Глутамин инструкция: Глютаминовая кислота инструкция по применению: показания, противопоказания, побочное действие – описание Glutamic acid Таблетки, покрытые кишечнорастворимой оболочкой (20562)
| АЗАФЕН® | Таб. 25 мг: 14, 28, 30, 40, 42, 50, 56, 100, 200, 250 или 300 шт. рег. №: ЛС-000325 от 12.04.10Таб. с модифицированным высвоб. 150 мг: 28 или 30 шт. рег. №: ЛСР-000002 от 06.05.10 | |||
| Актапароксетин | Таб. Таб., покр. пленочной обол., 30 мг: 30 шт. рег. №: ЛСР-002868/08 от 18.04.08 | |||
| Алевал | Таб, покр. пленочной оболочкой, 25 мг: 14 и 28 шт. Таб, покр. пленочной оболочкой, 50 мг: 14 и 28 шт. рег. №: ЛСР-003615/10 от 30.04.10Таб, покр. пленочной оболочкой, 100 мг: 14 и 28 шт. рег. №: ЛСР-003615/10 от 30.04.10 | |||
| Алзолам | Таб. Таб. 500 мкг: 100 шт. рег. №: П N012954/01 от 13.08.08 | |||
| Амиксид | Таб. 12.5 мг+5 мг: 30 или 100 шт. рег. №: П N012912/01-2001 от 22.01.14Таб. Таб. 25 мг+5 мг: 30 или 100 шт. рег. №: П N012912/01-2001 от 22.01.14 | |||
| Амитриптилин-АЛСИ | Таб. 10 мг: 10, 20, 30, 40, 50 или 100 шт. рег. №: ЛС-001144
от 15.03.11
Дата перерегистрации: 08.02.19Таб. 25 мг: 10, 20, 30, 40, 50 или 100 шт. рег. №: ЛС-001144 от 15.03.11 Дата перерегистрации: 08.02.19 | |||
| Атаракс® | ||||
| Вальдоксан® | Таб. Таб., покр. пленочной оболочкой, 25 мг: 14, 28 или 98 шт. рег. №: ЛСР-000540/08 от 11.02.08 Дата перерегистрации: 27.03.18 | |||
| Велафакс МВ |  пролонгир. действия 75 мг: 30 шт. рег. №: ЛСР-007156/08
от 09.09.08Капс. пролонгир. действия 150 мг: 30 шт. рег. №: ЛСР-007156/08 от 09.09.08 | Произведено: CIPLA (Индия) | ||
| Велафакс® | Таб. Таб. 75 мг: 28 или 56 шт. рег. №: ЛС-000676 от 23.07.10 | |||
| Венлаксор® | Таб. 37.5 мг: 30 шт. рег. №: ЛСР-002525/07 от 31.08.07Таб. 75 мг: 30 шт. | |||
| Венлафаксин-АЛСИ | Таб. 37.5 мг: 10, 20, 30, 40 или 50 шт. рег. №: ЛП-002202 от 26.08.13 Дата перерегистрации: 14.02.19Таб. | |||
| Доппельгерц® Нервотоник | Эликсир рег. №: ЛС-001505 от 22.12.11 | |||
| Золофт® | Таб, покр. Таб, покр. пленочной оболочкой, 100 мг: 14 или 28 шт. рег. №: П N013622/01 от 18.07.08 Дата перерегистрации: 14.01.20 | |||
| Иксел | Капс. Капс. 50 мг: 28 или 56 шт. рег. №: П N011787/01 от 21.09.11 Дата перерегистрации: 24.12.19 | |||
| Интеллан | Капс.: 20 шт. рег. №: ЛП-000259 от 16.02.11 | |||
| Кислород газообразный медицинский | Газ сжатый: баллоны рег. №: ЛП-002368
от 12.02.14 | |||
| Клофранил | Таблетки, покрытые оболочкой рег. №: П N011779/01 от 06.12.07 | |||
| Комбитропил® | Капсулы рег. №: ЛСР-005209/08
от 03.07.08 | |||
| Ленуксин® | Таб., покр. пленочной оболочкой, 10 мг: 14 или 28 шт. рег. №: ЛП-001456 от 25.01.12 Дата перерегистрации: 12.07.19 | |||
| Леривон | Таблетки, покрытые пленочной оболочкой рег. №: П N013340/01
от 25.12.07 | |||
| Меларена® | Таб., покр. пленочной оболочкой, 0.3 мг: 30 шт. рег. №: ЛП-002831 от 21.01.15 Дата перерегистрации: 16.07.19Таб., покр. пленочной оболочкой, 3 мг: 10 или 30 шт. рег. №: ЛП-002831 от 21.01.15 Дата перерегистрации: 16. 07.19 | |||
| Мирацитол | Таб., покр. пленочной оболочкой, 10 мг: 28 шт. рег. №: ЛП-000392 от 25.02.11Таб., покр. пленочной оболочкой, 20 мг: 28 шт. рег. №: ЛП-000392 от 25.02.11 | |||
| Миртазонал | Таб. Таб., покр. пленочной оболочкой, 15 мг: 30 шт. рег. №: ЛСР-002281/08 от 01.04.08Таб. д/рассасывания 30 мг: 30 шт. рег. №: ЛСР-004851/10 от 28.05.10Таб., покр. пленочной оболочкой, 30 мг: 30 шт. рег. №: ЛСР-002281/08 от 01.04.08Таб. д/рассасывания 45 мг: 30 шт. рег. №: ЛСР-004851/10 от 28.05.10Таб., покр. пленочной оболочкой, 45 мг: 30 шт. рег. №: ЛСР-002281/08 от 01.04.08 | |||
| Мирталан | Таблетки, покрытые пленочной оболочкой рег. №: ЛСР-001052/10
от 16.02.10 | |||
| Ньювелонг | Таб. пролонгир. действия, покр. пленочной оболочкой, 75 мг: 30 шт. рег. №: ЛСР-006938/10 от 21.07.10Таб. пролонгир. действия, покр. пленочной оболочкой, 150 мг: 30 шт. рег. №: ЛСР-006938/10 от 21.07.10Таб. | |||
| Омарон® | Таблетки рег. №: ЛС-001014 от 30.05.11 Дата перерегистрации: 10.08.18 | |||
| Опра | Таб. Таб., покр. пленочной оболочкой, 40 мг: 10, 20 или 30 шт. рег. №: ЛС-000866 от 21.10.11 | |||
| Паксил® | Таб., покр. пленочной оболочкой, 20 мг: 10, 30 или 100 шт. рег. №: П N016238/01 от 02.04.10 Дата перерегистрации: 21.09. 16 | |||
| Пароксетин-СЗ | Таблетки, покрытые пленочной оболочкой рег. №: ЛП-006078 от 06.02.20 | |||
| Пиразидол® | Таб. Таб. 50 мг: 50 шт. рег. №: Р N001530/01 от 30.11.12 | |||
| Плизил | Таблетки, покрытые пленочной оболочкой рег. №: ЛС-002327 от 23.03.12 | |||
| Прам® | Таб., покр. пленочной оболочкой, 10 мг: 10 шт. рег. №: ЛС-001780 от 29.07.11Таб., покр. пленочной оболочкой, 20 мг: 10 шт. рег. №: ЛС-001780 от 29.07.11Таб., покр. пленочной оболочкой, 40 мг: 10 шт. рег. №: ЛС-001780 от 29.07.11 | Фасовка и упаковка: G.L.PHARMA (Австрия) | ||
| Профлузак® | Капсулы рег. №: Р N003957/01 от 05.02.10 | |||
| Рексетин® | Таб., покр. пленочной оболочкой, 20 мг: 30 шт. рег. №: П N015052/01 от 01.10.08 Дата перерегистрации: 22.10.20Таб., покр. пленочной оболочкой, 30 мг: 30 шт. рег. №: П N015052/01 от 01.10.08 Дата перерегистрации: 22.10.20 | |||
| Реланиум® | Раствор для в/в и в/м введения рег. №: П N015758/01 от 29.05.09 | |||
| Ремерон | Таб., покр. оболочкой, 15 мг: 10 или 30 шт. рег. №: П N016242/01 от 22.11.10Таб., покр. оболочкой, 30 мг: 10 или 30 шт. рег. №: П N016242/01 от 22.11.10Таб., покр. оболочкой, 45 мг: 10 или 30 шт. рег. №: П N016242/01 от 22.11.10 | Произведено: ORGANON (Нидерланды) | ||
| Рокона® | Таб., покр. пленочной оболочкой, 50 мг: 10, 15, 20, 30, 40, 45 или 60 шт. рег. №: ЛП-005047 от 19.09.18 Дата перерегистрации: 25.02.20Таб., покр. пленочной оболочкой, 100 мг: 10, 15, 20, 30, 40, 45 или 60 шт. рег. №: ЛП-005047 от 19.09.18 Дата перерегистрации: 25.02.20 | |||
| Серената | Таб, покр. пленочной оболочкой, 50 мг: 4, 30 или 50 шт. рег. №: ЛС-000063 от 05.02.10 Дата перерегистрации: 28.12.15Таб, покр. пленочной оболочкой, 100 мг: 4, 30 или 50 шт. рег. №: ЛС-000063 от 05.02.10 Дата перерегистрации: 28.12.15 | |||
| Стилиден | Капли для приема внутрь рег. №: ЛСР-000834/08 от 18.02.08 Дата перерегистрации: 15.01.19 | |||
| Сульпирид | Р-р д/приема внутрь 200 мг/5 мл: фл. 150 мл рег. №: ЛП-000913 от 18.10.11 | Продвижение на территории РФ: СВИЧ (Россия) | ||
| Тиодазин | Таб., покр. пленочной оболочкой, 10 мг: 100 шт. рег. №: П N014622/01 от 23.03.09 Дата перерегистрации: 24.08.10Таб., покр. пленочной оболочкой, 25 мг: 100 шт. рег. №: П N014622/01 от 23.03.09 Дата перерегистрации: 24.08.10Таб., покр. пленочной оболочкой, 50 мг: 100 шт. рег. №: П N014622/01 от 23.03.09 Дата перерегистрации: 24.08.10 | |||
| Тиорил | Таблетки, покрытые пленочной оболочкой рег. №: П N014762/01 от 11.12.08 | |||
| Фезанеф | Таблетки рег. №: Р N003954/01 от 05.03.10 | |||
| Фенобарбитал | Таб. 100 мг: 6, 10, 20 или 6000 шт. рег. №: ЛСР-002303/07 от 17.08.07 Дата перерегистрации: 18.09.17 | |||
| Фенорелаксан® | Таб. 1 мг: 50 шт. рег. №: Р N003285/01 от 28.05.09 Дата перерегистрации: 29.12.11Таб. 500 мкг: 50 шт. рег. №: Р N003285/01 от 28.05.09 Дата перерегистрации: 29.12.11 | |||
| Флуоксетин | Капс. 10 мг: 10, 20, 30, 40 или 50 шт. рег. №: ЛС-002375 от 02.12.11Капс. 20 мг: 10, 20, 30, 40 или 50 шт. рег. №: ЛС-002375 от 02.12.11 | |||
| Флюанксол | Р-р д/в/м введения (масляный) 100 мг/1 мл: амп. 1 или 10 шт. рег. №: П N012625/02 от 16.05.08 | |||
| Флюанксол | Р-р д/в/м введения (масляный) 20 мг/1 мл: амп. 10 шт. рег. №: П N012625/02 от 16.05.08 | |||
| Циталопрам | Таб., покр. пленочной оболочкой, 10 мг: 10, 20, 30, 40 или 50 шт. рег. №: ЛП-001955 от 25.12.12Таб., покр. пленочной оболочкой, 20 мг: 10, 20, 30, 40 или 50 шт. рег. №: ЛП-001955 от 25.12.12Таб., покр. пленочной оболочкой, 40 мг: 10, 20, 30, 40 или 50 шт. рег. №: ЛП-001955 от 25.12.12 | |||
| Цитол | Таб., покр. пленочной оболочкой, 20 мг: 28 шт. рег. №: ЛС-000428 от 24.02.11Таб., покр. пленочной оболочкой, 40 мг: 28 шт. рег. №: ЛС-000428 от 24.02.11 | |||
| Элзепам® | Таб. 0.5 мг: 10, 20 или 50 шт. рег. №: ЛП-000853 от 14.10.11Таб. 1 мг: 10, 20 или 50 шт. рег. №: ЛП-000853 от 14.10.11 | |||
| Эсциталопрам-АЛСИ | Таб., покр. пленочной оболочкой, 5 мг: 30 или 60 шт. рег. №: ЛП-003048 от 18.06.15 Дата перерегистрации: 14.02.19Таб., покр. пленочной оболочкой, 10 мг: 30 или 60 шт. рег. №: ЛП-003048 от 18.06.15 Дата перерегистрации: 14.02.19Таб., покр. пленочной оболочкой, 20 мг: 30 или 60 шт. рег. №: ЛП-003048 от 18.06.15 Дата перерегистрации: 14.02.19 | |||
| Эсциталопрам-СЗ | Таб., покр. пленочной оболочкой, 10 мг: 10, 14, 20, 28, 30 или 42 шт. рег. №: ЛП-005750 от 27.08.19Таб., покр. пленочной оболочкой, 20 мг: 10, 14, 20, 28, 30 или 42 шт. рег. №: ЛП-005750 от 27.08.19 | |||
| Эфевелон | Таб., покрытые оболочкой, 25 мг: 30 шт. рег. №: ЛС-001391 от 17.06.11Таб., покрытые оболочкой, 37.5 мг: 30 шт. рег. №: ЛС-001391 от 17.06.11Таб., покрытые оболочкой, 50 мг: 30 шт. рег. №: ЛС-001391 от 17.06.11Таб., покрытые оболочкой, 75 мг: 30 шт. рег. №: ЛС-001391 от 17.06.11 | |||
| Амитриптилин Зентива | Таб., покр. пленочной оболочкой, 25 мг: 50 шт. рег. №: П N016138/01 от 05.02.10 | |||
| Апаурин | Таб., покр. оболочкой, 2 мг: 30 шт. рег. №: П N012412/01 от 23.02.11 | |||
| Апаурин | Таб., покр. оболочкой, 5 мг: 30 шт. рег. №: П N012412/01 от 23.02.11 | |||
| Гелариум® Гиперикум | Драже рег. №: П N014575 от 11.10.11 Дата перерегистрации: 30.05.13 | |||
| Депрефолт® | Таб., покр. оболочкой, 100 мг: 10, 20 или 30 шт. рег. №: ЛС-001719 от 06.04.10 | |||
| Депрефолт® | Таб., покр. оболочкой, 50 мг: 10, 20 или 30 шт. рег. №: ЛС-001719 от 06.04.10 | |||
| Зверобой | Таблетки рег. №: П N012144/01 от 29.12.06 | |||
| Лайф 600 | Таблетки, покрытые пленочной оболочкой рег. №: ЛП-000407 от 28.02.11 | |||
| Неурол | Таб. 1 мг: 30 шт. рег. №: П N016221/01 от 13.05.05 | ZENTIVA (Чешская Республика) | ||
| Саротен Ретард | Капсулы пролонгированного действия рег. №: П N012120/01 от 08.04.09 | |||
| Флунисан | Таблетки рег. №: ЛСР-000283/10 от 25.01.10 | |||
| Циталорин | Таб., покр. оболочкой, 10 мг: 10 или 20 шт. рег. №: ЛС-000815 от 07.10.05 | |||
| Циталорин | Таб., покр. оболочкой, 20 мг: 10 или 20 шт. рег. №: ЛС-000815 от 07.10.05 | |||
| Эфевелон Ретард | Таб. пролонгир. действия, покр. пленочной обол., 150 мг: 30 шт. рег. №: ЛСР-003781/09 от 18.05.09 | |||
| Эфевелон Ретард | Таб. пролонгир. действия, покр. пленочной обол., 37.5 мг: 30 шт. рег. №: ЛСР-003781/09 от 18.05.09 | |||
| Эфевелон Ретард | Таб. пролонгир. действия, покр. пленочной обол., 75 мг: 30 шт. рег. №: ЛСР-003781/09 от 18.05.09 | |||
, покр. пленочной обол., 20 мг: 30 шт.
250 мкг: 100 шт.
, покр. пленочной оболочкой, 25 мг: 14, 28, 98 или 100 шт.
37.5 мг: 28 или 56 шт.
75 мг: 10, 20, 30, 40 или 50 шт.
пленочной оболочкой, 50 мг: 14 или 28 шт.
25 мг: 28 или 56 шт.
д/рассасывания 15 мг: 30 шт.
пролонгир. действия, покр. пленочной оболочкой, 225 мг: 30 шт.
, покр. пленочной оболочкой, 20 мг: 10, 20 или 30 шт.
25 мг: 50 шт.Изменилась инструкция по применению глутаминовой кислоты
Журнал / Новости / Изменилась инструкция по применению глутаминовой кислоты
Министерство здравоохранения обращается ко всем производителям препаратов с действующим веществом глутаминовая кислота с требованием привести в единый вид инструкции по применению. Соответствующее письмо опубликовано 30 августа в Государственном реестре лекарственных средств.
Глутаминовая кислота является производной аминокислоты и используется для терапии нарушений процессов метаболизма в клетках головного мозга. Примерами таких состояний могут служить эпилепсия, задержка в развитии, синдром Дауна, депрессия и др.
В разделе «Фармакотерапевтическая группа» необходимо указать, что вещество относится к аминокислотам и их производным. Кроме этого, следует изменить «Код АТХ» на «А16АА».
В разделе «Фармакологические свойства» нужно указать, что глутаминовая кислота участвует в синтезе белка и является нейромедиатором глутаминовых рецепторов. В раздел «Фармакокинетика» следует добавить информацию, что пресистемному метаболизму подвергается 95 % принимаемой внутрь глутаминовой кислоты. Как и прочие аминокислоты, она не накапливается и полностью включается в пул глутаминовой кислоты организма.
Раздел «Показания к применению» привести в редакцию: «Состояния, сопровождающиеся дефицитом глутаминовой кислоты».
Раздел «Противопоказания» необходимо изложить в следующем виде:
«Гиперчувствительность к компонентам препарата, лихорадочный синдром, печеночная и/или почечная недостаточность, язвенная болезнь желудка и 12‑перстной кишки, анемия, лейкопения, повышенная нервная возбудимость, острые психотические реакции, нефротический синдром, угнетение костномозгового кроветворения, ожирение, детский возраст до 18 лет».
Кроме того, отдельно следует указать противопоказания для вспомогательных веществ препарата.
В раздел «Применение при беременности» необходимо добавить информацию, что применение возможно по рекомендации врача, если ожидаемая польза превышает риск для плода и ребенка.
Раздел «Способ применения и дозы» следует изложить в следующей редакции:
«Взрослым: Внутрь за 15–30 мин. до еды по 1 г 2–3 раза в день. При развитии диспепсии — во время или после еды. Курс лечения устанавливается индивидуально».
В разделе «Взаимодействие с другими лекарственными средствами» необходимо указать, что фармакокинетическое и фармакодинамическое взаимодействие не установлено.
В «Особые указания» следует добавить информацию, что в период лечения необходимо регулярно проводить общеклинические анализы крови и мочи. При возникновении дозозависимых побочных реакций рекомендуется снизить дозу глутаминовой кислоты.
Раздел «Влияние на способность управлять транспортными средствами и механизмами» представить в редакции:
«Не изучалась».
Глютамин — инструкция, применение, аналоги препарата, состав, показания, противопоказания, побочные действия в справочнике лекарств от УНИАН
Применение L-Глютамина
L-Глютамин — состав и форма выпуска препарата
L-Глютамин: как принимать препарат
L-Глютамин — противопоказания, побочные эффекты
Аналоги L-Глютамина
Биологически активная добавка. L-Глютамин — аминокислота, которая необходима для улучшения умственных способностей, она стимулирует работу мозга, поддерживая обмен веществ, происходящий в нем. L-Глютамин повышает уровень гамма-аминомасляной кислоты, которая необходима для нормальной мозговой деятельности. L-Глютамин помогает активизировать умственную деятельность, концентрировать внимание, думать более ясно, улучшить память и настроение.
Применение L-Глютамина- улучшает функции мозга, умственную деятельность;
- способствует синтезу белков в организме, поддержанию мышечной массы;
- нормализует работу пищеварительной системы;
- укрепляет иммунную систему;
- обладает детоксицирующими свойствами;
- имеет антистрессовое действие.
Форма выпуска – капсулы.
Состав. 1 капсула содержит: L-Глютамин — 300,0 мг; витамины: В6 — 0,6 мг, В9 (фолиевая кислота) — 0,05 мг, В12 — 0,0007 мг, наполнители: кальция стеарат, МКЦ, лактоза, крахмал, сорбит.
L-Глютамин: как принимать препаратВзрослым и детям с 16 лет по 1 капсуле 3 раза в день во время еды. Курс приема 1 месяц. Курс можно повторять 3-4 раза в год.
Перед приемом рекомендуется проконсультироваться с врачом.
L-Глютамин— противопоказания, побочные эффектыПротивопоказания. Особая чувствительность к компонентам продукта.
Побочные эффекты. Аллергические реакции, тошнота, диарея, рвота, боль в животе, повышенная возбудимость. Если применять препарат длительное время, возможны проявления анемии, раздражений слизистой оболочки ротовой полости, лейкопении, а также могут возникнуть трещины на губах.
АналогиL-ГлютаминаАналогов не найдено.
Источник: Государственный реестр лекарственных средств Украины. Инструкция публикуется с сокращениями исключительно для ознакомления. Перед применением проконсультируйтесь с врачом и внимательно ознакомьтесь с инструкцией. Самолечение может быть вредным для вашего здоровья.
L-ГЛЮТАМИН: инструкция, отзывы, аналоги, цена в аптеках
L-глютамин — средство содержащее аминокислоту L-глютамин, которая играет основную роль в поддержании иммуномодулирующей функции.
Фармакологические свойства
Аминокислоты являются кирпичиками, из которых строится наш организм. L-глутамин — один из наиболее важных. Глутамин является самой распространённой в организме аминокислотой и, согласно данным исследований, может помочь при целом ряде различных заболеваний.
На долю L-глутамина приходится более 60% свободных аминокислот в организме. И хотя организм способен производить аминокислоты, он не справляется с этим во время стресса. Глутамин является условно незаменимой аминокислотой и её нужно дополнительно получать из вне. Вот несколько сфер, в которых глутамин оказывается незаменимым.
Сердце. Глутамин играет важную роль для поддержания нормальной функции сердечно-сосудистой системы. Он является основным источником энергии для клеток эндотелия кровеносных сосудов. Кроме того, глутамин регулирует синтеза оксида азота, который влияет на тонус кровеносных сосудов и уменьшает уровень воспаления в стенках сосудов. Это является хорошей профилактикой атеросклероза и сосудистых катастроф.
Нервная система. Глутамин также может способствовать улучшению настроения, концентрации внимания и памяти. Глутамин легко пересекает гематоэнцефалический барьер и превращается в L-глутаминовую кислоту. Глутаминовая кислота уникальна тем, что может быть преобразована в источник энергии для нервных клеток, когда уровень сахара в крови низок.
Пищеварение. Глутамин является основным питательным веществом для клеток кишечника, а также помогает регулировать клеточное размножение. Добавки глутамина оказались эффективными для пациентов с неспецифическим язвенным колитом, целиакией, болезнью Крона и синдром раздражённого кишечника. Дело в том, что глутамин помогает препятствовать воспалительным и аутоиммунным процессам.
Кроме того, считается, что около 6% людей являются носителями бактерии H.pylori, которая вызывает язвенное поражение желудка. Исследования показывают, что глутамин может безопасно и эффективно защищать от H.pylori и способствовать заживлению язв.
Детоксикация. Глутамин является основным источником энергии для лимфатических клеток и позволяет им лучше утилизировать накопившиеся токсины. Напомним, что лимфатическая система поддерживает в организме баланс жидкости и белка, обеспечивает иммунную защиту и фильтрует токсины.
Иммунитет. Внутрибольничные инфекции значительно увеличивают смертность пациентов после операции.
В статье, опубликованной в «Журнале парентерального и энтерального питания», сообщалось, что у хирургических пациентов в критическом состоянии, которым внутривенно вводили глутамин, значительно сократилось время пребывания в стационаре и количество инфекционных осложнений. Глутамин хорошо известен своей способностью усиливать иммунитет и уменьшать сроки заживления ожоговых больныхМышцы. Спортсмены, которые заинтересованы в сохранении мышечной массы и уменьшении времени восстановления также могут извлечь пользу от глутамина. Две трети глутамина в организме находятся в мышечной ткани. Во время стресса и интенсивных физических нагрузках организм вырабатывает много кортизола, который сокращает резерв глутамина. Дополнительное поступление глутамина помогает продолжать анаболическое состояние и строительство мышечной массы.
Однако необходимо знать, что анаболические и заживляющие свойства глутамина проявляются при его количестве в 2 — 7 раз превышающем обычную концентрацию в организме здорового человека. В связи с этим многие спортсмены используют пищевые добавки с глутамином, которые можно приобрести в магазинах.
Из натуральных источников глутамина пальму первенства держит красная капуста. Красная квашеная капуста с яблочным уксусом, возможно, является одним из наиболее доступных источников L-глутамина. Это связано с глубинными процессами брожения, множеством ферментов и полезных бактерий, которые позволяют аминокислотам лучше усваиваться организмом.
Показания к применению
Улучшает здоровье желудочно-кишечного тракта, являясь жизненно важным элементом для восстановления тканей кишечника
Является важным нейромедиатором мозга и помогает улучшить память и концентрацию
Способствует мышечному росту и предотвращает разрушение мышц
Улучшает спортивные результаты и восстановление после тренировок на выносливость
Ускоряет обмен веществ и клеточную детоксикацию
Борется с раком
Стабилизирует уровень сахара в крови
Способ применения
По 1 капсуле 1-3 раза в день, желательно между приемами пищи.
Не превышать рекомендуемую дозу.
Противопоказания
Перед началом применения, во время беременности, в период лактации, при приеме лекарств или наличии каких-либо заболеваний следует проконсультироваться с врачом.
Условия хранения
Хранить в недоступном для детей месте.
После вскрытия упаковки хранить в темном, сухом и прохладном месте.
Форма выпуска
Дозировка 500 мг 120 капсул в упаковке.
Состав
L-глютамин (в свободной форме)500 мг
Другие ингредиенты: рисовая мука, целлюлоза (капсула) и стеарат магния (растительный источник).
Глутаминовая кислота в бодибилдинге — как принимать, дозировка, инструкция
Как зародился миф о вреде препарата? Загрузка…Краткое содержание статьи:
Применение глутамина в спорте очень широко, но глутаминовая кислота в бодибилдинге – это отдельная тема, заслуживающая особого внимания. Если вы задались целью увеличить темпы роста вашей силы и мышечной массы, то в этом непростом деле вам не обойтись без анаболизаторов.
Глутаминовая кислота в бодибилдингеЧто это такое? Все очень просто: анаболизаторы представляют собой группу веществ, главной функцией которых является ускорение анаболических процессов в организме, за счет чего качественные и эстетические показатели мускулатуры растут в разы быстрее, чем при обычном режиме питания.
Вы немного опустили руки и не знаете, как вернуться в строй. Тогда мы предлагаем вам посмотреть бодибилдинг мотивацию онлайн. Чтобы вы смогли почувствовать себя не одиноким и сильным человеком.
Воздействие препарата на организм человека
Глутаминовая кислота в бодибилдинге как принимать и что ждать в итоге – этот вопрос беспокоит не только начинающих атлетов, но и уже сложившихся бодибилдеров. В результате азотистого обмена в организме бодибилдера, происходит обеззараживание аммиака, и далеко не последнюю роль в этом жизненно важном процессе занимает глутаминовая кислота. Кроме того, это вещество стимулирует окисление тканей головного мозга и оказывает положительный эффект на центральную нервную систему атлета. Если говорить проще, то глутаминовая кислота – горючие для нашего мозга.
Воздействие препарата на организм человекаК слову, применение данного препарата помогает душевно больным людям ослабить последствия их недугов, а для здорового человека употребление глутаминовой кислоты положительно скажется на интеллектуальном развитии.
Глутаминовая кислота в бодибилдинге и стандартная дозировка препарата
Стоит помнить, что глутаминовая кислота является серьезным препаратом, который назначают при лечении огромного спектра заболеваний центральной нервной системы у взрослых и детей. Среди самых распространенных недугов, симптоматику которых способна ослабить глутаминовая кислота, различные виды эпилепсии, психозы, реактивные состояние и депрессии. Кроме того, препарат эффективен в лечении детских врожденных и приобретенных заболеваний, таких как полиомиелит (в острой форме и в период восстановления), болезнь Дауна и церебральных параличах. Поэтому, дозировки в условиях лечения и занятий спортом, в качестве поддерживающей терапии, значительно отличаются.
Для больного человека стандартной дозировкой является употребление препарата 2-3 раза в сутки по одному грамму за раз. Бодибилдерам рекомендуется употреблять не более двух стандартных таблеток по четверть грамма два раза в сутки, то есть не больше грамма в день. При этом курс приема не должен превышать 2-3 недель. Не секрет, что данные рекомендации по дозировке препарата часто игнорируются, ведь глутаминовая кислота в бодибилдинге играет огромную роль и является, пожалуй, самой популярной.
Причины популярности препарата среди атлетов
Глютамин в процентном соотношении составляет более 50% всех аминокислот, из которых состоят наши мышцы. Кроме того, этот препарат способствует активному синтезу множества других аминокислот. Таким образом, больная часть мышечных тканей, так или иначе, является результатом взаимодействия данного препарата с клетками нашего тела. Но это еще не все: глутамин помогает мышцам быстро оправиться от активных нагрузок, что особенно важно при регулярных силовых тренировках.
Причины популярности препарата среди атлетовКроме того, глутаминовая кислота инструкция по применению полезна не только в бодибилдинге, но и в обыденной жизни. Например, всем известно, что те, кто употребляют глутамин зимой, не болеет разного рода инфекционными заболеваниями, характерными для этого времени года. Особенно важно употребление глутаминовой кислоты для тех атлетов, которые практикуют использование стероидов, ведь подобные препараты наносят существенный урон иммунитету спортсмена.
Как зародился миф о вреде препарата?
Глутаминовая кислота в бодибилдинге как принимать, и могут ли быть негативные последствия? Наверняка, вторая часть данного вопроса волнует всех атлетов, которые решили, что им необходимо начать прием данного препарата. Для того чтобы дать понятный и убедительный ответ на него, необходимо вернуться к самому началу выпуска данного препарата. Задолго до того, как глутаминовая кислота появилась в бодибилдинге дозировка? Внимания к этому препарату зашкаливала, и далеко не всегда это внимание было позитивным.
Как зародился миф о вреде препарата?Несмотря на все преграды, которые пришлось преодолеть этому препарату, рост его производства неустанно растет с того самого момента, как первая упаковка глутаминовой кислоты покинула конвейер. Первым, кто решил воспрепятствовать популяризации глутамина, стал Джон Онли – нейрофизиолог из Штатов. Ученый заявил, что при проверке побочных действий препарата на крысах, у испытуемых обнаружилось развитие пороков сетчатки глаз.
- Вслед за этим, как снежный ком последовали жалобы от людей, употребляющих глутаман натрия. Потребители утверждали, что после употребления данного вещества у них наблюдается ускорение сердцебиения, головные боли, а так же общая слабость и патологическое повышение температуры тела. Впоследствии, такую реакцию обозначили «синдромом китайского ресторана».
Но когда в проблеме начали разбираться, оказалось, что все обвинения не имеют под собой никакой почвы, ведь патологии, отмеченные у крыс, на человеке не проявлялись, а тот самый «ресторанный» синдром и вовсе оказался всего лишь раздутой газетной уткой.
Глутаминовая кислота в бодибилдинге как приниматьНо, как это часто бывает, несмотря на веские доказательства несостоятельности всех обвинений в сторону глутоната, препарат и по сей день чувствует на себе отголоски той необоснованной клеветы. Вопреки тому, что данное вещество ободрено даже Всемирной организацией здравоохранения, телевизионщики время от времени все еще пытаются пугать своих зрителей этим страшным словом – «химия», рассказывая о глутаминовой кислоте.
Что мы имеем в итоге?
Теперь, когда вы знаете, что такое глутаминовая кислота ее инструкция по применению в бодибилдинге может быть составлена вами самостоятельно, исходя из индивидуальных особенностей и пожеланий.
Главное, что стоит помнить, что, несмотря на клинически доказанную пользу препарата, не стоит далеко отходить от стандартной дозировки, ведь в чрезмерных количествах даже самый полезный продукт может стать смертельным ядом.
Рекомендуем прочитать:
Руководство по добавкам глутамина: полное руководство по глютамину!
Этот информационный бюллетень о добавке глютамина содержит всю важную информацию о глютамине, которую вам нужно знать. Если у вас есть какие-либо вопросы об информации о добавках глютамина на этой странице, вы можете задать их на нашем форуме. Присоединиться бесплатно! Если вы хотите купить дешевые добавки с глютамином в Интернете, перейдите по ссылкам внизу страницы.
Обзор глутамина:
В мире бодибилдинга глютамин известен как одна из лучших добавок на рынке.Глютамин — это «заменимая» аминокислота. Несущественное не означает, что это несущественно, это означает, что человеческое тело производит это естественным образом. Шестьдесят процентов нашего глютамина находится в скелетных мышцах, а остальная часть находится в легких, печени и желудке. Глютамин имеет уникальную структуру молекулы с двумя боковыми цепями азота. Это делает глютамин основным переносчиком азота в мышечные клетки.
За последние пару лет глютамин приобрел значение благодаря исследованиям, показывающим его уникальный вклад в синтез белка (рост мышц), функции антикатаболического разрушения (предотвращает разрушение мышечной ткани) и эффекты повышения гормона роста.Благодаря этим эффектам глютамин играет важную роль в организме, помогая восстановлению мышечных клеток. В нормальных условиях человеческое тело более чем способно производить необходимое количество глютамина. Но в некоторых случаях требуется больше глютамина, чем может произвести человеческий организм, это называется истощением глютамина. Истощение запасов глутамина может быть вызвано такими заболеваниями, как простуда, обширные ожоги, хирургическое вмешательство и т. Д. Другой основной причиной истощения запасов глутамина являются интенсивные физические упражнения.
Что делает глютамин?
Как упоминалось ранее, во время болезней или интенсивных физических нагрузок потребность вашего организма в глютамине возрастает. Клетки иммунной системы полагаются на глутамин в качестве основного источника топлива. Когда вы заболели или получили травму, ваша иммунная система реагирует, и вам требуется больше глютамина. Людям, склонным к болезням или проживающим в районах, где есть заболевания, скорее всего, потребуются добавки глютамина для поддержания здоровой иммунной системы.
Добавка глутамина также способствует удержанию азота и предотвращает потерю мышечных белков. В течение первых нескольких минут тренировки ваши мышцы начинают выделять глютамин. Если уровень глютамина упадет слишком низко, ваши мышцы могут перейти в катаболическое (разрушающееся) состояние. В крайних случаях это может привести к потере мышечной массы. Глютамин также в значительной степени отвечает за транспортировку азота по телу во время интенсивных физических нагрузок. Положительный баланс азота и высокий уровень глютамина — необходимые критерии для набора мышечной массы.
Почему вашему организму нужен глютамин:
Человеческое тело использует глютамин для перемещения аммиака и азота по телу через кровоток. Таким образом, организм постоянно пытается поддерживать постоянный уровень глютамина в кровотоке. Иммунная и пищеварительная системы жаждут глютамина. Пищеварительная система часто пытается получить достаточно глютамина, чтобы справиться с высокобелковой диетой бодибилдера.
Мышцы — самый большой источник глютамина для вашего тела. 60% всего глютамина в организме хранится в мышцах.Когда человек занимается интенсивной физической активностью (тренировкой), требуется больше глютамина, чем общее количество, производимое организмом. Если организм не может получить необходимый глутамин из кровотока, он должен вернуться в хранилище, в мышцы. Теперь организм расщепляет глютамин, хранящийся в мышцах, и отправляет его в кровоток. Именно в этих условиях требуется добавка глютамина.
Добавки глутамина особенно необходимы сразу после интенсивных тренировок.После интенсивных тренировок уровень глютамина можно снизить до 50%. Когда мышечная ткань расщепляется (после тренировки), необходим глютамин, чтобы направить белок в мышечные клетки, где он будет синтезироваться для роста мышц. Если организм вынужден вырабатывать собственный глютамин (когда вы не принимаете добавки с глютамином), для восстановления нормального уровня глютамина может потребоваться несколько часов или даже дней.
Когда лучше всего принимать добавки с глютамином?
Добавки глутамина необходимы, когда запасы глютамина в организме низкие.А уровень глутамина в организме находится на самом низком уровне после интенсивной физической активности. Вам следует принять глютамин как можно скорее после тренировки. Большинство бодибилдеров предпочитают добавлять в послетренировочный коктейль добавки с глютамином. Глютамин в основном безвкусный.
Польза глутамина для строителей мышц:
Ниже приведены некоторые из прямых ролей, в которых глютамин может повысить вашу работоспособность и помочь вашему телу в наращивании / восстановлении мышц …
- Стимулирует синтез мышечного белка, жертвуя азотом для создания белков
- Уменьшает время восстановления мышц
- Увеличивает выработку и высвобождение гормона роста
- Уменьшает катаболизм мышц во время упражнений
- Повышает выносливость за счет восполнения запасов гликогена в условиях истощения запасов гликогена
- Уменьшает вероятность заболевания / инфекции за счет усиления вашей иммунной системы
- Предотвращает перетренированность при высоких нагрузках и длительных занятиях
Чтобы получить эти эффекты от добавок глютамина, потребление глутамина должно превышать количество, необходимое и вырабатываемое организмом.Необходимое количество глютамина зависит от физической активности и ее воздействия на организм.
Есть ли у глутамина побочные эффекты?
Глютамин обычно безопасен для большинства взрослых. Как всегда, проконсультируйтесь с врачом, прежде чем принимать какие-либо пищевые добавки.
Дополнительные преимущества добавок глютамина:
Как упоминалось на этой странице, глутамин является основным топливом иммунной системы и вторичным топливом системы пищеварения. Таким образом, возможные дополнительные преимущества добавок глютамина могут включать следующее:
- Более сильная иммунная система менее подвержена болезням и инфекциям
- Обратить некоторые повреждения кишечника, вызванные противовоспалительными средствами
- Глютамин поднимает настроение
- Возможное положительное влияние на нейродегенеративные заболевания
- Помощь с долговременной и кратковременной памятью
Кто-нибудь может принимать глютамин?
Исследования показывают, что людям, страдающим диабетом, следует соблюдать осторожность при приеме добавок глютамина, поскольку они ненормально метаболизируют глютамин.Если вы страдаете диабетом, вам рекомендуется проконсультироваться с врачом перед использованием любых добавок для бодибилдинга.
ЭтикеткаEndari обновлена с указанием преимуществ и инструкциями по применению
Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) одобрило обновленную маркировку Endari® (L-глутамин; Emmaus Medical), чтобы лучше информировать медицинских работников и пациентов с серповидно-клеточной анемией.
АминокислотаEndari была одобрена FDA в июле 2017 года для уменьшения острых осложнений серповидно-клеточной анемии у взрослых и детей в возрасте от 5 лет и старше.Считается, что L-глутамин улучшает окислительно-восстановительный потенциал НАД в серповидных эритроцитах за счет увеличения доступности восстановленного глутатиона.
Раздел Клинические исследования был обновлен, чтобы включить заявление о том, что клиническое преимущество Endari наблюдалось независимо от использования гидроксимочевины. Клиническая польза была основана на данных об эффективности исследования фазы 3, в котором оценивали Endari у 230 пациентов в возрасте от 5 до 58 лет с серповидноклеточной анемией или серповидно-клеточной анемией 0 -талассемии.
Кроме того, обновленная маркировка включает новый раздел с пошаговыми инструкциями по применению.
Читать далее
«Это обновление этикетки содержит важную информацию, которая поможет врачам принимать обоснованные решения об использовании Endari», — сказал Ютака Ниихара, доктор медицины, магистр здравоохранения, председатель и главный исполнительный директор Emmaus. «Мы особенно рады признанию FDA того факта, что клиническая польза Endari не зависит от использования гидроксимочевины. Это признание подкрепляет и поддерживает использование Endari в качестве монотерапии или в сочетании с гидроксимочевиной в качестве важных вариантов лечения пациентов с серповидно-клеточной анемией.”
Endari доступен в виде пакетов, содержащих 5 г порошка L-глутамина в картонных коробках по 60 штук.
Для получения дополнительной информации посетите endarirx.com.
Список литературы- FDA утверждает обновленную этикетку Endari®. [пресс-релиз]. Торранс, Калифорния: Emmaus Life Sciences, Inc; 3 ноября 2020 г.
- Endari [листок-вкладыш]. Торранс, Калифорния: Emmaus Medical, Inc; 2020.
Темы:
Гематологические заболевания Педиатрия Серповидно-клеточная анемияВизуализация активности переносчиков глутамина в живых клетках с использованием генетически закодированных сенсоров глутамина
Abstract
Глютамин играет центральную роль в метаболизме важных биологических молекул, таких как аминокислоты, белки, нейротрансмиттеры и глутатион.Поскольку метаболизм глутамина регулируется множеством ферментов и транспортеров, ожидается, что концентрация глютамина в клетках будет динамической во времени. Более того, дифференциация метаболизма глутамина между типами клеток в одной и той же ткани (например, нейрональными и глиальными клетками) часто имеет решающее значение для правильного функционирования ткани в целом, но при этом для оценки специфической активности переносчиков и ферментов в такой гетерогенной ткани по типу клеток с помощью физическое фракционирование чрезвычайно сложно. Следовательно, крайне желателен метод сообщения о динамике глутамина на клеточном уровне.Генетически закодированные датчики могут быть нацелены на определенный тип клеток, что устраняет этот пробел в знаниях. Здесь мы сообщаем о разработке сенсоров глутамина Föster Resonance Energy Transfer (FRET) на основе улучшенных голубых и желтых флуоресцентных белков, мономерного бирюзового флуоресцентного белка (mTFP) 1 и венеры. Было обнаружено, что эти сенсоры специфичны для глутамина и устойчивы к изменениям pH в физиологическом диапазоне. Используя клетки cos7, экспрессирующие человеческий транспортер глутамина ASCT2 в качестве модели, мы демонстрируем, что свойства транспортера глутамина могут быть легко проанализированы с помощью этих сенсоров.Диапазон изменения концентрации глутамина в данной клетке также можно оценить с помощью сенсоров с разным сродством. Более того, пара FRET mTFP1-венеры может быть дуплексирована с другой парой FRET, mAmetrine и tdTomato, открывая возможность визуализации другой молекулы в реальном времени. Эти новые сенсоры глутамина будут полезными инструментами для анализа специфики метаболизма глутамина на уровне отдельных клеток.
Образец цитирования: Грюнвальд К., Холланд Дж. Т., Стромберг В., Ахмад А., Ватчаракичкорн Д., Окумото С. (2012) Визуализация активности переносчиков глутамина в живых клетках с использованием генетически кодированных сенсоров глутамина.PLoS ONE 7 (6): e38591. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0038591
Редактор: Стефан Страк, Университет Айовы, Соединенные Штаты Америки
Поступило: 11 января 2012 г .; Одобрена: 8 мая 2012 г .; Опубликован: 14 июня 2012 г.
Авторские права: © 2012 Gruenwald et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.
Финансирование: Эта работа была поддержана грантом 1R21NS064412 Национального института здравоохранения, грантом 1052048 Национального научного фонда (NSF) и грантом фонда Джеффресса Мемориала J-908. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.
Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.
Введение
Глутамин необходим как предшественник других аминокислот, таких как глутамат, гистидин, пролин и аргинин, а также многих других важных биологических молекул, таких как белки, нуклеиновые кислоты [1], аминосахара [2] и глутатион [ 3], [4].Он также является предпочтительным топливом для быстро делящихся клеток, таких как энтероциты, фибробласты и лимфоциты [5], [6], и он служит важным предшественником нейротрансмиттеров глутамата и ГАМК [7], [8], [9], [ 10].
Поскольку глутамин занимает центральное место в первичном и вторичном метаболизме, его доступность оказывает большое влияние на анаболизм последующих молекул. Например, недавние исследования с использованием эпилептической модели мозга показали, что доступность глутамина влияет на количество синаптически высвобождаемого глутамата [11], [12].Более того, помимо своей роли анаболического предшественника, данные свидетельствуют о том, что глутамин играет регулирующую роль в отношении многих клеточных функций, таких как передача сигналов, индуцированная набуханием клеток [13] и апоптоз [14]. Недавние исследования показывают, что глутамин вызывает резкое изменение экспрессии генов (~ 1% проанализированных генов) в линиях β-клеток поджелудочной железы [15], а также при введении в качестве пищевой добавки. Следовательно, клеточный уровень глутамина оказывает большое влияние на физиологию клетки, регулируя как молекулы, производные от глутамина, так и клеточные функции, контролируемые глутамином.
Контроль клеточного уровня глутамина — очень сложный процесс. Активность глутамин синтетазы, фермента, который синтезирует глутамин из глутамата и аммония, регулируется широким спектром механизмов, включая аллостерическую регуляцию субстратами [16], сборку субъединиц [17] и регуляцию транскрипции глюкокортикоидами и β-катенином [18]. ], [19], [20]. Глутаминаза и транспортеры глутамина, такие как транспортеры системы N и ASCT, подвергаются как транскрипционной, так и посттранскрипционной регуляции [21], [22], [23].В дополнение к регуляции окружающей среды, осуществляемой указанными выше механизмами, регуляция метаболизма глутамина очень специфична для каждого типа клеток. В печени млекопитающих два отдельных типа клеток вовлечены в последовательную деградацию и синтез глутамина; клетки в перипортальной области производят аммоний из глутамина, чтобы обеспечить аммиак, необходимый для производства мочевины, тогда как в перивенозных гепатоцитах глутамин синтезируется глутаминсинтетазой для удаления избытка аммиака, вышедшего из цикла мочевины [24], [25], [ 26].Клеточная специализация метаболизма глутамина также обнаруживается в нервных тканях животных. Глутамат, высвобождаемый нейронными клетками, поглощается окружающими глиальными клетками и превращается в глутамин, который не является молекулой-передатчиком. Затем синтезированный глутамин отправляется обратно в нейрон, где он распадается на глутамат для пополнения пула нейромедиаторов. Этот так называемый глютамин-глутаматный челнок считается важным для поддержания активности нейронов [7], [8].
Из-за множества уровней регуляции и гетерологичных функций разных типов клеток неудивительно, что концентрация глутамина сильно варьируется между типами клеток. Например, глутамин обнаруживается в высоких концентрациях в олигодендроцитах и астроцитах (22 мМ), но в гораздо более низких концентрациях в глутаматергических окончаниях (4–11 мМ) [27]. Аналогичным образом, в гепатоцитах уровень глутамина составляет 20 мМ, но стимуляция глутаминазы или глутаминтрансаминазы приводит к снижению концентрации глутамина на 80% и 30% соответственно [28].В раковых клетках с активированным катаболизмом глутамина концентрация глутамина оказалась намного ниже, чем в клетках с более низкой скоростью катаболизма глютамина [29].
Генетически закодированные сенсоры, нацеленные на один тип клеток или на субклеточный компартмент, могли бы обеспечить альтернативный подход к анализу динамической регуляции метаболитов в отдельной клетке. Ранее сообщалось о наборе датчиков FRET для глутамина, которые успешно использовались для мониторинга концентрации глутамина в растительных клетках [30].Однако эти сенсоры были ограничены в диапазоне концентраций глутамина, который может быть обнаружен из-за относительно низкого сродства (6,8 и 18,8 мМ). Кроме того, в качестве пары FRET использовался усиленный голубой и желтый флуоресцентный белок (ECFP и EYFP), который трудно мультиплексировать с другими парами FRET. Здесь мы сообщаем о множестве улучшенных сенсоров глутамина на основе FRET, основанных на глутамин-связывающем белке E.coli , glnH. Датчики состоят из недавно описанной пары FRET, мономерного бирюзового флуоресцентного белка (mTFP) 1 и венеры.Как mTFP1, так и venus обладают улучшенной квантовой эффективностью и стабильностью pH по сравнению с более часто используемыми донорами FRET, ECFP и EYFP [31], [32]. Более того, пара mTFP1-venus FRET может дуплексироваться с другой парой, mAmetrine-tdTomato [33]. Мы демонстрируем, что поглощение и отток глутамина можно контролировать с помощью этих сенсоров глутамина, что делает их привлекательным инструментом для анализа свойств транспортеров, экспрессируемых в данной клетке. Свойства переносчиков, такие как специфичность к субстрату и зависимость от градиента натрия, можно легко контролировать.Кроме того, используя сенсоры с разным сродством, мы показываем, что можно контролировать широкий диапазон цитозольных концентраций глутамина.
Результаты и обсуждение
Датчик глутамина FRETс использованием пары FRET mTFP1-Venus
Ранее разработанные сенсоры глутамина с использованием пары FRET CFP / YFP несовместимы с другими парами FRET на основе белков из-за значительного перекрытия спектров возбуждения / излучения [34]. Кроме того, максимумы возбуждения CFP (428 нм) не идеальны для получения изображений с помощью конфокальной микроскопии.Недавно Ai et al. сообщил об улучшенном голубом флуоресцентном белке (FP) из кораллов, mTFP1, который имеет более высокую квантовую эффективность и улучшенную стабильность pH [31]. Более того, две пары FRET на основе белков, mTFP1 / Citrine (улучшенный желтый FP) и mAmetrine / tdTomato, спектрально ортогональны и поэтому могут использоваться для измерения двойного FRET [35]. Мы исследовали, может ли glnH (номер доступа: NP_415332), высокоаффинный глутамин-связывающий белок из E.coli , быть преобразован в сенсор FRET с использованием mTFP1 и улучшенного желтого FP, venus [32].
Сайты присоединения донорных и акцепторных молекул влияют на эффективность FRET, потому что они влияют как на расстояние между флуорофорами, так и на диполь-дипольную ориентацию. Кристаллическая структура glnH как в открытой, так и в закрытой форме была опубликована ранее [36], [37]. Одна из долей glnH содержит большую структуру, подобную шпильке, рядом с ее N-концом, которая позволяет вставлять FP (Рис. 1A, разрешающее положение указано пурпурным). Ранее было продемонстрировано, что вставка ECFP в соответствующее место в глутамат-связывающем белке ybeJ, который структурно родственен glnH, не мешает связыванию глутамата с химерным белком [38].Поэтому мы систематически тестировали комбинации этих трех возможных сайтов вставки для донорных и акцепторных белков (рис. 1B). Для венеры известно, что концевые области (N-концевая спираль и C-концевая спираль) не требуются для флуоресценции [38]. Следовательно, в дополнение к полноразмерной венере использовали серию клонов, у которых была удалена часть N- и C-концевых аминокислот, чтобы найти оптимальную длину линкера. Среди исследованных конструкций мы обнаружили один функциональный датчик глутамина на основе mTFP1 / venus, названный FLIPQ-TV (m T FP / V enus) 1.0 (рис. 1Б). В этой конфигурации mTFP1 и венера расположены в одной доле, следовательно, конформационные изменения в домене glnH вряд ли вызовут значительное изменение расстояния между двумя FP. Однако связывание глутамина вызывает сдвиг второй доли, открывая большее пространство вблизи С-конца, где сливается молекула Венеры (рис.S1). Такое изменение, вероятно, увеличит доступное пространство, которое белок Венеры может занимать из-за уменьшения стерических ограничений, тем самым влияя на эффективность FRET между двумя FP.Фактически, ряд периплазматических связывающих белков типа II, у которых N- и C-концы расположены в одной доле, могут быть преобразованы в функциональные сенсоры FRET, когда два FP сливаются на N- и C-концах [ 38], [39], [40].
Рис. 1. Конфигурация датчика глутамина FRET.
(A) Открытая (голубой) [36] и закрытая (желтый, глутамин в связывающем кармане показан красным) [37] конформация glnH, глутамин-связывающего белка из E.coli . Положение внутренней шпильки, допускающее вставку FP, отмечено пурпурным цветом.(B) Схематические изображения химерных слияний между последовательностями mTFP1, glnH и Венеры.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0038591.g001
Эмиссия донора и акцептора изменялась взаимно при добавлении глутамина, указывая на то, что связывание субстрата трансдуцируется в изменение эффективности FRET (рис. . 2А). Изменение эффективности FRET зависело от концентрации. Приблизительное значение Kd этого датчика (8,56 ± 1,43 × 10 −8 M) соответствовало ранее опубликованным значениям сродства glnH (от 1 × 10 −8 до 3 × 10 −7 M) (Таблица 1 и рис.2B) [40], [41], [42]. Эти результаты показывают, что glnH может быть преобразован в датчик FRET с использованием пары FRET mTFP1 / venus.
Рис. 2. Реакция сенсора FLIPQ-TV1.0 на глутамин.
(A) Спектры излучения сенсора FLIPQ-TV1.0 в отсутствие (черные квадраты) или в присутствии 1 мМ глутамина (белые квадраты). A.u. : произвольная единица. (B) Зависимое от концентрации изменение отношения интенсивностей пиков венеры / mTFP1. Наилучшее соответствие изотерме одиночного связывания (R = R max — (R max -R min ) x [L] / ([ Kd ] + [L]), где R — соотношение, R Указывается max и R min — максимальное и минимальное соотношения соответственно, а [L] — концентрация лиганда).
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0038591.g002
FLIPQ-TV1.0 имел очень низкое изменение эффективности FRET при связывании глутамина (рис. 2B, ΔR / R 0 = 0,033). Чтобы еще больше улучшить изменение эффективности FRET сенсоров FLIPQ-TV, линкерные последовательности между связывающим белком и флуорофорами были модифицированы с использованием подхода с полувысокой пропускной способностью. Последовательности линкеров на N- и C-концах mTFP1 и N-конце венеры были последовательно изменены посредством случайного мутагенеза (рис.3A и S2) для отбора клонов с улучшенным изменением эффективности FRET. Чтобы избежать потенциального насыщения сенсоров из-за загрязнения глутамином из бактериального лизата, версия сенсора, которая имела в ~ 20 раз более низкую аффинность по сравнению с сенсором на основе glnH дикого типа (FLIPQ-TV_R75K, Таблица 1 и Рис. 4А) использовали в качестве исходного клона для оптимизации.
Рисунок 3. Улучшение сенсора FLIPQ-TV за счет скрининга с полувысокой пропускной способностью.
(A) Схематическое изображение FLIPQ-TV 3.0_R75K сенсор, в котором линкерные последовательности (обозначенные как Ln1–3) были последовательно изменены посредством случайного мутагенеза. Указана линкерная последовательность полученного клона (FLIPQ-TV 3.0_R75K). (б) Спектры излучения сенсора FLIPQ-TV3.0_R75K в отсутствие (черные квадраты) или в присутствии 1 мМ глутамина (белые квадраты).
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0038591.g003
Рис. 4. Сходство и особенности подложки сенсоров FLIPQ-TV3.0.
(A) Кривые насыщенности FLIPQ-TV3.0 сенсоров с измененным сродством. (B) Особенности подложки сенсоров FLIPQ-TV3.0_1.5 мкм (черный), 50 мкм (заштрихованные), 100 мкм (белые), 2 м (горизонтальные полосы) и 8 м (серые) для Gln, Glu, Asn и Asp.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0038591.g004
В каждом раунде более 700 клонов подвергали скринингу на предмет улучшенного изменения эффективности FRET (подробности мутагенеза и процедур скрининга описаны на рис. S2). Последовательное улучшение привело к FLIPQ-TV3.0_R75K, который имел более чем 4-кратное улучшение по сравнению с FLIPQ-TV1.0_R75K (Рис. 3B и Рис.S2, ΔR / R 0 = 0,26).
Сходство и особенности подложки датчиков FLIPQ-TV3.0
Зарегистрированные физиологические концентрации глутамина в цитозоле значительно различаются (22 мМ олигодендроцитов и астроцитов, 4–11 мМ в глутаметергических окончаниях [27]. 20 мМ в гепатоцитах [28], 2,7–2,8 мМ в гиппокампе [43]). Чтобы создать сенсоры, которые имеют динамический диапазон при всех физиологических концентрациях глутамина, был проведен целевой сайт-направленный мутагенез.Среди протестированных остатков R75, который образует водородную связь с α-карбоксильной группой глутамина [37], привел к значительным изменениям аффинности при мутации в K и M. Кроме того, D157, который образует водородную связь с α-аминогруппой. группа [37] при мутации в N приводила к варианту с более низким сродством (рис. S3A). Помимо мутаций в связывающем кармане, мутации в остатках, расположенных либо по периметру междоменной щели (перистерический), либо в домене, который претерпевает значительное локальное изменение конформации при связывании субстрата (аллостерический), могут вызывать изменения аффинности [41 ].Среди таких остатков, идентифицированных de Lorimier et al., Y86 (аллостерический) и W220 (перистерический) изменяли сродство при мутации в A (фиг. S3B). Полученные клоны FLIPQ-TV3.0_R75K, R75M, D157N, R75MY86A и R75MW220A имели Kd из 1,5 × 10 −6 M, 5,3 × 10 −5 M, 1,3 × 10 −4 M, и 1,6 × 10 −3 , и 7,6 × 10 −3 M соответственно (рис. 4A, таблица 1). Эти датчики получили названия FLIPQ-TV3.0_1.5 мкм, 50 мкм, 100 мкм, 2 м и 8 м (числа в названиях были округлены для простоты).Полный список остатков, которые были протестированы на изменение аффинности, можно найти в таблице S1.
Также было проверено сродство этих сенсоров к аналогичным аминокислотам. FLIPQ-TV3.0_1,5 мкг связывается с глутаматом и аспарагином в концентрациях выше 1 мМ и 10 мМ соответственно (фиг. 4B). Kd s для глутамата и аспарагина нельзя было надежно измерить из-за его низкого сродства, которое, по оценкам, составляет> 10 мМ в обоих случаях. FLIPQ-TV3.0_50 μ, 100 μ, 2 m и 8 m не связывался с глутаматом, аспарагином или аспартатом в концентрациях 10 мМ (рис.4Б). На основании этих результатов мы пришли к выводу, что сенсоры FLIPQ-TV3.0 очень специфичны к глутамину.
Стабильность pH датчиков FLIPQ-TV3.0
MTFP1, помимо его лучшей квантовой эффективности по сравнению с ECFP, более стабилен при кислом pH (p K a 4.3) [31]. Чтобы проверить стабильность pH сенсоров FLIPQ-TV3.0, были протестированы интенсивности излучения в диапазоне pH 5,25–8,0. Было обнаружено, что FLIPQ-TV3.0_1.5 μ чувствителен к кислому pH, при этом ΔR резко падает ниже pH 6.5. Однако при pH выше 6,75 и ΔR, и интенсивность излучения были довольно стабильными (рис. 5). FLIPQ-TV3.0_2 m и 8 m, с другой стороны, поддерживает приемлемый ΔR при более кислой pH, тогда как ΔR снижается при pH выше 7,5. Датчики FLIPQ-TV были более pH-стабильными по сравнению с аналогичным химерным белком, несущим CFP вместо mTFP1 (Ахмад и Окумото, неопубликованные результаты). Поскольку считается, что цитозольный pH клеток млекопитающих находится в диапазоне 7,0–7,4 [44], мы пришли к выводу, что датчик подходит для использования в цитозоле клеток млекопитающих.Стабильность pH этих датчиков делает их более подходящими для обнаружения транспортных процессов, которые сопровождают изменения клеточного pH, такие как H + -symport, как в случае системных N-переносчиков, которые, как было предложено, опосредуют как отток, так и поглощение глутамина [45].
Рисунок 5. Стабильность PH датчика FLIPQ-TV3.0_1.5 μ (A), 2 м (B) и 8 м (C).
Отношения эмиссии Venus / mTFP1 измеряли в буфере MES-Tris с измененным pH в отсутствие (черные квадраты) или в присутствии (белые квадраты) насыщающих концентраций глутамина.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0038591.g005
Визуализация клеточного глутамина в живых клетках с использованием датчиков FLIPQ-TV3.0
Чтобы проверить, функционируют ли эти сенсоры FLIPQ-TV3.0 в живых клетках, сенсоры были экспрессированы в цитозоле клеток cos7, линии клеток, которая использовалась для характеристики активности экзогенных переносчиков аминокислот в предыдущих исследованиях [46 ], [47]. Кроме того, сенсоры также экспрессировались в клетках SK-Hep, которые, как известно, экспрессируют человеческий переносчик нейтральных аминокислот ASCT2, который транспортирует глутамин [48], [49].Сенсоры FLIPQ-TV3.0 устойчиво экспрессировались в цитозоле обеих клеточных линий. Изменения эффективности FRET FLIPQ-TV3.0_ 1,5 мкм, 50 мкм, 100 мкм, 2 мкм и 8 мкм были протестированы путем перфузии клеток, экспрессирующих индивидуальный датчик, внешним глутамином в диапазоне от 50 мкМ до 5 мМ. В клетках cos7 ответы всех этих сенсоров на внешние воздействия глутамина были либо необнаруживаемыми, либо очень слабыми и не воспроизводимыми (рис. S4A-C). Это может быть связано с низкой способностью поглощения глутамина по сравнению с активностью ферментов, которые поддерживают концентрацию глутамина в клетках.С другой стороны, слабый, но воспроизводимый ответ наблюдался в клетках SK-Hep, экспрессирующих сенсор FLIPQ-TV_8 m (рис. S5).
Слабая эндогенная активность поглощения глутамина клетками cos7 обеспечивает подходящую систему для анализа активности экзогенно экспрессируемых переносчиков. Таким образом, мы экспрессировали ASCT2, помеченный mCherry [50], в клетках cos7 в качестве модели экзогенного транспортера глутамина. Конструкция ASCT2-mCherry локализована в основном в цитоплазме, что согласуется с предыдущими сообщениями [51], [52] (рис.S6). Когда FLIPQ-TV3.0_8 m был коэкспрессирован с ASCT2-mCherry, изменение соотношения венеры / mTFP1 наблюдалось в присутствии внеклеточного глутамина в диапазоне от 40 мкМ до 5 мМ (рис. 6A и B), что указывает на то, что глутамин захваченный ASCT2 может быть обнаружен сенсором, экспрессируемым в цитозоле. Уменьшение соотношения венеры / mTFP1 в ходе эксперимента, скорее всего, связано с дифференциальным фотообесцвечиванием двух флуорофоров [53]. Изменение соотношения зависело от концентрации. Аналогичный результат был получен при использовании FLIPQ-TV3.Датчик 0_2 м (рис. S7A). Напротив, клетки cos7, коэкспрессирующие FLIPQ-TV3.0_1.5 μ, который, как ожидается, будет насыщен в живых клетках из-за его высокой аффинности, не ответили на внеклеточный глутамин (фиг. S7B).
Рис. 6. Измерения глутамина in vivo с использованием датчиков FLIPQ-TV3.0_8 м и 100 мкм.
(A) Отношение венеры / mTFP1 клеток cos7, коэкспрессирующих сенсор FLIPQ-TV3.0_8 m и ASCT2-mCherry. Клетки перфузировали буфером Хэнка с HEPES-буфером. Моменты, когда внеклеточный глутамин (красный) и 5 мМ Ala (синий) был добавлен в перфузионную среду, указаны в прямоугольниках над графиком.Сплошные и пунктирные линии представляют две отдельные клетки, измеренные в одном эксперименте. (B) Интенсивность каналов mTFP1 и Венеры в эксперименте, показанном на (A). Значения были скорректированы на фотообесцвечивание и нормализованы к исходному уровню. (C) и (D) Аналогичный эксперимент, как в (A) и (B), проведенный с клетками cos7, экспрессирующими датчик FLIPQ-TV3.0_100 μ.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0038591.g006
Интересно, что FLIPQ-TV3.0_100 мкМ также реагировал на добавление глутамина в диапазоне от 1 мкМ до 625 мкМ, насыщая при более низких концентрациях (∼125 мкМ внешний глутамин) по сравнению с FLIPQ-TV3.Датчики 0_2 м и 8 м (рис. 6C и D). Это указывает на то, что в таких условиях цитозольная концентрация глутамина может упасть в динамический диапазон этого сенсора (∼100 мкМ, если концентрация опускается до кД сенсора), что намного ниже, чем диапазон клеточного Концентрации глутамина, о которых сообщалось на данный момент (1-22 мМ [27], [54], [55]). Сообщается, что транспортер ASCT2 сверхэкспрессируется в раковых клетках [56], где предполагается, что он играет роль в удовлетворении повышенного спроса на глутамин в раковых клетках.Действительно, было продемонстрировано, что конкурентное ингибирование опосредованного ASCT2 захвата глутамина с помощью Ala, Ser и Thr подавляет рост клеточных линий карциномы толстой кишки [57] и гепатомы [58], [59] и, соответственно, возможность нацеливания на это транспортер для фармакологического вмешательства был предложен в прошлом [56], [60]. Поскольку FLIPQ-TV3.0_100 μ может сообщать о снижении концентрации глутамина до субмиллимолярного диапазона, можно было бы использовать датчик в сочетании с химическими библиотеками или библиотеками РНКи для определения лечения, которое снижает концентрацию глутамина в клетках.Кроме того, дуплексная визуализация концентрации клеточного глутамина и индукции апоптоза с использованием датчиков FLIPQ-TV и датчика апоптоза, mAmetrine-DEVD-tdTomato [33] соответственно, может предложить привлекательный метод для корреляции клеточной концентрации глутамина и индукции апоптоз [61].
Определение свойств переносчика глутамина с помощью датчиков FLIPQ-TV
Концентрация клеточного глутамина оставалась высокой после удаления внеклеточного глутамина, указывая на то, что клеточного метаболизма недостаточно для понижения уровня глутамина до диапазона обнаружения этих датчиков.Однако добавление небольших нейтральных аминокислот, таких как Ala, быстро меняло концентрацию клеточного глутамина (фиг. 6 и фиг. S7A). ASCT2 является обязательным обменником и способен опосредовать отток глутамина в присутствии других внеклеточных аминокислот [62]. Поэтому мы протестировали ряд аминокислот на способность вызывать отток глутамина. Ala, Thr, Cys, Ser и D-ser, которые распознаются ASCT2, были способны вызывать отток глутамина, тогда как His, Pro и Lys не способствовали оттоку глутамина (рис.7). Транспорт глутамина также зависел от внеклеточного натрия, что согласуется с предыдущими наблюдениями [48] (рис. 8). Поскольку все эти результаты подтверждают характеристики ASCT2, мы пришли к выводу, что датчики FLIPQ-TV можно использовать для мониторинга цитозольных концентраций глутамина и что их можно использовать для исследования физиологических параметров переносчика, таких как специфичность субстрата и зависимость от внеклеточный натрий. Поскольку генетически кодируемые сенсоры могут быть нацелены на один тип клеток с использованием соответствующих промоторов, было бы возможно использовать эти сенсоры для изучения транспорта и метаболизма глутамина в конкретном типе клеток in vivo. Такая экспериментальная установка будет особенно полезна для тканей, которые состоят из гетерологичных типов клеток с отличным метаболизмом глутамина (то есть глиальных клеток и нейронов). Например, молекулярная идентичность переносчика, ответственного за доставку глутамина в нейрональные клетки, в некоторых случаях все еще остается спорной [62], [63]. Предположительно генетически закодированные сенсоры можно использовать в сочетании с фармакологическими методами для анализа транспортной системы, ответственной за поглощение глутамина, в контексте живой ткани или даже у интактного животного [64], [65], [66].
Рисунок 7. Удаление клеточного глутамина через транспортер ASCT2 в присутствии внешних аминокислот, визуализированное с помощью сенсора FLIPQ-TV3.0_8 m.
(A) Цитозольный глутамин экспортируется путем добавления внеклеточного Ala, Ser, Cys, Thr и D-ser. Моменты, когда внеклеточный глутамин (красные прямоугольники) или другие аминокислоты (синие прямоугольники) были добавлены в перфузионную среду, обозначены прямоугольниками над графиком. (B) Добавление Pro, Lys, His (закрашенные прямоугольники) не изменяет концентрацию цитозольного глутамина, тогда как добавление Ala (синие прямоугольники) способствует экспорту глутамина.Сплошные и пунктирные линии представляют две отдельные клетки, измеренные в одном эксперименте. Все аминокислоты добавляли при внешних концентрациях 5 мМ.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0038591.g007
Рис. 8. Ответы клеток cos7, коэкспрессирующих сенсор FLIPQ-TV3.0_8 m и ASCT2-mCherry, на внешний глутамин в отсутствие (A) или в присутствии 13,4 мМ (~ 10% нормального буфера Хэнкса) внеклеточного натрия.
Моменты времени, когда 5 мМ внеклеточного глутамина (красный прямоугольник) или 5 мМ Ala (синий прямоугольник) указаны в прямоугольниках над графиком.Сплошные и пунктирные линии представляют две отдельные клетки, измеренные в одном эксперименте.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0038591.g008
Материалы и методы
Конструкций ДНК
Для создания сенсоров FLIP-TV кодирующую последовательность E.coli связывающего глутамин белка (glnH, номер доступа NC_000913) без периплазматической лидерной последовательности амплифицировали с помощью ПЦР из геномной ДНК E.coli K12 с Bam HI. и сайты Xho I на 5′-конце и Kpn, I и Hind III сайты на 3′-конце соответственно.Использованные праймеры представляли собой 5′- GAGGGATCCGCTCGAGGCAGGCTCGAAATTAGTTGTCGCGACGGATACCGCCTTCGTTCCGTTTGAATTTAAACAGGGCGCCAAATATGTGGGCTTTGAC -3 ‘(подчеркнутая последовательность указывает на введенный сайт GACT -3 GACT -3 GACT для GACT-GAC -3, вставленный в mCTGGGGTGACT -3, и вставка mCTT-GACT -3’ ‘. Полученный продукт ПЦР клонировали в сайт Bam HI / Hind III вектора pRSET B (Invitrogen), продуцируя pRSET-glnH. Последовательность mTFP1 с сайтами Eco47 и III на обоих концах была амплифицирована из pBAD / HisB-mTFP1 (щедрый подарок от Dr.Campbell) с использованием праймеров 5′– GAGAGCGCTGGTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG –3 ′ и 5′- GAGAGCGCTACCGTACAGCTCGTCCATGCCGAGAGT -3 ′. Полученный продукт ПЦР расщепляли с помощью Eco47 III и клонировали в сайт Sfo I pRSET-glnH. Последовательность венеры с Kpn I на 5′-конце и Hind III на 3′- была переварена из pRSET-FLIPEWT [40] и слита в рамке считывания с 3′-концом последовательности glnH. Полученная конструкция была названа pRSET-FLIPQTV. Точечные мутанты были созданы путем сайт-направленного мутагенеза [67].Для оптимизации линкерных последовательностей между флуорофорами и связывающим белком были использованы следующие праймеры: 5′-GCCCTTGCTCACCATNNNNNNCTGTTTAAATTCAAAC -3 ‘(рис. 3A, Ln1), 5′- GTCAAAGCCCACATATTTGGCGCTNNAGNCTTG. 5’- CCCGGTGAACAGCTCNNNNNNTTTCGGTTCAGTACC -3 ‘(фиг. 3A, Ln3).
Плазмида, содержащая ASCT2 человека (ATCC MGC 1387), была приобретена из Американской коллекции типовых культур (ATCC). Слияние ASCT2-мономера Cherry (mCherry) было получено с помощью ПЦР-сшивания.Последовательность ASCT2 без стоп-кодона, за которой следует линкерная последовательность, амплифицировали с использованием прямого праймера ASCT2 — F : 5′-GAGAAGATCTCGGTGCTTCCCATCATGGTGGCCGATCCTCCTCGAG -3 ‘и обратного праймера ASCT2 — GGCGGGATCTCCTCCACCGCCCCCTCCCATGACTGATTCCTTCTCAGAGGC -3 ‘. Последовательность mCherry была амплифицирована с использованием прямого праймера mCherry — F : 5′- GGGGGCGGTGGAGGAGATCCCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGAT -3 ‘и обратного праймера T mCherry — 900GCCT-GACT-GAT MAGGAGTCC.Подчеркнутые последовательности представляют собой комплементарную область между двумя фрагментами. Два ПЦР-фрагмента были удлинены во втором цикле ПЦР с праймерами ASCT2-F и mCherry-R . Полученный слитый фрагмент ASCT2-mCherry расщепляли с помощью Bgl II и Eco RI, затем клонировали между сайтами Bam HI и Eco RI в векторе pENTR1A (Invitrogen). Последовательность ASCT2-mCherry рекомбинировали в вектор pcDNA3.2 V5-DEST (Invitrogen) с использованием LR-клоназы II, следуя инструкциям производителя.
Клеточные культуры
КлеткиCos7 (ATCC CRL-1561) и SK-Hep (ATCC HTB-52) были приобретены в ATCC. Клетки культивировали в среде Игла, модифицированной по Дульбекко, с добавлением 5% космической телячьей сыворотки, 100 Ед / мл пенициллина и 100 Ед / мл стрептомицина. Клетки культивировали при 37 ° C в атмосфере 5% CO 2 . Для визуализации клетки помещали в 8-луночную камеру со стеклянным дном, покрытым поли-L-лизином. Трансфекцию проводили с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen).Для трансфекции клеток использовали 400 нг конструкций FLIPQ-TV и 1,2 мкг конструкции ASCT2-mCherry на лунку (100 мм 2 ).
Высокопроизводительная очистка белка
колоний BL21 (DE3) gold (Stratagene), экспрессирующих случайно мутагенизированные сенсоры FLIPQ-TV, культивировали в 2 мл среды SB в 96-луночных планшетах. Клетки лизировали с помощью ультразвукового устройства, снабженного 96-штырьковым наконечником, и очищали с использованием 96-луночных колонок Ni-NTA (Qiagen). Спектры излучения для каждого образца в присутствии и в отсутствие глутамина измеряли при возбуждении при 450 нм с использованием планшет-ридера (Synergy4, BioTek), и клоны с более значительными изменениями пиков mTFP1 и венеры (494 и 535 нм соответственно) сохраняли для дальнейшего использования. анализ.
Определение характеристик сенсоров FLIPQ in vitro
Бактериальные экспрессионные конструкции для сенсоров FLIPQ вводили в E.coli BL21 (DE3) Gold (Stratagene), и экспрессированные сенсорные белки очищали с использованием колонок Ni-NTA, как описано в [68]. Кривые титрования лигандов получали с использованием микропланшет-ридера (Synergy 4, BioTek) с возбуждением при 450 нм и испусканием при 490 нм и 535 нм для mTFP1 и венеры, соответственно. Чтобы определить Kd каждого сенсора FLIPQTV, сенсорный белок смешивали с различными концентрациями глутамина в 20 мМ буфере HEPES, pH 7.0, и измеряли соотношение венера / mTFP1. Kd определяли путем подгонки кривой насыщения к изотерме связывания одного сайта: S = ( rr апо ) / ( r sat — r апо ) = [ L ] / ([ Kd ] + [ L ]), где S — насыщение, [ L ] — концентрация лиганда, r — соотношение, r апо — соотношение без лиганда, r sat — соотношение при насыщении.Кривые насыщения были получены по крайней мере для трех независимых белковых препаратов.
Визуализация клеточных культур in vivo
Клеткивизуализировали через 36–72 ч после трансфекции с использованием эпифлуоресцентного микроскопа (IX81, Olympus) с соответствующими фильтрами (возбуждение mTFP1: 455/10, испускание mTFP1: 495/30, возбуждение венеры: 470/24, эмиссия венеры: 535 / 30 м. Вишневое возбуждение: 560/40, м. Вишневое излучение: 630/75). Клетки перфузировали сбалансированным физиологическим раствором Хэнка (HBSS) с добавлением 25 мМ HEPES и 4.2 мМ бикарбонат натрия, pH 7,35. Перед экспериментами с динамикой времени клетки перфузировали 5 мМ Ala в течение 2 минут для снижения концентрации внутриклеточного глутамина, затем коротко промывали HBSS. Изображения были собраны и проанализированы с использованием соответствующего программного обеспечения (Slidebook, 3I). Для тестирования активности переносчиков в буфере, свободном от Na + , натриевые компоненты в HBSS были заменены холином, и клетки инкубировали в течение 15 минут в этом буфере на основе холина перед перфузией аминокислот.
Дополнительная информация
Рисунок S1.
Виды поверхности glnH в открытой и закрытой формах. (A) Выравнивание между открытой (синий, 1GGG) и закрытой (бежевый, 1WDN) структурами, показанными на ленточных диаграммах. Молекула глутамина в расщелине представлена в виде шарика и палки. С-концы, на которых белок Венеры слит в FLIPQ-TV1.0, отмечены пурпурным цветом. (B) и (C) Виды поверхности открытой (B) и закрытой (C) структур, наложенные на ленточную диаграмму, показанную в (A).Обратите внимание на большое изменение пространственных ограничений вблизи C-концов (выделено пурпурным цветом).
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0038591.s001
(TIF)
Рисунок S2.
Оптимизация сенсоров FLIPQ-TV. Линкеры (Ln1–3) итеративно мутагенизировали, и клоны, представляющие отдельные события мутагенеза, подвергали скринингу на улучшенное ΔR / R 0 . Указывается количество клонов, проверенных на каждом этапе, и ΔR / R 0 каждого поколения датчиков.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0038591.s002
(EPS)
Рисунок S3.
Остатки, которые были изменены для получения аффинных мутантов. (A) Шарикообразное представление молекулы глутамина в щели и остатков в щели, которые могут образовывать водородные связи с глутамином. (B) Расположение Tyr86 и Trp220, которые мутировали в FLIPQ-TV3.0_2 m и 8 m.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0038591.s003
(EPS)
Рисунок S4.
Клетки Cos7, экспрессирующие сенсоры FLIPQ-TV3.0_100 μ (A), 2 m (B), 8 m (c), перфузированные внеклеточным глутамином. Клетки перфузировали буфером Хэнка с HEPES-буфером. Моменты, когда внеклеточный глутамин (красный) и 5 мМ Ala (синий) были добавлены в перфузионную среду, указаны в прямоугольниках над графиком. Сплошные и пунктирные линии представляют две отдельные клетки, измеренные в одном эксперименте.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0038591.s004
(EPS)
Рисунок S7.
Измерение глутамина in vivo с помощью датчика FLIPQ-TV3.0_2 m. (A) Соотношение Венеры / mTFP1 клеток cos7, коэкспрессирующих сенсор FLIPQ-TV3.0_2 m и hASCT2-mCherry. Клетки перфузировали буфером Хэнка с HEPES-буфером. Моменты, когда внеклеточный глутамин или аланин (5 мМ) были добавлены в перфузионную среду, обозначены красными и синими прямоугольниками над графиком. Сплошные и пунктирные линии представляют две отдельные клетки, измеренные в одном эксперименте. (B) Интенсивность каналов mTFP1 и Венеры в эксперименте, показанном на (A).(C) и (D) Соотношение Venus / mTFP1 и интенсивности mTFP1 и венерианских каналов клеток cos7, коэкспрессирующих сенсор FLIPQ-TV3.0_1.5 μ и hASCT2-mCherry. Моменты, когда добавляли внеклеточный глутамин и аланин (5 мМ), указаны как в (A).
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0038591.s007
(TIF)
Вклад авторов
Задумал и спроектировал эксперименты: KG JTH AA SO. Проведены эксперименты: KG JTH VS AA DW SO. Проанализированы данные: KG JTH VS AA DW SO.Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: SO. Написал бумагу: ТАК.
Список литературы
- 1. Boza JJ, Moennoz D, Bournot CE, Blum S, Zbinden I, et al. (2000) Роль глутамина в синтезе пуриновых нуклеотидов de novo в клетках Caco-2. Eur J Nutr 39: 38–46.
- 2. Ghosh S, Blumenthal HJ, Davidson E, Roseman S (1960) Метаболизм глюкозамина. V. Ферментативный синтез глюкозамин-6-фосфата. J Biol Chem 235: 1265–1273.
- 3.Higashiguchi T, Hasselgren PO, Wagner K, Fischer JE (1993) Влияние глутамина на синтез белка в изолированных эпителиальных клетках кишечника. JPEN J Parenter Enteral Nutr 17: 307–314.
- 4. Рот Э., Олер Р., Манхарт Н., Экснер Р., Весснер Б. и др. (2002) Регулирующий потенциал глутамина — отношение к метаболизму глутатиона. Питание 18: 217–221.
- 5. Кури Р., Ньюсхолм П., Пифон-Кури Т.С., Пирес-де-Мело М., Гарсия С. и др. (1999) Метаболическая судьба глутамина в лимфоцитах, макрофагах и нейтрофилах.Braz J Med Biol Res 32: 15–21.
- 6. Wiren M, Magnusson KE, Larsson J (1998) Роль глутамина, сыворотки и энергетических факторов в росте энтероцитоподобных клеточных линий. Int J Biochem Cell Biol 30: 1331–1336.
- 7. Барнетт Н.Л., Поу Д.В., Робинсон С.Р. (2000) Ингибирование глутаминсинтетазы клеток Мюллера быстро ухудшает реакцию сетчатки на свет. Глия 30: 64–73.
- 8. Pow DV, Robinson SR (1994) Глутамат в некоторых нейронах сетчатки происходит исключительно из глии.Неврология 60: 355–366.
- 9. Rothstein JD, Tabakoff B (1984) Изменение высвобождения глутамата в полосатом теле после ингибирования глутамин-синтетазы. Журнал нейрохимии 43: 1438–1446.
- 10. Альбрехт Дж, Сидорык-Вегжинович М., Зелинска М., Ашнер М. (2011) Роль глутамина в нейротрансмиссии. Биология нейронной глии. С. 1–14.
- 11. Баччи А., Санчини Дж., Вердерио С., Армано С., Праветтони Е. и др. (2002) Блокировка глутамат-глутаминового цикла между астроцитами и нейронами подавляет эпилептиформную активность в гиппокампе.Журнал нейрофизиологии 88: 2302–2310.
- 12. Тани Х., Бандровски А.Э., Парада И., Винн М., Хугенард Дж. Р. и др. (2007) Модуляция эпилептиформной активности глутамином и транспортом системы А в модели посттравматической эпилепсии. Neurobiol Dis 25: 230–238.
- 13. Lavoinne A, Meisse D, Quillard M, Husson A, Renouf S и др. (1998) Глютамин и регуляция экспрессии генов в гепатоцитах крыс: роль набухания клеток. Биохимия 80: 807–811.
- 14.Fuchs BC, Bode BP (2006) Стресс над выживанием: глутамин как модулятор апоптоза. J Surg Res 131: 26–40.
- 15. Corless M, Kiely A, McClenaghan NH, Flatt PR, Newsholme P (2006) Глутамин регулирует экспрессию ключевого фактора транскрипции, передачу сигнала, метаболический ген и экспрессию белка в клональной линии бета-клеток поджелудочной железы. Дж. Эндокринол 190: 719–727.
- 16. Tate SS, Meister A (1971) Регулирование глутаминсинтетазы печени крысы: активация альфа-кетоглутаратом и ингибирование глицином, аланином и карбамилфосфатом.Proc Natl Acad Sci U S A 68: 781–785.
- 17. Denman RB, Wedler FC (1984) Ассоциация-диссоциация глутаминсинтетазы мозга млекопитающих: эффекты ионов металлов и других лигандов. Arch Biochem Biophys 232: 427–440.
- 18. Laping NJ, Nichols NR, Day JR, Johnson SA, Finch CE (1994) Транскрипционный контроль глиального фибриллярного кислого белка и глутаминсинтетазы in vivo показывает противоположные ответы на кортикостерон в гиппокампе. Эндокринология 135: 1928–1933.
- 19. Vardimon L, Ben-Dror I, Havazelet N, Fox LE (1993) Молекулярный контроль экспрессии глутамин синтетазы в развивающейся ткани сетчатки. Дев Дин 196: 276–282.
- 20. Gebhardt R, Baldysiak-Figiel A, Krugel V, Ueberham E, Gaunitz F (2007) Гепатоцеллюлярная экспрессия глутаминсинтетазы: индикатор действий морфогенов как главных регуляторов зональности во взрослой печени. Prog Histochem Cytochem 41: 201–266.
- 21. Curthoys NP, Watford M (1995) Регулирование активности глутаминазы и метаболизма глутамина.Анну Рев Нутр 15: 133–159.
- 22. Gu S, Villegas CJ, Jiang JX (2005) Дифференциальная регуляция переносчика аминокислот SNAT3 инсулином в гепатоцитах. J Biol Chem 280: 26055–26062.
- 23. Palmada M, Speil A, Jeyaraj S, Bohmer C, Lang F (2005) Серин / треониновые киназы SGK1, 3 и PKB стимулируют переносчик аминокислот ASCT2. Сообщения о биохимических и биофизических исследованиях 331: 272–277.
- 24. Haussinger D (1986) Регулирование метаболизма аммиака в печени: межклеточный цикл глутамина.Успехи в регуляции ферментов 25: 159–180.
- 25. Haussinger D (1987) Метаболизм глутамина в печени. Beitrage zu Infusionstherapie und klinische Ernahrung 17: 144–157.
- 26. Watford M, Chellaraj V, Ismat A, Brown P, Raman P (2002) Метаболизм глутамина в печени. Питание 18: 301–303.
- 27. Fonnum F (1993) Регулирование синтеза пула трансмиттера глутамата. Prog Biophys Mol Biol 60: 47–57.
- 28. Хаусингер Д., Соболь С., Мейер А. Дж., Герок В., Тагер Дж. М. и др.(1985) Роль транспорта через плазматическую мембрану в метаболизме глутамина в печени. Европейский журнал биохимии / FEBS 152: 597–603.
- 29. Kung HN, Marks JR, Chi JT. Глутаминсинтетаза является генетической детерминантой клеточной независимости от глутамина в эпителии молочной железы. PLoS Genet 7: e1002229.
- 30. Ян Х, Богнер М., Стирхоф Ю. Д., Людвиг У. (2010) H + -независимый транспорт глутамина в кончиках корней растений. PLoS One 5: e8917.
- 31.Ai HW, Henderson JN, Remington SJ, Campbell RE (2006) Направили эволюцию мономерной, яркой и фотостабильной версии голубого флуоресцентного белка Clavularia: структурная характеристика и применения в флуоресцентной визуализации. Биохимический журнал 400: 531–540.
- 32. Нагаи Т., Ибата К., Парк Э.С., Кубота М., Микошиба К. и др. (2002) Вариант желтого флуоресцентного белка с быстрым и эффективным созреванием для клеточно-биологических применений. Природная биотехнология 20: 87–90.
- 33. Ai HW, Hazelwood KL, Davidson MW, Campbell RE (2008) Пары флуоресцентных белков FRET для ратиометрической визуализации двойных биосенсоров. Природные методы 5: 401–403.
- 34. Ян Х, Богнер М., Стирхоф Ю. Д., Людвиг У. (2010) H-независимый транспорт глутамина в кончиках корней растений. PLoS One 5: e8917.
- 35. Ai HW, Hazelwood KL, Davidson MW, Campbell RE (2008) Пары флуоресцентных белков FRET для ратиометрической визуализации двойных биосенсоров. Nat Методы 5: 401–403.
- 36. Hsiao CD, Sun YJ, Rose J, Wang BC (1996) Кристаллическая структура глутамин-связывающего белка из Escherichia coli. J Mol Biol 262: 225–242.
- 37. Sun YJ, Rose J, Wang BC, Hsiao CD (1998) Структура глутамин-связывающего белка в комплексе с глутамином с разрешением 1,94 A: сравнение с другими белками, связывающими аминокислоты. J Mol Biol 278: 219–229.
- 38. Деушл К., Окумото С., Фер М., Лугер Л.Л., Кожух Л. и др.(2005) Создание и оптимизация семейства генетически кодируемых сенсоров метаболитов с помощью полурациональной белковой инженерии. Protein Sci 14: 2304–2314.
- 39. Гу Х, Лалонд С., Окумото С., Лугер Л.Л., Шарфф-Поулсен А.М. и др. (2006) Новый аналитический метод отслеживания фосфатов in vivo. FEBS Lett 580: 5885–5893.
- 40. Окумото С., Лугер Л.Л., Мичева К.Д., Реймер Р.Дж., Смит С.Дж. и др. (2005) Обнаружение высвобождения глутамата из нейронов с помощью генетически закодированных наносенсоров FRET, отображаемых на поверхности.Proc Natl Acad Sci U S A 102: 8740–8745.
- 41. de Lorimier RM, Smith JJ, Dwyer MA, Looger LL, Sali KM, et al. (2002) Создание семейства флуоресцентных биосенсоров. Protein Sci 11: 2655–2675.
- 42. Weiner JH, Furlong CE, Heppel LA (1971) Связывающий белок для L-глутамина и его связь с активным транспортом в E. coli. Arch Biochem Biophys 142: 715–717.
- 43. Петров О.А., Эрранте Л.Д., Ротман Д.Л., Ким Дж. Х., Спенсер Д.Д. (2002) Цикл глутамата-глутамина в эпилептическом гиппокампе человека.Эпилепсия 43: 703–710.
- 44. Bright GR, Fisher GW, Rogowska J, Taylor DL (1987) Визуализирующая микроскопия с соотношением флуоресценции: временные и пространственные измерения цитоплазматического pH. Журнал клеточной биологии 104: 1019–1033.
- 45. Чаудри Ф.А., Кризай Д., Ларссон П., Реймер Р.Дж., Вреден С. и др. (2001) Связанное и несвязанное движение протонов с помощью транспортной системы аминокислот N. Embo Journal 20: 7041–7051.
- 46. Mizoguchi K, Cha SH, Chairoungdua A, Kim DK, Shigeta Y, et al.(2001) Переносчик цистинурии человека: локализация и функциональная характеристика. Почки интернэшнл 59: 1821–1833.
- 47. Хаяси М., Оцука М., Моримото Р., Хирота С., Яцусиро С. и др. (2001) Связанный с дифференцировкой Na + -зависимый котранспортер неорганического фосфата (DNPI) является переносчиком везикулярного глутамата в эндокринной глутаматергической системе. Журнал биологической химии 276: 43400–43406.
- 48. Utsunomiya-Tate N, Endou H, Kanai Y (1996) Клонирование и функциональная характеристика системного ASC-подобного Na + -зависимого переносчика нейтральных аминокислот.Журнал биологической химии 271: 14883–14890.
- 49. Fuchs BC, Perez JC, Suetterlin JE, Chaudhry SB, Bode BP (2004) Индуцируемая антисмысловая РНК, нацеленная на переносчик аминокислот ATB0 / ASCT2, вызывает апоптоз в клетках гепатомы человека. Американский журнал физиологии. Физиология желудочно-кишечного тракта и печени 286: G467–478.
- 50. Shaner NC, Campbell RE, Steinbach PA, Giepmans BNG, Palmer AE, et al. (2004) Улучшенные мономерные красные, оранжевые и желтые флуоресцентные белки, полученные из красного флуоресцентного белка Discosoma sp.Природная биотехнология 22: 1567–1572.
- 51. Lim J, Lorentzen KA, Kistler J, Donaldson PJ (2006) Молекулярная идентификация и характеристика транспортера глицина (GLYT1) и транспортера глутамина / глутамата (ASCT2) в хрусталике крысы. Экспериментальные исследования глаза 83: 447–455.
- 52. Dun Y, Mysona B, Itagaki S, Martin-Studdard A, Ganapathy V и др. (2007) Функциональный и молекулярный анализ транспорта D-серина в клетках Мюллера сетчатки. Экспериментальные исследования глаза 84: 191–199.
- 53. Shaner NC, Steinbach PA, Tsien RY (2005) Руководство по выбору флуоресцентных белков. Природные методы 2: 905–909.
- 54. Fafournoux P, Demigne C, Remesy C, Lecam A (1983) Двунаправленный транспорт глутамина через клеточную мембрану в печени крысы. Биохимический журнал 216: 401–408.
- 55. Ottersen OP, Zhang N, Walberg F (1992) Метаболическая компартментация глутамата и глутамина: морфологические данные, полученные с помощью количественной иммуноцитохимии в мозжечке крысы.Неврология 46: 519–534.
- 56. Fuchs BC, Bode BP (2005) Переносчики аминокислот ASCT2 и LAT1 при раке: партнеры в преступлении? Семинары по биологии рака 15: 254–266.
- 57. Pawlik TM, Souba WW, Sweeney TJ, Bode BP (2000) Эфиры форбола быстро ослабляют поглощение и рост глутамина в клетках карциномы толстой кишки человека. Журнал хирургических исследований 90: 149–155.
- 58. Bode BP, Reuter N, Conroy JL, Souba WW (1998) Протеинкиназа C регулирует поглощение питательных веществ и рост в клетках гепатомы.Хирургия 124: 260–267.
- 59. Bode BP, Fuchs BC, Hurley BP, Conroy JL, Suetterlin JE и др. (2002) Молекулярный и функциональный анализ поглощения глутамина гепатомой человека и клетками печени. Американский журнал физиологии желудочно-кишечного тракта и физиологии печени 283: G1062 – G1073.
- 60. Наканиши Т., Тамай И. (2011) Транспортеры-переносчики растворенных веществ как мишени для доставки лекарств и фармакологического вмешательства при химиотерапии. Журнал фармацевтических наук 100: 3731–3750.
- 61. Paquette JC, Guerin PJ, Gauthier ER (2005) Быстрая индукция внутреннего апоптотического пути голоданием по L-глутамину. Журнал клеточной физиологии 202: 912–921.
- 62. Бреер А., Брукс Н., Ганапати В., Диммер К.С., Вагнер К.А. и др. (1999) Астроглиальный переносчик аминокислот ASCT2 как медиатор оттока глутамина. Журнал нейрохимии 73: 2184–2194.
- 63. Conti F, Melone M (2006) Путь к работе с глютамином: потерялся в трубке? Международная нейрохимия 48: 459–464.
- 64. Тиан Л., Хайрес С.А., Мао Т., Хубер Д., Чиаппе М.Э. и др. (2009) Визуализация нейронной активности у червей, мух и мышей с улучшенными показателями кальция GCaMP. Природные методы 6: 875–881.
- 65. Силиг Д.Д., Чиаппе М.Э., Лотт Г.К., Датта А., Осборн Д.Е. и др. (2010) Двухфотонное изображение кальция от фиксированной на голове дрозофилы во время оптомоторной ходьбы. Природные методы 7: 535–540.
- 66. Dombeck DA, Harvey CD, Tian L, Looger LL, Tank DW (2010) Функциональная визуализация клеток места гиппокампа при клеточном разрешении во время виртуальной навигации.Природа нейробиологии 13: 1433–1440.
- 67. Kunkel TA, Roberts JD, Zakour RA (1987) Быстрый и эффективный сайт-специфический мутагенез без фенотипического отбора. Методы в энзимологии 154: 367–382.
- 68. Фер М., Фроммер В. Б., Лалонд С. (2002) Визуализация поглощения мальтозы живыми клетками дрожжей с помощью флуоресцентных наносенсоров. Proc Natl Acad Sci U S A 99: 9846–9851.
Глутаминсинтетаза и глутаматдегидрогеназа в семенах тритикале: молекулярное клонирование и экспрессия генов
Растительный материал и условия роста
Triticale x Triticosecale Wittm.резюме. Витоны выращивали в почве в 10-литровых горшках по десять растений на горшок в теплице. В почву добавляли 2,5 г N / горшок в формах KNO 3 и NH 4 NO 3 . Полный питательный раствор содержал: 9% Mg 2+ , 0,9% Mn 2+ , 0,7% Cu 2+ , 0,6% Zn 2+ , 0,08% B 3+ , 0,01% Mo . 2+ и 0,005% Co 2+ . Перед пересадкой в теплицу растения яровизировали в течение 6 недель при 4 ° C.Для исследований развития семян отдельные колосья были помечены в день цветения, и семена были собраны с колосьев, собранных в разные моменты времени: 3, 5, 7, 9, 13, 15, 20, 25, 30, 35, 40 и 45 DAF (дни после цветения). Семена после 45 DAF были сухими зернами. Для исследования прорастания семян сухие семена стерилизовали поверхность раствором 5% гипохлорита, а затем проращивали в темноте при 22 ° C и 100% относительной влажности. Образцы собирали через 8, 16, 24, 48 и 72 часа прорастания.Образцы немедленно замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° C до использования.
Общая экстракция РНК
Суммарную РНК экстрагировали из семян на 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 20, 25, 30, 35, 40 и 45 DAF. Суммарную РНК также собирали со щитка и эндосперма сухих семян, которые всасывали в течение 8, 16 и 24 часов, и со щитка, эндосперма, побегов и корней семян, пропитанных в течение 48 и 72 часов. РНК выделяли с использованием метода экстракции тиоцианатом гуанидиния / кислым фенолом (Chomczynski and Sacchi, 1987) с дополнительной начальной экстракцией, как описано Zdunek-Zastocka (2010).Концентрацию и чистоту РНК определяли спектрофотометрически путем измерения поглощения при 260, 230 и 280 нм. Целостность выделенной РНК анализировали на 1,5% (мас. / Об.) Агарозно-формальдегидном геле. Чтобы исключить любое загрязнение геномной ДНК, всю РНК обрабатывали ДНКазой I, свободной от РНКаз (Fermentas).
Клонирование полноразмерной тритикале
глутаминсинтетазы кДНКЧетыре микрограмма общей РНК были выделены из пула семян, щитков, эндоспермов, побегов и корней, всосавшихся в течение 48 и 72 часов.КДНК первой цепи синтезировали с использованием 200 ед. Обратной транскриптазы Superscript II (Invitrogen) и 1 мкл биотинилированного олиго-dT 25 (700 нг / мл -1 ). Консервативные домены были идентифицированы путем выравнивания аминокислотных последовательностей нескольких генов GS1 и GS2, идентифицированных на веб-сайте GenBank. На основе последовательностей консервативных доменов были созданы пары праймеров (GS1-F / GS1-R и GS2-F / GS2-R) для амплификации основных фрагментов гена (таблица 1). ПЦР проводили в термоциклере Пельтье PTC-200 (MJ Research) в следующих условиях: 2 мин при 94 ° C, 37 циклов по 30 с при 94 ° C, 30 с при 62 ° C, 45 с при 72 ° C. , и заключительный этап удлинения на 5 мин.ПЦР выполняли в объеме 50 мкл, содержащем 1 мкл кДНК, 0,2 мМ каждого dNTP, 0,5 мкМ каждого праймера, 1 × Green GoTaq ® Flexi Buffer, 5 мМ MgCl 2 и 1,25 ед. GoTaq . ® Flexi ДНК-полимераза (Promega). Полученный ампликон клонировали в плазмидный вектор pGEM-T easy (Promega) и секвенировали. Секвенирование выполняли с использованием набора ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit на анализаторе ДНК ABI Prism 3730 (Applied Biosystems). Файлы трассировки проверялись и редактировались с помощью Chromas 1.55 (Технелизиум, США).
Таблица 1 Последовательности праймеров, используемые для клонирования кДНК полноразмерной глутаминсинтетазы тритикалеПолноразмерные кДНК получали с использованием набора GeneRacer Kit (Invitrogen). Готовые к RACE кДНК с первой цепью, использованные в качестве матриц для 5′-RACE и 3′-RACE, были приготовлены из общей РНК, выделенной из пула разно развитых семян, щитков, эндоспермов, побегов и корней семян, пропитанных на 48 и 48 лет. 72 ч. Для реакций 5 ‘RACE и 3’ RACE мы использовали либо случайные праймеры, либо праймер GeneRacer OligodT, соответственно, в соответствии с инструкциями производителя.Синтез первой цепи выполняли с использованием обратной транскриптазы SuperScript III (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя. Ген-специфические праймеры, используемые для RACE, были сконструированы из вышеупомянутых частичных последовательностей кДНК TsGS1 и TsGS2 . В таблице 1 показаны только праймеры, используемые для амплификации самых длинных 5 ‘и 3’ концов.
ПЦР-амплификация 5′-концов ЦГС2 — 1, ЦГС1 — 1 , ЦГС1 — 2 , ЦГС1 — 3 и — — ЦГс6 4 с использованием праймера GeneRacer 5 ‘и ген-специфических праймеров (GSP): rGS2 / 1-R, rGS1 / 1-R, rGS1 / 2-R, rGS1 / 3-R, rGS1 / 4-R, соответственно, используя следующие условия: 2 мин при 94 ° C, 35 циклов по 30 с при 94 ° C, 30 с при X ° C (см. соответствующие температуры для каждого грунтовочного слоя в таблице 1), 1 мин при 68 ° C и окончательное наращивание в течение 10 мин при 68.ПЦР выполняли в объеме 50 мкл, содержащем 1 мкл матрицы кДНК, 0,2 мМ каждого dNTP, 0,2 мкМ GSP, 0,6 мкМ GeneRacer 5 ‘Primer, 1 × буфер для ПЦР высокой точности, 5 мМ MgCl 2 и 2,5 U Platinum ® Taq ДНК-полимераза High Fidelity (Invitrogen). ПЦР-амплификации 3′-концов ЦГС2 — 1, ЦГС1 — 1 , ЦГС1 — 2 , ЦГС1 — 3 и ЦГС1 — 4 3′-праймер GeneRacer и GSP: rGS2 / 1-F, rGS1 / 1-F, rGS1 / 2-F, rGS1 / 3-F и rGS1 / 4-F соответственно.Условия ПЦР и реакционная смесь были такими же, как описано выше. Продукты амплификации клонировали в вектор pCR ® 4Blunt-TOPO ® (Invitrogen) и секвенировали.
Анализ экспрессии с помощью полуколичественной ОТ-ПЦР
Полуколичественный анализ ОТ-ПЦР выполняли с использованием набора One-Step RT-PCR Kit (Novagen). Последовательности олигонуклеотидных праймеров для TsGS1 — 3 , TsGS2 — 1 и TsGDh2 , а также температуры отжига, используемые для каждой отдельной RT-PCR, показаны в таблице 2.ОТ-ПЦР проводили в следующих условиях: 30 мин при 60 ° С, 2 мин при 94 ° С, 31 цикл (для ЦГС1 — 3 , ЦГС2 — 1 и ЦГДх2 ) и 10 циклов (для рРНК ) по 30 секунд при 94 ° C, 30 секунд при 56 или 60 ° C, 30 секунд при 72 ° C и заключительный этап удлинения в течение 5 минут при 72 ° C. ПЦР выполняли в общем объеме 50 мкл, содержащем 100 нг РНК, 0,2 мМ каждого dNTP, 0,5 мкМ каждого праймера, 1 × реакционный буфер, 5 мМ Mn (OAc) 2 , 15 единиц ингибитора РНКазы и 5 U Tth Полимераза.Последующие фрагменты, полученные с помощью ОТ-ПЦР, клонировали в вектор pGEM-T Easy (Promega) и секвенировали. Чтобы гарантировать, что равные количества РНК-матрицы были добавлены к каждой ОТ-ПЦР, амплификацию гена 18S рРНК проводили, как указано в таблице 2. Амплифицированные продукты анализировали электрофорезом на 1,5% агарозных гелях, содержащих бромид этидия. Денситометрический анализ проводился с использованием программы Image J, версия 1.44 (http://www.rsb.info.nih.gov/ij).
Таблица 2 Последовательности праймеров и условия ПЦР, используемые для полуколичественного анализа ОТ-ПЦРФерментные анализы и анализ белков
Глутаматдегидрогеназа (GDH) была экстрагирована путем гомогенизации 0.2 г развивающихся семян (3, 5, 7, 9, 13, 15, 20, 25, 30, 35, 40 и 45 DAF) в 1 мл экстракционного буфера, содержащего 100 мМ Трис-HCl (pH 7,8), 5 мМ 2-меркаптоэтанол и 20 мкМ PMSF. Гомогенизатор Ultra-Turrax T25 (IKA) использовали для двух 60-секундных циклов при 20000 об / мин. Гомогенаты центрифугировали в течение 30 мин при 10,000 × g при 4 ° C и супернатант использовали в качестве экстракта фермента. Супернатанты собирали и хранили на льду для анализов GDH и анализа концентрации белка. Все анализы проводили при 30 ° C.Активность GDH определяли как в аминирующем (NADH-GDH), так и в дезаминирующем (NAD + -GDH) направлениях, измеряя изменение поглощения при 340 нм (Barash et al. 1973). Стандартная реакционная смесь аминирования содержала 100 мМ трис-HCl (pH 8,3), 200 мМ NH 4 Cl, 0,28 мМ NADH, 32 мМ 2-оксоглутарат, 0,15 мл экстракта фермента и деионизированную воду, которые были добавлены до конечного объема. 1,5 мл. Стандартная реакционная смесь дезаминирования содержала 100 мМ Трис-HCl (pH 9,2), 200 мМ l-глутамат, 0.25 мМ NAD + , 0,2 мл экстракта фермента и деионизированная вода, которые были добавлены до конечного объема 1,5 мл. Одна единица активности GDH была определена как окисление или восстановление 1 мкмоль кофермента (NADH или NAD + ) в минуту при 30 ° C г -1 сухого веса (DW).
Глутамин синтетазу (GS) экстрагировали путем гомогенизации 0,2 г развивающихся семян (3, 5, 7, 9, 13, 15, 20, 25, 30, 35, 40 и 45 DAF), скутеллы и эндосперма семян, пропитанных для 8, 16, 24 ч или из щитков, эндоспермов, побегов и корней семян, набитых в течение 48 и 72 часов.Гомогенизация происходила в 1 мл буфера для экстракции, содержащего 100 мМ Трис-HCl (pH 7,9), 1 мМ ЭДТА, 20 мМ MgSO 4 и 1 мМ 2-меркаптоэтанол. Ultra-Turrax T25 (IKA) использовался в течение 45 с при 20000 об / мин. Гомогенаты центрифугировали 20 мин при 10 000 × g при 4 ° C. Супернатант использовали в качестве экстракта фермента. Супернатанты собирали и хранили на льду для анализов GS и концентрации белка. Активность GS измеряли с помощью анализа синтетазы, основанного на методе, описанном O’Neal and Joy (1973) и оптимизированном для тритикале.Двести пятьдесят микролитров ферментного экстракта добавляли к 200 мкл смеси для анализа, которая содержала 265 мМ глутамата и 60 мМ гидроксиламина. Реакцию начинали добавлением 50 мкл 80 мМ АТФ и инкубировали при 30 ° C в течение 30 мин. Реакцию останавливали добавлением 125 мкл 0,5 М трихлоруксусной кислоты. Образцы инкубировали при 20 ° C с последующим центрифугированием при 10 000 × g в течение 10 мин. Пятьсот микролитров супернатанта добавляли к 250 мкл 0,5 М хлорида железа и инкубировали в течение 15 мин при 20 ° C.Контроли содержали все компоненты реакции, кроме АТФ. Образование γ-глутамилгидроксамата (GHM) определяли путем измерения оптической плотности при 540 нм с использованием спектрофотометра. Активность GS выражали в мкмоль GHM в минуту при 30 ° C на DW.
Концентрации белка в экстрактах тканей определяли методом Брэдфорда (Bradford, 1976) с использованием бычьего сывороточного альбумина для построения стандартной кривой. Каждое измерение повторяли трижды, и результаты представляли как среднее значение двух независимых биологических экспериментов.
Электрофорез в полиакриламидном геле
Прерывистый нативный ПААГ выполняли, как описано Орнштейном (1964) и Дэвисом (1964) и в соответствии с протоколом производителя (Mini-Protean Tetra Cell, Bio-Rad). Использовали 4% -ный штабелирующий гель и 7,5% -ный разделяющий гель. На каждую дорожку добавляли равные количества (50 мкг) растворимого белка, экстрагированного из развивающихся семян. Электрофорез проводили при 120 В в течение 1 ч при 4 ° C в буферной системе Трис-глицин.
После электрофореза полосы белка, содержащие активность GDH (дезаминирование), визуализировали путем инкубации в 100 мМ Трис-HCl (pH 9.2) с 100 мМ 1-глутамата, 0,75 мМ НАД, 0,4 мМ нитросинего тетразолия и 0,26 мМ феназинметосульфата в течение 15-60 мин при 37 ° C (Hartmann et al. 1973). В качестве контроля идентичный гель инкубировали в растворе красителя GDH без глутамата.
Биоинформатический анализ
Последовательности были проверены путем поиска в базе данных сервера Национального центра биотехнологической информации с использованием алгоритма BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Даты секвенирования из этой статьи были депонированы в GenBank.Вычисление аминокислотных последовательностей и расчет теоретических молекулярных масс и pI были выполнены с использованием ExPASy (http://www.expasy.ch/tools/). Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей было произведено с использованием программы CLUSTALW (Thompson et al. 1997). Филогенетический анализ проводился с использованием метода объединения соседей (NJ), реализованного в программе PhyML (http://www.phylogeny.fr/version2_cgi/index.cgi) (Dereeper et al. 2010). Значение начальной загрузки было создано с использованием 100 непараметрических повторений.Субклеточная локализация выведенного белка была предсказана с помощью TargetP (Emanuelsson et al. 2007).
Статистический анализ
Измерения активности ферментов представлены в виде среднего значения ± SD (стандартное отклонение) для трех независимых экспериментов с двумя повторностями каждый. Статистическая значимость определялась с использованием теста Стьюдента t . Результат считался значимым, если значение P было меньше 0,05 (MS Excel).
Когда перебивать — это хорошо: генетическая икота, защищающая от болезни Хантингтона — HDBuzz
Доктор Джефф Кэрролл, 14 марта 2019 г. Отредактировал профессор Эд Уайлд
Множество новых исследований выявили, возможно, самый важный новый факт в генетике болезни Хантингтона с момента открытия этого гена в 1993 году.По крайней мере, две исследовательские группы по всему миру одновременно сообщают, что крошечный генетический сбой в гене HD оказывает большое влияние на симптомы HD.
Болезнь Хантингтона вызывается единственной мутацией в одном гене. Из-за его связи с HD мы обычно называем его геном HD , хотя ученые формально называют его HTT . У каждого есть две копии гена HD — по одной унаследованной от мамы и папы.
Три «буквы» в ДНК, такие как CAG или CAA, инструктируют клетку о добавлении одного строительного блока аминокислоты, такого как глутамин, к производимому белку.Каждый ген — это рецепт — набор инструкций о том, как сделать белок. Наши гены написаны на языке ДНК, в котором используются четыре химических буквы, которые ученые обозначают аббревиатурами A, T, G и C.Если бы вы приблизились к клетке и посмотрели на ДНК, вы на самом деле не увидели бы этих букв, но они помогают. ученые понимают и расшифровывают язык генов.
Очень близко к началу гена HD находится длинный повторяющийся участок букв ДНК C-A-G . Даже у людей без HD эта последовательность повторяется в среднем около 17 раз.
У каждого человека, которому суждено развить HD, этот участок CAG в ДНК длиннее, чем обычно. У среднего пациента с HD бывает около 44 повторов, а у некоторых их намного больше. В целом, чем больше CAG обнаружено в гене HD человека, тем скорее мы ожидаем, что у них разовьются симптомы HD, хотя это сильно варьируется между отдельными пациентами.
Чрезвычайно длинные повторы CAG являются ярким примером этого эффекта. Очень длинные повторы (более 65), как правило, вызывают очень раннее начало HD или ювенильную болезнь Хантингтона (JHD).
Совсем недавно две отдельные исследовательские группы опубликовали одно и то же поразительное открытие об этих CAG-повторах. Прежде чем описывать их результаты, мы должны немного разобраться с сорняками.
Первое, что нужно понять, это то, что инструкции по производству белка в ДНК работают очень специфическим образом. ДНК имеет четырехбуквенный алфавит: A, C, G и T. С другой стороны, белки состоят из длинных цепочек строительных блоков, называемых аминокислотами . Есть , двадцать различных аминокислот на выбор, например, двадцать бусинок разной формы, которые можно нанизать на нитку одну за другой в любом порядке.
Чтобы получить от 4 букв в генетическом алфавите до двадцати аминокислот на выбор в мире, производящем белки, наши клетки имеют правило, согласно которому ДНК интерпретируется трехбуквенными фрагментами. Например, C сам по себе ничего не значит, как и CA. Но CAG — это инструкция по добавлению строительного блока под названием глютамин к строящемуся белку.
Из-за всего этого существует прямое соответствие между количеством повторов CAG в гене HD и количеством глутаминов в образующемся белке, называемом Huntingtin .Тот, кто унаследовал 42 повторения CAG от своего родителя, пораженного HD, должен производить белки HD с 42 последовательными глутаминами. Мы думаем, что именно поэтому более крупные повторы CAG вызывают более раннее проявление симптомов HD: большее количество CAG в гене означает больше глутаминов в белке. Мы не знаем, как именно, но это кажется ясным.
Хорошо, достаточно просто. ДНК интерпретируется тремя буквами за раз, чтобы построить белки. Каждый CAG в гене вызывает добавление одного глутамина к белку. А еще глутамины — это плохо!
При таком чтении ДНК по три буквы за раз возникает загвоздка: существует больше трехбуквенных комбинаций, чем нам нужно.На самом деле существует шестьдесят четыре комбинации, но только двадцать различных аминокислот.
У большинства людей тракт CAG в гене HD содержит один «CAA». Иногда он отсутствует или имеется два CAA. Оказывается, эти маленькие причуды гораздо важнее, чем мы думали.Таким образом, многие аминокислоты имеют множественных трехбуквенных генетических кодов , в результате чего один и тот же код добавляется к растущему белку. Для глутамина — важной аминокислоты в HD — CAG — самая известная трехбуквенная последовательность, которая соответствует глутамину, но CA A делает то же самое, работая так же хорошо, как CAG, как инструкция по добавлению глутамина к белок.
Это имеет значение, потому что тщательное исследование показывает, что у подавляющего большинства людей CAA и CAG и встречаются близко друг к другу в гене HD. То, что мы часто называем «трактом CAG» гена HD, обычно также включает одно прерывание «CAA». Поскольку и CAG, и CAA соответствуют глутамину, это не казалось особенно важным, и до сих пор исследователи не уделяли особого внимания этой маленькой детали.
Посмотрим, отличаетесь ли вы! Можете ли вы найти прерывание CAA в этом тракте CAG?
CAG-CAG-CAG-CAG-CAG-CAG-CAG-CAG-CAG-CAG-CAG-CAG-CAG-CAG-CAG-CAG-CAG-CAG-CAG-CAG-CAG-CAG-CAG-CAG-CAG -CAG-CAG-CAG-CAG-CAG-CAG-CAG-CAG-CAG-CAG-CAG-CAG-CAG-CAG-CAG-CAA-CAG.
Вы его поймали? Это как раз перед финальным CAG.
Когда члены семьи HD проходят генетический тест, чтобы определить, предрасположены ли они к развитию HD, лаборатория измеряет то, что мы называем их размером CAG . Но из-за особенностей способа проведения теста он не может уловить эти небольшие прерывания CAG.
Это потому, что тест на самом деле не считывает генетическую информацию напрямую. Вместо этого точно измеряется длина участка ДНК , содержащего тракт CAG.Это говорит нам о размере тракта CAG — но, что особенно важно, , а не , содержит ли он то прерывание CAA непосредственно перед концом.
До сих пор у нас не было никаких причин для беспокойства по этому поводу, но новые данные предполагают, что нам, вероятно, следует обратить внимание на фактическую последовательность этого региона.
Совсем недавно несколько групп по всему миру наблюдали очень удивительную вещь. Во-первых, консорциум GEM-HD, ранее освещавшийся на HDBuzz, — это группа исследователей, заинтересованных в понимании того, какие генетические различия у пациентов с HD способствуют возникновению или прогрессированию симптомов.
Новая публикация группы GEM-HD описывает анализ более 9000 пациентов с HD, участвующих в исследовании ENROLL-HD. Этот анализ показал, что при нормальном прерывании CAA около конца CAG-тракта гена HD иногда отсутствовал . Это происходило примерно один раз на триста человек.
Люди, у которых не было этого прерывания и, следовательно, имели только «чистые» CAG в их гене HD, имели значительно более раннее начало симптомов HD, чем мы предполагали.
Отсутствие прерывания CAA может влиять на прогрессирование HD, затрудняя точную репарацию ДНК клетками, что позволяет CAG-тракту гена HD вырасти еще больше в некоторых клетках.В то же время группа обнаружила еще одну очень редкую вариацию, которая, по-видимому, показывала напротив , а на самом деле задерживала появление симптомов. Эта причуда была замечена примерно у одного из ста человек. У этих людей на самом деле было , два прерывания CAA в их CAG-тракте, а не более распространенное одиночное CAA.
Эффекты этих двух редких генетических вариаций рассказывают очень убедительную, хотя и очень удивительную историю. Увидев и плохую, и хорошую версию вариации, можно предположить, что этот эффект реален. Это также означает, что большая часть различий, которые мы наблюдаем между пациентами с HD, может зависеть не от длины длины CAG, а от того, насколько она «прервана».
Что пугает в этом, так это то, что независимо от того, есть ли в гене HD CAA или CAG, клетка будет вырабатывать один и тот же белок, добавляя один и тот же строительный блок глутамина.Но если белок — плохой парень, как до сих пор считают большинство исследователей, то почему имеет значение, происходит ли этот глютамин из CAA или CAG в гене ?! Мы скоро вернемся к этому.
Как и любой другой предмет науки, это открытие необходимо повторить и подтвердить. Но если оно окажется правильным, это окажет очень важное влияние на то, как мы думаем о HD.
К счастью, нам не пришлось долго ждать подтверждения, потому что другое исследование, проведенное Майклом Хайденом из Университета Британской Колумбии, было опубликовано одновременно с исследованием GEM-HD.Это было полностью независимое расследование, проведенное в лаборатории Хайдена, где хранится очень большой банк образцов ДНК из семей HD.
Исследователи UBC обнаружили шестнадцать человек, у которых повторение CAG отсутствовало, что прерывание CAA. У этих людей симптомы БГ развились немного раньше, чем можно было бы ожидать — возможно, на несколько десятилетий раньше, если судить по их традиционно измеряемому размеру CAG.
Затем они исследовали, насколько распространена потеря повтора в уникальной популяции носителей мутации HD.
У некоторых людей, которые наследуют размер CAG от 36 до 38, развивается HD, но другие доживают до старости без каких-либо симптомов. База данных Хайдена семейной ДНК HD включает 45 человек, унаследовавших размер CAG 36, 37 или 38. Пятнадцать из этих людей уже имели симптомы HD, а тридцать нет. И что удивительно, среди людей с этими очень низкими размерами CAG и HD симптомами у большинства из них отсутствовало прерывание CAA .
Помните, что в целом отсутствие CAA очень редко — поэтому тот факт, что у многих людей с коротким числом CAG и симптомами HD он отсутствует, очень маловероятен.Это явно означает, что отсутствие CAA каким-то образом ускоряет наступление HD.
То, что две известные исследовательские группы делают одновременные открытия, это действительно захватывающе. Это говорит о том, что нам нужно немного по-другому подумать о том, как работает HD.
Помните, что CAG и CAA в гене инструктируют клетки о добавлении глутамина при построении белка. Это означает, что для любой данной длины белок хантингтин полностью идентичен, независимо от того, имеет ли тракт CAG прерывание CAA или нет.
Эти революционные открытия, возможно, были сделаны тысячами членов семьи HD, которые вызвались принять участие в исследовательских проектах. Текущие крупные исследования, такие как Enroll-HD и HDClarity, остаются невероятно ценными источниками научного прогресса в области HD.По логике вещей, объяснение должно лежать в ДНК, а не в белке — и это, вероятно, связано с любопытной тенденцией CAG-трактов к разрастанию со временем в определенных клетках.
Мы знаем, что после смерти в мозгу пациентов с болезнью Гентингтона содержатся некоторые клетки с гораздо большим количеством CAG, чем ожидалось, по сравнению с длиной CAG, измеренной в анализах крови, сделанных при их жизни.Пока неясно, почему, но данные недавних генетических исследований показывают, что это связано с тем, что длинные участки повторяющейся ДНК трудно восстанавливать, когда они повреждаются.
Наша ДНК часто изнашивается под воздействием УФ-излучения. Это время от времени вызывает небольшие порезы и разрывы, и у наших клеток есть целый набор механизмов для устранения этих повреждений, чтобы предотвратить вредные изменения в наших генах.
Кажется, что длинный отрезок CAG сбивает оборудование с толку, и иногда в процессе ремонта добавляются дополнительные CAG.Это удлинение CAG действительно вызывает выработку белка с большим количеством глутаминов, что, как ожидается, будет более вредным.
Возможно, но еще не доказано, что присутствие прерывания CAA среди CAG упрощает для механизма репарации ДНК более точное выполнение своей работы, возможно, за счет того, что две нити ДНК лучше выстраиваются в линию при возникновении разрывов. или давая ремонтному оборудованию что-нибудь, за что можно ухватиться. И когда CAA отсутствует, кажется, что удлинение тракта CAG более вероятно.В конечном итоге это означает, что некоторые клетки будут производить белки хантингтина с большим количеством глутаминов, которые более вредны.
Важно отметить, что это расширение не обязательно будет обнаруживаться путем измерения тракта CAG в клетках крови. Могут быть просто люди с, скажем, 44 CAG в анализе крови, у которых есть клетки мозга с гораздо более длинными повторами, потому что их ДНК сложнее точно восстановить. У других с числом CAG 44 не было бы большого расширения CAG в головном мозге. И эта разница между людьми может быть связана с наличием или отсутствием прерывания CAA.
На данный момент это исследование является всего лишь научным открытием. Это необычайно достоверный результат, поскольку о нем независимо друг от друга сообщили две разные исследовательские группы. Фактически, надежный источник сообщает нам, что третья основная группа также воспроизвела финансирование в другой когорте пациентов и имеет дополнительные данные, чтобы конкретизировать результаты. Работа этой группы отправлена для публикации в научный журнал и в настоящее время проходит экспертную оценку.
Последовательность изменений. Исследователи обнаружили, что изменение возраста появления симптомов HD действительно редко — только очень небольшое количество членов семьи HD имеют их.Вот почему потребовался пул из тысяч образцов ДНК от пациентов с HD, чтобы их вообще найти.
В будущем, когда мы лучше поймем эти изменения, возможно, потребуется обновить процедуры генетического тестирования, включив в них секвенирование трактов CAG по одной букве за раз, а не просто измерение длины. Но на данный момент наиболее важным результатом этого исследования является то, что оно отправляет исследователей обратно в лабораторию, чтобы лучше понять влияние этих маленьких генетических причуд. Хотя неясно, что мы найдем, мы знаем, что это исследование помогает нам лучше понять HD и может указать на новые подходы к лечению.
Эти новые результаты действительно показывают ценность участия в исследовании семей HD. Ни один из тысяч людей, предоставивших свою ДНК и другую информацию, не знал, что эти важные результаты появятся. Только участвуя в таких исследованиях, как ENROLL-HD, мы можем подготовить почву для действительно неожиданных открытий, подобных этим.
Глютамин связывает ожирение с воспалением в белой жировой ткани человека
Основные моменты
- •
Уровни глютамина в жировой ткани человека обратно пропорциональны жировой массе и воспалению
- •
Глютамин
ослабляет воспаление у мышей •
Высокий уровень глютамина снижает гликолиз и воспаление в жировых клетках человека in vitro
- •
Ядерный O-GlcNAцилирование связывает глутамин с воспалением в жировой ткани
Резюме
При ожирении возникают осложнения и связанные с ними метаболические осложнения. связанные с воспалением белой жировой ткани (WAT), причинные факторы остаются неясными.Мы предположили, что местная метаболическая среда может быть важным фактором. С этой целью мы сравнили метаболиты, высвобождаемые из WAT у 81 женщины с ожирением и без ожирения. Это выявило, что глютамин подавляется при ожирении и обратно связан с пагубным фенотипом WAT. Введение глутамина in vitro, и in vivo, ослабляло уровни провоспалительного гена и белка в адипоцитах, а также инфильтрацию WAT и макрофагами в WAT. Метаболомический и биоэнергетический анализ адипоцитов человека показал, что глутамин ослабляет гликолиз и снижает уровни N-ацетилглюкозамина дифосфата уридина (UDP-GlcNAc).UDP-GlcNAc является субстратом для посттрансляционной модификации O-связанного β-N-ацетилглюкозамина (O-GlcNAc), опосредованного ферментом O-GlcNAc трансферазой. Функциональные исследования адипоцитов человека установили механистическую связь между сниженным уровнем глутамина, O-GlcNA-цилированием ядерных белков и провоспалительным ответом транскрипции. В целом метаболизм глутамина связан с воспалением WAT при ожирении.
Ключевые слова
адипоцит
лейкоцит
макрофаг
воспаление
ожирение
эпигенетика
метаболомика
адипокин
Inc.
Рекомендуемые статьи
Ссылки на статьи
Функция глутамина и дозировка | Integrative Therapeutics
Глютамин является условно незаменимой аминокислотой, и эндогенного производства глутамина обычно достаточно для удовлетворения физиологических потребностей, за исключением периодов метаболического стресса. 1,2 Пероральный прием глютамина может поддерживать статус глутамина или повышать его уровень в терапевтических целях. Дозировка глутамина широко варьируется в зависимости от клинических испытаний и на практике.В этой статье освещаются некоторые варианты дозирования глутамина, а также функции и риски различных протоколов дозирования.
Глютаминовая функция
Глютамин служит основным источником энергии для лимфоцитов и энтероцитов. * 3 Следовательно, он является основным питательным веществом, поддерживающим как иммунную систему, так и здоровье желудочно-кишечного тракта. * В желудочно-кишечном тракте глютамин не только питает энтероциты, но и помогает поддерживать физическую активность соединения, поддерживающие целостность барьерной функции кишечника.* 4,5 Глютамин является предшественником нуклеотидов в синтезе ДНК и предшественником глутатиона. 6,7
Повышенная потребность в глутамине
Потребность в глютамине увеличивается, когда организм находится в состоянии физического или даже эмоционального стресса. Избыток кортизола, связанный со стрессом, приводит к выработке цитокинов, усилению окислительного стресса и повышению потребности в глутатионе, что эффективно истощает запасы эндогенного глютамина. Упражнения на выносливость, продолжающиеся более 2 часов, снижают уровень глутамина в сыворотке и потенциально повреждают лимфоциты, которые зависят от глутамина для получения энергии. 8 Глютамин может быть более востребован у любого человека с нарушенной функцией кишечного барьера. * Наконец, люди, соблюдающие низкобелковую или веганскую диету, могут иметь повышенную потребность в добавках глютамина.
Дозирование: исследования эффективности
Исследования показывают, что глутамин одинаково биодоступен как свободный глютамин в форме добавок, так и как часть полноценного белка. 9 Также было подтверждено, что пероральные добавки с глутамином действительно повышают уровень глутамина в плазме. 10
Во многих клинических испытаниях глутамин дозировался в количествах, измеряемых в мг / кг массы тела. Дозировка 500 мг / кг (34 грамма для человека весом 150 фунтов) улучшила кишечный барьер и другие ситуационные эффекты. * 11,12 Дозировка 80 мг / кг (5,4 грамма для человека весом 150 фунтов) эффективно поддерживала подобласть предметов во время упражнения. * 13
Наиболее типичные дозы, используемые в клинической практике, составляют от 5 до 30 граммов в день.
Дозирование: исследования безопасности
Есть некоторые опасения, что длительное дозирование глутамина может привести к увеличению сывороточного аммиака, как это наблюдалось в педиатрическом исследовании при дозировке 750 мг / кг (51 грамм для человека весом 150 фунтов). 14 Также были высказаны опасения по поводу способности глутамина проникать в нейроны и превращаться в глутамат с помощью глутаминазы. Это наводит на мысль о том, что следует проявлять осторожность у людей с заболеваниями, связанными с неврологической системой. Доказательств того, что пероральный глутамин нейротоксичен, мало, и важно отметить, что накопление глутамина за пределами нервной системы не является проблемой безопасности. Остается либо теоретическая проблема, либо неопубликованный анекдотический опыт.
Наивысшие пероральные дозы, которые оценивались в клинических испытаниях, составляют от 50 до 60 граммов глутамина в день. Рандомизированное контролируемое исследование продемонстрировало безопасность однократной дозы 50 граммов глутамина, и никаких побочных эффектов не наблюдалось при дозировке глутамина от 50 до 60 граммов в день в течение нескольких недель. 15,16
«Наблюдаемый предел безопасности» для глутамина установлен на уровне 14 граммов в день, а это означает, что прием этого количества в течение длительного времени считается безопасным без каких-либо побочных эффектов. 17
ССЫЛКИ
- Ким Х. Йонсей Мед Дж. 2011; 52 (6): 892-7.
- Мешки GS. Nutr Clin Pract. 2011; 26 (1): 44-7.
- Souba WW. Анну Рев Нутр. 1991; 11285-308.
- душ Сантуш Р., Виана М.Л., Дженерозо С.В. и др. JPEN J Parenter Enteral Nutr. 2010; 34 (4): 408-13.
- Peng Z, Ban K, Sen A, et al. Шок. 2012; 38 (1): 57-62.
- Wessner B, Strasser EM, Spittler A, Roth E. Clin Nutr. 2003; 22 (6): 515-22.
- Глисон М.J Nutr. 2008; 138 (10): 2045С-9С.
- Cury-Boaventura MF, Levada-Pires AC, Folador A, et al. Eur J Appl Physiol. 2008; 103 (3): 289-94.
- Boza JJ, Dangin M, Moënnoz D, et al. Am J PhysiolGastrointest Liver Physiol. 2001; 281 (1): G267-74.
- Khogali SE, Pringle SD, Weryk BV, Rennie MJ. Питание. 2002; 18 (2): 123-6.
- Бенджамин Дж., Махария Дж., Ахуджа В. и др. Dig Dis Sci. 2012; 57 (4): 1000-12.
- Sufit A, Weitzel LB, Hamiel C, et al.
Добавить комментарий