jelly-Body в Refmac5 ³⁴, реализованных в CCPEM ³⁵ и пяти циклов уточнения в реальном пространстве в Phenix ³⁶ наложения вторичных структурные ограничения.
Микромасштабный термофорез (MST)
Эксперименты MST проводили на приборе Monolith NT.115 (NanoTemper Technologies, Германия) при комнатной температуре. Буфер для связывания MST (20 мМ Трис, pH 7,5, 150 мМ NaCl, 0,5 мМ TCEP) использовали для всех экспериментов. Во всех случаях использовались капилляры премиум-класса, а эксперимент проводился при 25 ° C. Данные MST анализировались либо в программе NanoTemper Analysis 1.2.101, либо в GraphPad Prism. В любом случае данные были подогнаны к уравнению Хилла с ограничением коэффициента Хилла до 1, где ожидается связывание 1: 1.Каждый эксперимент технически повторяли не менее трех или более раз, и значения средней полуэффективной концентрации (EC ₅₀) рассчитывали со стандартной ошибкой (SE).
MST с оцДНК
В исследованиях взаимодействия RPA-оцДНК использовали синтетические ДНК-олигонуклеотиды, приобретенные у IDT, с 6-FAM или 5′-флуорофором Cy5. Флуоресцентно меченую ДНК в связывающем буфере разводили до концентрации 100 нМ и смешивали с равным объемом серии серийных разведений RPA или фосфомиметического мутанта RPA ^S178D и инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут перед загрузкой в MST. капилляры.Для связывания оцДНК с отдельными доменами DBD-A 100 нМ Cy5-меченного dT ₇, разведенного в MST-связывающем буфере, смешивали с равными объемами серии разведений DBD-A или DBD-A ^S178D, также в буфере привязки MST. Эксперименты по одиночному MST проводились с использованием 20–30% мощности светодиода и 80% мощности MST с временем ожидания 5 с, временем включения лазера 30 с и временем обратной диффузии 5 с.
MST взаимодействий DBD-A – DBD-E
Очищенный DBD-E или его мутанты метили по его свободным остаткам цистеина с помощью набора для мечения белков Monolith NT Blue-Cys NT-495 (NanoTemper) и очищали в соответствии с инструкции производителя.50 нМ меченого DBD-E в MST-связывающем буфере смешивали с равными объемами серии разведений DBD-A или DBD-A ^S178D, также в MST-связывающем буфере с добавлением 0,01% Tween-20 и 0,1 мг. / мл BSA, чтобы предотвратить неспецифическое связывание, и инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут перед загрузкой в капилляры MST. Эксперименты с одиночным MST проводились с использованием 80% мощности светодиода и 80% мощности MST с временем ожидания 5 с, временем включения лазера 15 с и временем обратной диффузии 5 с.
Анализ сдвига электрофоретической подвижности ДНК (EMSA)
Анализы связывания проводили в 20 мкл.50 нМ меченного 5’Cy5 dT ₁₀₀ в связывающем буфере (20 мМ Трис, pH 7,5, 150 мМ NaCl, 10 мМ MgCl ₂, 0,01% Твин-20) и добавляли к серийному разведению RPA ( диапазон концентраций белка 5,8 мкМ – 11 нМ). Также был приготовлен контроль без белка. Реакции связывания инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин перед смешиванием с 1 мкл загрузочного буфера бромфенолового синего. 5 мкл образцов загружали в неденатурирующий трис-боратный 5% полиакриламидный гель, предварительно прогон в течение 1 часа. Гели запускали в течение 90 мин при 100 В.ДНК визуализировали с использованием флуоресценции в геле с использованием системы визуализации геля ChemiDoc (Bio-Rad).
Анализ на основе FRET для удлинения ДНК RPA
Анализы на основе
FRET использовали для мониторинга эффекта связывания scRPA и scRPA ^S178D на конформации ДНК с использованием ранее описанных методов ⁵⁷. Для возбуждения Cy3 и наблюдения испускания Cy3 и Cy5 использовали флуориметр Cary Eclipse. Длину волны возбуждения Cy3 устанавливали равной 530 нм, а эмиссию измеряли при 565 нм. Возбуждение Cy5 было вызвано передачей энергии от Cy3, и его испускание измерялось при 660 нм.Ширина щелей возбуждения и испускания была установлена равной 10 нм. Эксперименты проводили в реакционном буфере (50 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 5 мМ MgCl, 100 мМ NaCl, 1 мМ DTT и 0,1 мг / мл БСА) при 25 ° C.
Влияние связывания RPA на конформацию ДНК тестировали путем измерения начального уровня FRET свободных FRET-меченных субстратов оцДНК и титрования возрастающих концентраций RPA. Меченные Cy3 / Cy5 олигонуклеотиды оцДНК были синтезированы IDT (Coralville, IA) и показаны в дополнительной таблице 1.5′-концевой краситель Cy5 присоединен к гидроксильной группе рибозы, а внутренние красители Cy3 и Cy5 включены в основную цепь между основаниями. К реакционному буферу добавляли 10 нМ каждого субстрата FRET и измеряли исходный FRET. Возрастающие концентрации scRPA и scRPA ^S178D титровали в реакцию и отслеживали FRET. Для каждого субстрата FRET уровни FRET начинаются выше, поскольку свободная ДНК образует компактную гибкую структуру в нашем реакционном буфере, сближая флуорофоры.По мере добавления scRPA или scRPA ^S178D FRET уменьшается по мере того, как флуорофоры удаляются друг от друга из-за удлинения ДНК. Данные для каждой точки представлены как среднее значение ± стандартное отклонение по крайней мере для трех независимых экспериментов. Данные FRET для связывания ScRPA с dT ₃₀ и dT ₉₀ (5–35) и dT ₉₀ (11–41) соответствовали двухсегментным линиям для определения стехиометрии связывания ( X ₀). ). Связывание ScRPA ^S178D с dT ₃₀ соответствовало уравнению квадратного связывания, в то время как взаимодействие между ScRPA и dT ₉₀ (1–30) анализировали с использованием уравнения Хилла и предположения, что существует три связывания. сайты на 90-членном олигонуклеотиде.Все анализы проводились с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 7.03. Результаты каждой подгонки представлены как значение ± ошибка подгонки.
FRET-анализ кооперативного связывания ДНК
Эксперименты с остановленным потоком проводили на приборе SX-2000 (Applied Photophysics, UK) и выполняли предварительным смешиванием 40 нМ RPA – DBD-A ^Cy3 и 40 нМ RPA – DDB-D ^Cy5 в одном шприце и быстро смешивая его с 40 нМ олигонуклеотидами оцДНК из другого шприца. Использовали олигонуклеотиды различной длины [(dT) _n; n = 20, 35, 45, 60, 70, 79, 97 или 140 нт].Cy3 возбуждали при 555 нм, и изменение испускания Cy5 отслеживали с помощью отсекающего фильтра 645 нм (Newport, CA). Данные о связывании ДНК для dT ₂₀ — dT ₉₇ были подобраны с использованием двухступенчатой модели (Kaleidagraph, Synergy Inc., США), а данные для dT ₁₄₀ были сопоставлены с одношаговой моделью ³⁹.
Краткое изложение отчета
Дополнительная информация о дизайне эксперимента доступна в Резюме отчета по исследованию природы, связанном с этой статьей.
| https://www.separations.eu.tosohbioscience.com

Аффинная хроматография с белком А
Хроматография с белком А основана на специфическом и обратимом связывании антител с иммобилизованным лигандом белка А. Белок A представляет собой поверхностный белок 56 кДа Staphylococcus aureus . Он состоит из пяти иммуноглобулин-связывающих доменов, каждый из которых способен связывать белки многих видов млекопитающих, в первую очередь иммуноглобулин G (IgG), через тяжелую цепь в области Fc.В то время как нативная форма протеина A использовалась в качестве лиганда для смол протеина A первого поколения, рекомбинантные формы (rProtein A), продуцируемые в E. coli, являются сегодня наиболее распространенными. Модификации белковой структуры лиганда, появление лигандов, состоящих из однодоменных мультимеров и многоточечного связывания, привели к появлению устойчивых к едким веществам, высокой емкости и чрезвычайно прочных смол на основе протеина А, используемых сегодня.
Применения
Смолы на основе протеина А являются наиболее часто используемыми аффинными смолами в биопроизводстве.Сегодня это стандартный метод улавливания рекомбинантных моноклональных антител. Хроматография протеина А — это очень надежная процедура очистки, которая используется в качестве стадии улавливания из-за ее специфичности. В зависимости от предполагаемого использования целевой молекулы (антитела для диагностического тестирования) улавливание белка А может быть единственным хроматографическим этапом, необходимым для достижения адекватной чистоты продукта.
Смолы TOYOPEARL Protein A
Tosoh Bioscience предлагает две аффинные смолы с протеином A, обе на основе устойчивых к щелочам рекомбинантных лигандов, связанных с проверенной полиметакрилатной матрицей TOYOPEARL.Оба лиганда представляют собой варианты рекомбинантного белка А, экспрессируемые в E. coli. Они происходят из одного из связывающих доменов IgG протеина A. Лиганд TOYOPEARL AF-rProtein A-650F состоит из тетрамера этого модифицированного домена. Для сверхвысокой емкости TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F этот домен был дополнительно оптимизирован и экспрессирован в виде гексамера для дальнейшего увеличения связывающей способности IgG. Многоточечное прикрепление лигандов к матрице TOYOPEARL повышает химическую и термическую стабильность смол.
Новый TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650M со сверхвысокой емкостью превосходит все другие коммерчески доступные среды с белком A в отношении его связывающей способности IgG, составляющей> 65 г IgG / л смолы.
No related posts.

Виды	Подтип антитела	Jacalin
Человеческий	Общий IgG1 IgG3 IgG3 IgG3 IgM IgD IgA1 IgA2 Fab scFv Каппа легкая цепь Лямбда легкая цепь	— — — — — — ++ +++ + +/- ? — —
Мышь	Общий IgG IgA	— —
Крыса	Общий IgG IgA	? —
Кролик	IgA	+
Коза	IgA	—
Овца	IgA	?
Морская свинка	IgA	—
Хомяк	IgA	?
Осел	IgA	?
Свинья	IgA	—
Собака	IgA	—
Кот	IgA	?
Курица	IgY	?
Cow	IgA	—
Horse	IgA	—

SPA-домен в лиганде	Assoc. скорость конст. × 10 ⁻⁴ (M ⁻¹ с ⁻¹)	Dissoc. постоянная скорости × 10 ³ (с ⁻¹)	Константа сродства.× 10 ⁻⁶ (M ⁻¹)
E	1,7	1,7	9,6
D	0,43	1,7		1,5	1,1	14
B	0,82	0,69	12
C	0,91	1,1	8,6
нет данных	нет данных

SPA-домен в лиганде	Assoc.скорость конст. × 10 ⁻⁴ (M ⁻¹ с ⁻¹)	Dissoc. постоянная скорости × 10 ³ (с ⁻¹)	Константа сродства × 10 ⁻⁶ (M ⁻¹)
E	1,7	1,7
D	0,43	1,7	2,6
A	1,5	1,1	14
B	0.82	0,69	12
C	0,91	1,1	8,6
Z	н.о.	нет данных	нет данных

Продукт	Содержание	Кат. Номер	Цена
Протеин А агароза 50% суспензия; 1 мл	1 мл	6-2010-001	40,00 евро
50% (об. / Об.) Суспензия агарозы с белком А разработана для очистки моноклональных и поликлональных антител с использованием аффинной хроматографии…. Дополнительная информация, руководства, спецификации, сопутствующие товары и многое другое
Протеин А агароза 50% суспензия; 3 мл	3 мл	6-2010-002	92,00 евро
50% (об. / Об.) Суспензия агарозы с белком А разработана для очистки моноклональных и поликлональных антител с использованием аффинной хроматографии…. Дополнительная информация, руководства, спецификации, сопутствующие товары и многое другое
Протеин А агароза 50% суспензия; 10 мл	10 мл	6-2010-005	236,00 евро
50% (об. / Об.) Суспензия агарозы с белком А разработана для очистки моноклональных и поликлональных антител с использованием аффинной хроматографии…. Дополнительная информация, руководства, спецификации, сопутствующие товары и многое другое
Протеин А агароза 50% суспензия; 50 мл	50 мл	6-2010-025	936,00 евро
50% (об. / Об.) Суспензия агарозы с белком А разработана для очистки моноклональных и поликлональных антител с использованием аффинной хроматографии…. Дополнительная информация, руководства, спецификации, сопутствующие товары и многое другое
Протеин А агароза 50% суспензия; 200 мл	200 мл	6-2010-100	2,996,00 евро
50% (об. / Об.) Суспензия агарозы с белком А разработана для очистки моноклональных и поликлональных антител с использованием аффинной хроматографии…. Дополнительная информация, руководства, спецификации, сопутствующие товары и многое другое
Колонка с агарозой, протеин А, гравитационный поток;	0,5 мл	6-2015-001	30,00 евро
Колонка Gravity Flow Protein A Agarose для очистки моноклональных и поликлональных антител с использованием аффинной хроматографии…. Дополнительная информация, руководства, спецификации, сопутствующие товары и многое другое
Картридж с белком А и агарозой	1 мл	6-2021-001	143,00 евро
Картридж Protein A Agarose для очистки моноклональных и поликлональных антител с помощью ВЭЖХ или FPLC … Дополнительная информация, руководства, спецификации, сопутствующие товары и многое другое
Картридж с белком А и агарозой	5 мл	6-2022-001	565,00 евро
Картридж Protein A Agarose для очистки моноклональных и поликлональных антител с помощью ВЭЖХ или FPLC … Дополнительная информация, руководства, спецификации, сопутствующие товары и многое другое