Мальтодекстрин е 459: b-циклодекстрин

Мальтодекстрин, патока, подсластитель, повысить вязкость, добавка в пряники, добавка в торты, добавка в хлеб, добавка в мороженое, добавка в консервы, добавка для пива, добавка в спортивном питании, добавка для карамели, добавка для мармелада, Е459

Пищевые добавки применяются для производства продуктов питания в промышленных условиях.
Благодаря им можно придать изделиям следующие характеристики: увеличить сроки хранения, усилить вкус, стабилизировать нестабильные эмульсии, добавить вкус сладкого без сахара, окрасить в любой цвет, ароматизировать.

 

Па́тока (декстринмальтоза, мальтодекстрин) — продукт неполного кислотного (разбавленными кислотами) или ферментативного гидролиза крахмала. Образуется как побочный продукт при производстве сахара и крахмала. Выделяется два основных вида патоки — белая патока (крахмальная, из кукурузного, картофельного и другого крахмала), и меласса, черная патока (свекло-сахарная).[1][2]. В чистом виде крахмальная патока не имеет цвета. По консистенции она похожа на молодой жидкий мёд[1]. Химический состав: • декстрин — от 0 % до 70 % • глюкоза — от 0 % до 50 % • мальтоза — от 19 % до 85 % Часто под патокой подразумеваются различные сахаросодержащие сиропы, в том числе тёмную патоку (мелассу) и светлую патоку(англ. Golden syrup), вид инвертного сахара, а также такие виды крахмальной патоки, как глюкозный сироп (англ. glucose syrup), мальтозный сироп, крахмальный сироп и кукурузный сироп[3]. В бытовом понимании под патокой могут подразумеваться разные виды сиропов, не обязательно полученные в результате гидролиза крахмала. Широко употребляется в выпечке, и, выступая как подсластитель, в то же время влияет на текстуру выпечки, делает её нежнее и пышнее[4]. В зависимости от углеводного состава может применяться в разных отраслях пищевой промышленности и в непищевом производстве. Патока используется в кондитерском и консервном производствах, пивоварении, а также в спортивном питании и для производства аппретов. Патока востребована кондитерской промышленностью при изготовлении пряников и некоторых сортов хлеба. При добавлении в малых количествах определяет цвет, а в бо́льших количествах — вкус и вязкость изделий из теста. Благодаря способности замедлять кристаллизацию сахарозы[2] распространено использование патоки при производстве кондитерских изделий: варенья, джема, карамели, зефира, пастилы, в особенности же — помады и мармелада. Отдельные виды патоки используются при производстве мороженого и замороженных десертов, для понижения точки замерзания продукта. Фасовка 1 кг, 25 кг Расфасовано MultiChem.

бензоат, бензоат натрия, бензоат натрия порошок, бензоат натрия гранула, бензоат консервант, бензойная, бензойная кислота, бензоат купить, бензоат цена, бензоат натрия цена, бензоат натрия купить, бензоат натрия применение, бензоат натрия для, консервант пищевой, консервант для бойлов, консервант для вин, консервант для напитков, консервант для тортов, консервант для конфет, консервант для кондитерских, консервант для рыбы, консервант для сыра, консервант для молока, сорбат, сорбат калия, сорбат калия цена, сорбат калия купить, сорбат калия для, сорбат калия консервант, сорбат калия в кондитерской, консервант пресервов, сорбиновая кислота, сорбиновая, сорбиновая кислота цена, сорбиновая кислота купить, сорбиновая кислота консервант, аскорбиновая кислота, аскорбиновая, аскорбиновая кислота купить, аскорбиновая кислота цена, подкислитель, подкислитель пищевой, регулятор кислотности, аскорбиновая кислота консервант, ацетат кальция, ацетат кальция цена, ацетат кальция купить, консервант муки, картофельная палочка, консервант картофельной палочки, консервант хлеба, консервант булочек, консервант мучных, консервант сдобы, молочная кислота, молочная кислота купить, молочная кислота цена, молочная кислота для, янтарная кислота, янтарная кислота купить, янтарная кислота цена, лимонная кислота, лимонная кислота цена, лимонная кислота купить, лимонная кислота фасовка, уксус, уксусная кислота, уксус цена, уксус купить, уксусная ледяная, уксусная кислота цена, уксусная кислота купить, сода пищевая, сода пищевая цена, сода пищевая купить, бикарбонат натрия, гидрокарбонат натрия, бикарбонат натрия цена, гидрокарбонат натрия цена, бикарбонат натрия купить, гидрокарбонат натрия купить, камедь гуара, камедь ксантана, желатин, агар-агар, пектин, крахмал, крахмал модифицированный, мальтодекстрин, сахарин, цикламат, ацесульфам, аспартам, глютамат натрия, усилитель вкуса, пищевый красители, пищевой краситель, тартразин, индигокармин, понсо, азорубин, диоксид титана пищевой, камедь гуара купить, камедь ксантана купить, желатин купить, агар-агар купить, пектин купить, крахмал купить, крахмал модифицированный купить, мальтодекстрин купить, сахарин купить, цикламат купить, ацесульфам купить, аспартам купить, глютамат натрия купить, усилитель вкуса купить, пищевый красители купить, пищевой краситель купить, тартразин купить, индигокармин купить, понсо купить, азорубин купить, диоксид титана пищевой купить, камедь гуара цена, камедь ксантана цена, желатин цена, агар-агар цена, пектин цена, крахмал цена, крахмал модифицированный цена, мальтодекстрин цена, сахарин цена, цикламат цена, ацесульфам цена, аспартам цена, глютамат натрия цена, усилитель вкуса цена, пищевый красители цена, пищевой краситель цена, тартразин цена, индигокармин цена, понсо цена, азорубин цена, диоксид титана пищевой цена, бензоат, бензоат натрію, бензоат натрію порошок, бензоат натрію гранула, бензоат консервант, бензойна, бензойна кислота, бензоат купити, бензоат ціна, бензоат натрію ціна, бензоат натрію купити, бензоат натрію застосування, бензоат натрію для, консервант харчової, консервант для бойлов, консервант для вин, консервант для напоїв, консервант для тортів, консервант для цукерок, консервант для кондитерських, консервант для риби, консервант для сиру, консервант для молока, сорбат, сорбат калію, сорбат калію ціна, сорбат калію купити, сорбат калію д я, сорбат калію консервант, сорбат калію в кондитерській, консервант пресервів, сорбінова кислота, сорбінова, сорбінова кислота ціна, сорбінова кислота купити, сорбінова кислота консервант, аскорбінова кислота, аскорбінова, аскорбінова кислота купити, аскорбінова кислота ціна, підкислювач, підкислювач харчової, регулятор кислотності, аскорбінова кислота консервант, ацетат кальцію, ацетат кальцію ціна, ацетат кальцію купити, консервант борошна, картопляна паличка, консервант картопляної палички, консервант хліба, консервант б вуличок, консервант борошняних, консервант здоби, молочна кислота, молочна кислота купити, молочна кислота ціна, молочна кислота для, бурштинова кислота, бурштинова кислота купити, бурштинова кислота ціна, лимонна кислота, лимонна кислота ціна, лимонна кислота купити, лимонна кислота фасування, оцет , оцтова кислота, оцет ціна, оцет купити, оцтова крижана, оцтова кислота ціна, оцтова кислота купити, сода харчова, сода харчова ціна, сода харчова купити, бікарбонат натрію, гідрокарбонат натрію, бікарбонат натрію ціна, гідрокарбонат натри ціна, бікарбонат натрію купити, гідрокарбонат натрію купити, камедь гуара, камедь ксантану, желатин, агар-агар, пектин, крохмаль, крохмаль модифікований, мальтодекстрин, сахарин, цикламат, ацесульфам, аспартам, глютамат натрію, підсилювач смаку, Харчові барвники, харчовий барвник , тартразин, індигокармін, понсо, азорубін, діоксид титану харчовий, камедь гуара купити, камедь ксантану купити, желатин купити, агар-агар купити, пектин купити, крохмаль купити, крохмаль модифікований купити, мальтодекстрин купити, сахарин купити, цикламат купить ь, ацесульфам купити, аспартам купити, глютамат натрію купити, підсилювач смаку купити, харчові барвники купити, харчовий барвник купити, тартразин купити, індигокармін купити, понсо купити, азорубін купити, діоксид титану харчової купити, камедь гуара ціна, камедь ксантану ціна, желатин ціна, агар-агар ціна, пектин ціна, крохмаль ціна, крохмаль модифікований ціна, мальтодекстрин ціна, сахарин ціна, цикламат ціна, ацесульфам ціна, аспартам ціна, глютамат натрію ціна, підсилювач смаку ціна, харчові барвники ціна, харчовий барвник ціна, тартразін ціна, індигокармін ціна, понсо ціна, азорубін ціна, діоксид титану харчовий ціна

E459 – Бета-Циклодекстрин | Добавкам.нет

Бета-Циклодекстрин (добавка Е459) органическое вещество, входящее в группу циклодекстринов — углеводов, получаемых из крахмала методом ферментации.

Впервые циклодекстрины были открыты в 1891 году М. Вилльером. Ученый исследовал продукты метаболизма бактерий Clostridium butyricum, и впервые получил данное вещество. Тогда он определил, что это были кристаллические углеводы и дал веществу название «целлюлозин».

Однако наибольший вклад в исследование циклодекстринов сделал Ф. Шардингер в 1903 — 1911 годах. Именно в его честь циклодекстрины долгое время назывались декстринами Шардингера.

Существует три основных типа циклодекстринов, различающихся по количеству остатков глюкозы, которые содержатся в одной их молекуле:

• α-циклодекстрин — содержит 6 глюкопиранозных звеньев;
• β-циклодекстрин содержит 7 остатков глюкозы;
• γ-циклодекстрин — 8 звеньев.

Именно β-циклодекстрин (бета-циклодекстрин) и применяется в пищевой промышленности в качестве добавки-эмульгатора с маркировкой Е459.

Данная добавка имеет довольно слабую растворимость в воде — порядка 1,85 г / 100 мл при температуре 25 °С. При температуре выше 300 °С добавка разлагается на более простые вещества. По своим физическим свойствам бета-циклодекстрин представляет белый кристаллический порошок, который не имеет выраженного запаха и обладает слегка сладковатым вкусом.

Добавка Е459 применяется в пищевой промышленности для сохранения свойств ароматизаторов, витаминов, специй и других пищевых компонентов.

Бета-циклодекстрин может маскировать горечь и неприятный запах пищевых продуктов как-бы обволакивая молекулы, образующиеся при распаде продуктов питания.

Кроме этого, добавка E459 применяется для улучшения растворимости в воде веществ с низкой растворимостью, а также преобразования в сухую форму изначально жидких веществ.

Еще одной интересной сферой применения бета-циклодекстрина является производство продуктов без холестерина. Молекулы холестерина обволакиваются кольцами циклодекстрина, после чего данные кольца удаляются на этапе производства конечного продукта..

Благодаря довольно низкой себестоимости производства, бета-циклодекстрин, как и остальные типы циклодекстринов применяется все в больших масштабах, а мировое производство данных соединений оценивается десятками тысяч тонн в год.

Кроме пищевой промышленности, циклодекстрины применяются в самых различных отраслях: в фармацевтике, косметической и текстильной промышленности, в процессах очистки воды и многих других.

Так, например, в зубных пастах, ополаскивателях, дезодорантах и других косметических средствах циклодекстрины применяются для поглощения неприятного запаха. С этой же целью добавка Е459 используется и в жевательной резинке. Данная добавка, в отличие от ароматизаторов именно поглощает запах, а не маскирует его.

Бета-циклодекстрин зарегистрирован в качестве пищевой добавки E459 и входит в список разрешенных добавок во многих странах. Разрешена данная добавка и в Российской Федерации.

Бета-циклодекстрин признан безопасной пищевой добавкой и в США. Такое заключение на добавку Е459 выдала организация «FDA» (Food and Drug Administration — управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов).

В то же время, из-за недостаточных исследований, стабилизатор-эмульгатор Е459 не включен в список разрешенных пищевых добавок в Украине.

Е-459 Мальтодекстрин 100гр цена | Мультичем ibud.ua

Па́тока (декстринмальтоза, мальтодекстрин) — продукт неполного кислотного (разбавленными кислотами) или ферментативного гидролиза крахмала. Образуется как побочный продукт при производстве сахара и крахмала. Выделяется два основных вида патоки — белая патока (крахмальная, из кукурузного, картофельного и другого крахмала), и меласса, черная патока (свекло-сахарная).[1][2].

В чистом виде крахмальная патока не имеет цвета. По консистенции она похожа на молодой жидкий мёд[1]. Химический состав:

• декстрин — от 0 % до 70 %

• глюкоза — от 0 % до 50 %

• мальтоза — от 19 % до 85 %

Часто под патокой подразумеваются различные сахаросодержащие сиропы, в том числе тёмную патоку (мелассу) и светлую патоку(англ. Golden syrup), вид инвертного сахара, а также такие виды крахмальной патоки, как глюкозный сироп (англ. glucose syrup), мальтозный сироп, крахмальный сироп и кукурузный сироп[3]. В бытовом понимании под патокой могут подразумеваться разные виды сиропов, не обязательно полученные в результате гидролиза крахмала.

Широко употребляется в выпечке, и, выступая как подсластитель, в то же время влияет на текстуру выпечки, делает её нежнее и пышнее[4]. В зависимости от углеводного состава может применяться в разных отраслях пищевой промышленности и в непищевом производстве.

Патока используется в кондитерском и консервном производствах, пивоварении, а также в спортивном питании и для производства аппретов.

Патока востребована кондитерской промышленностью при изготовлении пряников и некоторых сортов хлеба. При добавлении в малых количествах определяет цвет, а в бо́льших количествах — вкус и вязкость изделий из теста. Благодаря способности замедлять кристаллизацию сахарозы[2] распространено использование патоки при производстве кондитерских изделий: варенья, джема, карамели, зефира, пастилы, в особенности же — помады и мармелада. Отдельные виды патоки используются при производстве мороженого и замороженных десертов, для понижения точки замерзания продукта.

Фасовка 1 кг, 25 кг

Расфасовано MultiChem.

Пищевые добавки: халяль или харам?

Пищевые добавки могут быть растительного, животного или минерального происхождения. Также существуют синтетические добавки. Их сознательно вводят в состав продуктов питания, что служит достижению специальных технологических целей, о чем потребитель, как правило, даже не подозревает.

Всемирная Организация Здравоохранения предложила классификацию добавок по 3 группам в зависимости от их функций: 1. Вкусоароматические добавки вводятся в продукты питания для улучшения их аромата или вкуса. Они являются наиболее многочисленной группой добавок, применяемых в пищевой промышленности и используются при производстве широкого спектра продуктов питания, от кондитерских изделий и безалкогольных напитков до злаковых хлопьев, пирожных и йогурта. К натуральным вкусоароматическим добавкам относятся, например, смеси из орехов, фруктов или специй, а также добавки, изготовленные из овощей или вина. Кроме того, существуют вкусоароматические добавки, имитирующие натуральные вкус и аромат.

2. Ферментные препараты – это добавки, которые могут присутствовать или не присутствовать в конечном продукте. Ферменты – это природные белки, которые ускоряют биохимические реакции путем дробления более крупных молекул на составные части меньшего размера. Их выделяют из растительного или животного сырья или из микроорганизмов, например бактерий, и используют в качестве альтернативы химическим катализаторам. Главным образом, они используются в хлебопечении (для улучшения свойств теста), в производстве фруктовых соков (для повышения выхода продукта), в виноделии и пивоварении (для улучшения процесса ферментации), а также в сыроделии (для улучшения свертываемости молока).

3. Существуют и другие типы пищевых добавок, используемых в разных целях, которые добавляются на разных этапах в процессе приготовления, упаковки, перевозки или хранения продуктов питания.

Консерванты замедляют разложение продуктов питания под действием плесени, воздуха, бактерий или дрожжей. Кроме сохранения качества пищевых продуктов консерванты помогают бороться с их заражением болезнетворными микроорганизмами, способными вызывать различные болезни пищевого происхождения.

Красители вводят в состав продуктов питания для возвращения им цвета, утраченного в процессе приготовления, или для придания более привлекательного внешнего вида.

Подсластители, не являющиеся сахарами, часто применяются в качестве альтернативы сахару, поскольку они обладают низкой или нулевой энергетической ценностью.
По словам управляющего партнера выставки Halfood Мадины Калимуллиной, сегодня на российском рынке имеется широкий ассортимент продукции халяль среди мяса птицы (курица, индейка), колбасных изделий, полуфабрикатов (пельмени, манты, хинкали), молочной продукции (кефир, молоко, сгущенка, сметана, йогурты, мороженое и пр.). Также имеются бренды более ориентированные на эко-формат – это финики, урбеч, сладости и пр.

Самые вредные пищевые добавки назвали медики

Специалисты также указали, в каких популярных продуктах их больше всего содержится.

К списку опасных для здоровья пищевых добавок (усилителей вкуса и запаха, красителей, консервантов и так деле) отнесено большинство добавок, обозначаемых кодом Е. Таких добавок сейчас известно несколько сотен, сообщает profilaktica.ru

К примеру, большое количество Е-добавок содержат йогурты. В состав этой продукции входит Е1442 (модифицированный крахмал) — стабилизатор вязкости в молочных продуктах, очень опасный для поджелудочной железы. Есть в йогуртах Е330 (Лимонная кислота) — антиоксидант, способный вызывать аллергические реакции.

Картошка-фри содержит такое количество добавок, что становится испытанием даже для совершенно здорового человека. В составе картофеля-фри есть E459 (Мальтодекстрин, циклодекстрин) — генетически модифицированный стабилизатор вкуса. Присутствует в нем Е576 (Глюконат Натрия) — усилитель вкуса, вызывающий головную боль, покраснение лица и повышенное потоотделение. Содержится в этом продукте Е551 (Диоксид кремния) — средство против слёживания. Это средство, кстати, успешно применяется в промышленности при создании резины или бетона. Степень вреда, которую это вещество наносит организму, до конца учеными еще не установлена.

Е-добавки присутствуют в мороженом. В нем есть красители Е102 (Тартразин —вызывающий мигрень, зуд, нарушения зрения, раздражительность и нарушение сна) и Е133 (Синий блестящий FCF, являющийся канцерогеном). Присутствуют стабилизаторы Е407 (Каррагинан — вещество, вызывающее расстройства пищеварения), Е410 (Камедь рожкового дерева — вещество для сохранения различных вкусов и ароматов, вызывающее болезни печени, почек), Е412 (Гуаран — крайне токсичное вещество-структуратор, способное в некоторых случаях вызвать различные аномалии организма, искалечить и даже обезобразить человека).

Много вредных Е-добавок в газированных напитках, например, в Коле. В ней содержатся сахарозаменители E950 (ухудшающий работу сердца), E951 и E952, являющиеся опасными канцерогенами. Присутствуют также E338 (ортофосфорная кислота, ведущая к ослаблению костей) и Е211 (бензоат натрия — канцероген, провоцирующий цирроза печени и дегенеративных заболеваний.

Напичкан Е-добавками плавленый сыр, в котором есть соли-стабилизаторы Е450, вызывающий оседание в почках кальция и фосфора, Е452, провоцирующий расстройство пищеварения.

В соевом соусе обнаружены опасные добавки Е1422 (мод. крахмал), Е260 (уксусная кислота), Е330 (лимонная кислота), усилители вкуса Е621, Е627, Е631, консерват Е211 (Бензоат натрия), красители Е110, Е124 (опасны для здоровья), а также особо опасные сахарозаменители Е950 и Е951.

И наконец в сухариках и чипсах присутствуют Е621 (Глутамат натрия — опасный аллерген),

Е631 (Инозинат натрия двузамещенный, нарушающий нормальное артериальное давление), а также усилители вкуса (E-621, E-627, E-631и другие) и стабилизатор Е471.

Чтобы хоть как-то оградить свой организм от возможных проблем, связанных с употреблением консервантов и усилителей вкуса, медики советуют отдавать предпочтение свежим сырым овощам, фруктам и ягодам. Если же это по какой-либо причине затруднительно, то хотя бы отказываться от продуктов большим сроком хранения, поскольку это признак содержания в них всевозможной химии.

Напомним, ранее «Живая Кубань» называла самые вредные приправы, рассказывала об опасности соли, чрезмерное потребление которой напрямую связано с  повышенным риском смерти, а также рассказывала о том, какие продукты нельзя давать детям, и о том, почему не стоит пить растворимый кофе.

Мальтодекстрин что это такое, польза и вред, состав. КондиPro.

Мальтодекстрин входит в состав многих продуктов, но мнения о его пользе и безопасности в разных источниках расходятся. Давайте разберемся: мальтодекстрин – что это такое, из чего он состоит, зачем нужен в продуктах и какое влияние оказывает на организм человека.

Описание продукта

Мальтодекстрин – это углевод, близкий по своим свойствам к крахмалу и глюкозе. Изготавливается из кукурузного, рисового, пшеничного или картофельного крахмала путем его гидролиза с помощью ферментов или кислот. Хорошо растворяется в воде.
Состав мальтодекстрина: молекулы мальтозы, глюкозы, мальтодекстрозы и декстрина.
Гликемический индекс – от 105 до 135.
Форма выпуска: белый или кремово-белый порошок, без вкуса или с умеренно-сладким вкусом.

Использование мальтодекстрина в пищевой промышленности

В пищевой промышленности мальтодекстрин, состав которого содержит глюкозу, используют в качестве:

• подсластителя,
• загустителя,
• антиокислителя,
• поглотителя влаги,
• разрыхлителя,
• эмульгатора.

Эти свойства необходимы в приготовлении:

• чипсов,
• колбас,
• выпечки,
• заправок и соусов,
• йогуртов и мороженого,
• шоколадных батончиков.

Также эту пищевую добавку можно встретить в составе спортивного и детского питания.

Польза и вред мальтодекстина

Теперь, когда мы знаем, что это такое мальтодекстрин и куда его используют, давайте разберемся в его влиянии на организм человека.
Так как технически мальтодекстрин не считается сахаром, его часто используют в производстве продуктов с маркировкой «без сахара», но это не значит, что его можно употреблять в неограниченных количествах.

Пшеничный мальтодекстрин, наиболее распространенный в странах Европы, противопоказан людям с непереносимостью глютена, а также не рекомендован больным сахарным диабетом. С осторожностью нужно принимать этот углевод и тем, кто следит за своей фигурой или пытается избавиться от лишнего веса.

В то же время кукурузный мальтодекстрин, распространенный в США, не содержит глютена и гораздо лучше воспринимается организмом человека, чем пшеничный аналог.

Вывод: мальтодекстрин, польза и вред которого описаны выше, – это допущенный к использованию в пищевой промышленности углевод, позволяющий улучшить качество и внешний вид многих продуктов. И все же при его использовании нужно придерживать указанной в рецептах дозировки и выбирать только качественный продукт от проверенных производителей.

Похожее

примеры, разрешительные документы, пошлина, НДС, описание

Квотирование	нет
Преференциальный режим	есть	Товар входит в Перечень товаров, на которые распространяется преференциальный режим Решение Межгоссовета ЕврАзЭС № 18 от 27.11.2009
Пошлина	5 %, но не менее 0.03 евро за КГ	Решение Коллегии ЕЭК № 85 от 02.06.2015
Пошлина	нет	Письмо ГТК России № 01-06/25936 от 27.06.2003 * декстрины и прочие модифицированные крахмалы
Специальная пошлина	нет
Антидемпенговая пошлина	нет
Компенсационная пошлина	нет
Акциз	нет
Депозит	нет
НДС	20 %	Федеральный закон № 117-ФЗ от 07.07.2003
Сертификат соответствия продукции требованиям национальных стандартов	нет
Декларация о соответствии продукции требованиям национальных стандартов	нет
Сертификат соответствия таможенного союза	! может требоваться	Продукция не требует оценки соответствии в рамках таможенного союза, кроме товаров, входящих в Единый перечень продукции, подлежащей обязательной оценке(подтверждению) соответствия и имеющих следующие характеристики: * Пищевая продукция Примечание: Сертификация или декларирование проводится в отношении пищевой продукции, вотношении которой устанавливаются требования Технического регламента ТС «О безопасности пищевой продукции» (ТР ТС 021/2011) Решение Комиссии Таможенного союза № 880 от 09.12.2011
Сертификат соответствия таможенного союза	нет	* Пищевые добавки, ароматизаторы и технологические вспомогательные средства Примечание: Сертификация или декларирование проводится в отношении пищевых добавок, ароматизаторов и технологических вспомогательных средств в отношении которых устанавливаются требования Тех.регламента ТС «Требования безопасности пищевых добавок, ароматизаторов и технологических вспомогательных средств» Решение Совета ЕЭК № 58 от 20.07.2012
Сертификат соответствия продукции требованиям технических регламентов	нет
Свидетельство о государственной регистрации	нет
Фитосанитарный сертификат	нет
Ветеринарное свидетельство	нет
Лицензирование	нет
Квотирование	нет
Решения о классификации		Реестр предварительных решений о классификации

Пищевая добавка Мальтодекстрин способствует истощению слизи, вызванному стрессом эндоплазматической сети, и обостряет воспаление кишечника

Предпосылки и цели

Пищевые добавки, такие как эмульгаторы, стабилизаторы или наполнители, присутствуют в западной диете, и их потребление растет. Однако мало что известно об их потенциальном влиянии на гомеостаз кишечника. В этом исследовании мы изучили влияние некоторых из этих пищевых добавок на воспаление кишечника.

Методы

Мышам давали питьевую воду, содержащую мальтодекстрин (MDX), пропиленгликоль или животный желатин, а затем заражали декстрансульфатом натрия или индометацином.Параллельно мышам, получавшим диету, обогащенную MDX, давали ингибитор стресса эндоплазматического ретикулума (ER) тауроурсодезоксихолевую кислоту (TUDCA). Транскриптомный анализ, полимеразная цепная реакция в реальном времени, экспрессия муцина-2, количественное определение киназы фосфорилированного митоген-активированного белка (MAP) p38 и окрашивание H&E проводили на тканях толстой кишки. Состав микробиоты, ассоциированной со слизистой оболочкой, охарактеризован секвенированием 16S рибосомной РНК. Для экспериментов in vitro кишечные крипты мышей и клеточную линию, обработанную метотрексатом человека, секретирующую слизь, стимулировали MDX в присутствии или в отсутствие TUDCA или ингибитора киназы p38 MAP.

Результаты

Диеты, обогащенные MDX, но не пропиленгликоль или животный желатин, усугубляли воспаление кишечника в обеих моделях. Анализ механизмов, лежащих в основе пагубного действия MDX, показал повышенную регуляцию инозита, требующего белка 1β, сенсора ER-стресса, в бокаловидных клетках и снижение экспрессии муцина-2 без значительных изменений в микробиоте, связанной со слизистой оболочкой. Стимуляция кишечных крипт мышей и клеток линии клеток, обработанных метотрексатом, с помощью MDX-индуцированного инозита, требующего белка 1β, посредством механизма, зависимого от киназы p38 MAP.Лечение мышей TUDCA предотвращало истощение муцина-2 и ослабляло колит у мышей, получавших MDX.

Выводы

MDX увеличивает стресс ER в эпителиальных клетках кишечника с последующим эффектом снижения выработки слизи и повышения восприимчивости к колиту.

Ключевые слова

Колит

IBD

Ответ развернутого белка

Эпителий кишечника

Сокращения, использованные в этой статье

ATF

, активирующий фактор транскрипции

Chop

C / EBP гомологичный белок

DSS

сульфат Er

DSS

натрия сульфат передача сигналов от эндоплазматического ретикулума к ядру 1

Grp78

глюкозо-регулируемый белок

HT29-MTX

Клеточная линия, обработанная HT29-метотрексатом

IBD

воспалительное заболевание кишечника

IEC

эпителиальные клетки кишечника

IRE

IRE

инозитол-LP, требующие фермента

инозитол-LP

MAPK

митоген-активированная протеинкиназа

OTU

операционная таксономическая единица

PBS

фосфатно-солевой буфер

ПЦР

полимеразная цепная реакция

миРНК

малая интерферирующая РНК

TUDCA

тауроурсо-деоксихолиевая кислота

Рекомендуемый ответ на

0005 арсодезоксихолиевая кислота

les (0)

© 2019 Авторы.Опубликовано Elsevier Inc. от имени института AGA.

Рекомендуемые статьи

Цитирующие статьи

Материалы для чтения — Добавочный список (E-номера)

Foodlaw-Reading — Добавочный список (E-номера)

	Д-р Дэвид Джукс, Университет Ридинг, Великобритания, Первая страница Foodlaw-Reading была опубликована 20 мая 1996 г.

Последнее обновление: 3 июля, 2020

Пищевые добавки ЕС: внесение в список по номеру E

• Чтобы перейти на главную страницу о пищевых добавках , щелкните здесь.
• Чтобы перейти на страницу архива с предыдущим списком за 1995-2011 гг., Щелкните здесь

В приведенном ниже списке указаны ссылочный номер («номер E») и английские названия всех тех добавок, которые сейчас перечислены в Приложении II к Регламенту 1333/2008 . Хотя приложение к первоначальному Регламенту было пустым, в соответствии с Регламентом 1129/2011 от 11 ноября 2011 г. (и соответствующими поправками) , оно теперь содержит исчерпывающий перечень разрешенных добавок и их разрешенное использование.Для получения ссылок на основной Регламент, поправки и сводную версию Регламента, вернитесь на главную страницу пищевых добавок [ нажмите здесь ]

Соответствующая система нумерации используется Комиссией Codex Alimentarius для своей Международной системы нумерации (INS). В основном используются те же числа (но без E). Обсуждения проводятся Комитетом Кодекса по пищевым добавкам. Подробную информацию о списке добавок Кодекса можно найти на страницах онлайн-базы данных

Общего стандарта Кодекса на пищевые добавки (GSFA).

• E 100 Куркумин
• E 101 Рибофлавины
• E 102 Тартразин
• E 104 Желтый хинолин
• E 110 Желтый закат FCF / Желтый оранжевый S
• E 120 Карминовая кислота, кармин [Названия изменены Постановлением 2018/1472]
• E 122 Азорубин, Кармуазин
• E 123 Амарант
• E 124 Ponceau 4R, кошениль красный A
• E 127 Эритрозин
• E 129 Allura Красный AC
• E 131 Патентный синий V
• E 132 Индиготин, индигокармин
• E 133 бриллиантовый синий FCF
• E 140 Хлорофиллы и хлорофиллины
• E 141 Медные комплексы хлорофиллов, хлорофиллинов
• E 142 Зеленый S
• E 150a Обычная карамель (Термин «карамель» относится к продуктам более или менее интенсивного коричневого цвета, предназначенным для окрашивания.Он не соответствует сладкому ароматическому продукту, полученному при нагревании сахаров и который используется для ароматизации пищевых продуктов (например, кондитерских изделий, кондитерских изделий, алкогольных напитков).
• E 150b Каустическая сульфитная карамель
• E 150c Аммиачная карамель
• E 150d Сульфит-аммиак карамель
• E 151 Блестящий черный BN
• E 153 Уголь растительный
• E 155 Коричневый HT
• E 160a Каротины
• E 160b Annatto, Bixin, Norbixin [Удалено со 2 января 2021 года Постановлением 2020/771 от 11 июня 2020 года.Заменены следующими двумя предметами]
• E 160b (i) Annatto Bixin [добавлено Постановлением 2020/771 от 11 июня 2020 года]
• E 160b (ii) Annatto Norbixin [добавлено Постановлением 2020/771 от 11 июня 2020 года]
• E 160c Экстракт паприки, капсантин, капсорубин
• E 160d Ликопин
• E 160e Бета-апо-8′-каротенал (C 30)
• E 161b Лютеин
• E 161g Кантаксантин (Кантаксантин не разрешен к употреблению в пищевых категориях, перечисленных в частях D и E.Вещество находится в списке B1, потому что оно используется в лекарственных средствах в соответствии с Директивой 2009/35 / EC Европейского парламента и Совета (OJ L 109, 30.4.2009, стр. 10)) .
• E 162 Beetroot Red, бетанин
• E 163 Антоцианы
• E 170 Карбонат кальция
• E 171 Диоксид титана
• E 172 Оксиды и гидроксиды железа [Добавлено Постановлением 510/2013 от 3 июня 2013 г.]
• E 173 Алюминий
• E 174 Серебристый
• E 175 Золото
• E 180 Литолрубин БК
• E 200 Сорбиновая кислота
• E 202 Сорбат калия
• E 203 Сорбат кальция [Удалено Постановлением 2018/98 от 12 августа 2018 года]
• E 210 Бензойная кислота (1)
• E 211 Бензоат натрия (1)
• E 212 Бензоат калия (1)
• E 213 Бензоат кальция (1)
  • (1) Бензойная кислота может присутствовать в некоторых ферментированных продуктах, полученных в результате процесса ферментации в соответствии с надлежащей производственной практикой .
• E 214 Этил-п-гидроксибензоат
• E 215 Этил п-гидроксибензоат натрия
• E 218 Метил п-гидроксибензоат
• E 219 Метил-п-гидроксибензоат натрия
• E 220 Диоксид серы
• E 221 Сульфит натрия
• E 222 Гидросульфит натрия
• E 223 Метабисульфит натрия
• E 224 Метабисульфит калия
• E 226 Сульфит кальция
• E 227 Гидросульфит кальция
• E 228 Гидросульфит калия
• E 234 Nisin
• E 235 Натамицин
• E 239 Гексаметилентетрамин
• E 242 Диметилдикарбонат
• E 243 Этиллауроил аргинат [добавлен Постановлением 506/2014 от 15 мая 2014 г.]
• E 249 Нитрит калия
• E 250 Нитрит натрия
• E 251 Нитрат натрия
• E 252 Нитрат калия
• E 260 Уксусная кислота
• E 261 Ацетаты калия [Добавлено Постановлением 25/2013 от 16 января 2013 года]
• E 262 Ацетат натрия
• E 263 Ацетат кальция
• E 270 Молочная кислота
• E 280 Пропионовая кислота
• E 281 Пропионат натрия
• E 282 Пропионат кальция
• E 283 Пропионат калия
• E 284 Кислота борная
• E 285 Тетраборат натрия (бура)
• E 290 Двуокись углерода
• E 296 Яблочная кислота
• E 297 Фумаровая кислота
• E 300 Аскорбиновая кислота
• E 301 Аскорбат натрия
• E 302 Аскорбат кальция
• E 304 Сложные эфиры жирных кислот и аскорбиновой кислоты
• E 306 Экстракт, богатый токоферолом
• E 307 Альфа-токоферол
• E 308 Гамма-токоферол
• E 309 Дельта-токоферол
• E 310 Пропилгаллат
• E 311 Октилгаллат [Удалено Постановлением 2018/1481 от 25 октября 2018 г.]
• E 312 Додецилгаллат [Удалено Постановлением 2018/1481 от 25 октября 2018 года]
• E 315 Кислота эриторбиновая
• E 316 Эриторбат натрия
• E 319 Третичный бутилгидрохинон (TBHQ)
• E 320 Бутилированный гидроксианизол (BHA)
• E 321 Бутилированный гидрокситолуол (BHT)
• E 322 Лецитины
• E 325 Лактат натрия
• E 326 Лактат калия
• E 327 Лактат кальция
• E 330 Лимонная кислота
• E 331 Цитрат натрия
• E 332 Цитрат калия
• E 333 Цитрат кальция
• E 334 Тарартовая кислота (L (+) -)
• E 335 Тартрат натрия
• E 336 Тартраты калия
• E 337 Натрия тартрат калия
• E 338 Фосфорная кислота
• E 339 Фосфаты натрия
• E 340 Фосфаты калия
• E 341 Фосфаты кальция
• E 343 Фосфаты магния
• E 350 Малаты натрия
• E 351 Малат калия
• E 352 Малаты кальция
• E 353 Метатараровая кислота
• E 354 Тартрат кальция
• E 355 Адипиновая кислота
• E 356 Адипат натрия
• E 357 Адипат калия
• E 363 Янтарная кислота
• E 380 Цитрат триаммония
• E 385 Динатрий-этилендиаминтетраацетат кальция (ЭДТА динатрия кальция)
• E 392 Экстракты розмарина
• E 400 Альгиновая кислота
• E 401 Альгинат натрия
• E 402 Альгинат калия
• E 403 Альгинат аммония
• E 404 Альгинат кальция
• E 405 Альгинат пропана-1,2-диола
• E 406 Агар
• E 407a Обработанные водоросли эухемы
• E 407 Каррагинан
• E 410 Камедь рожкового дерева
• E 412 Гуаровая камедь
• E 413 Трагакант
• E 414 Гуммиарабик (камедь акации)
• E 415 Ксантановая камедь
• E 416 Камедь Карая
• E 417 Тара камедь
• E 418 Геллановая камедь
• E 420 Сорбитолы
• E 421 Маннитол
• E 422 Глицерин
• E 423 Гуммиарабик, модифицированный октенилянтарной кислотой [Добавлено Постановлением 817/2013 от 28 августа 2013 года]
• E 425 Konjac
• E 426 Гемицеллюлоза сои
• E 427 Камедь кассии
• E 431 Полиоксиэтилен (40) стеарат
• E 432 Монолаурат полиоксиэтиленсорбитана (полисорбат 20)
• E 433 Моноолеат полиоксиэтиленсорбитана (полисорбат 80)
• E 434 Монопальмитат полиоксиэтиленсорбитана (полисорбат 40)
• E 435 Моностеарат полиоксиэтиленсорбитана (полисорбат 60)
• E 436 Полиоксиэтиленсорбитантристеарат (полисорбат 65)
• E 440 Пектины
• E 442 Фосфатиды аммония
• E 444 Изобутират ацетата сахарозы
• E 445 Глицериновые эфиры канифоли
• E 450 Дифосфаты
• E 451 Трифосфаты
• E 452 Полифосфаты
• E 456 Полиаспартат калия [Добавлен Постановлением 2017/1399 от 28 июля 2017 г.]
• E 459 Бета-циклодекстрин
• E 460 Целлюлоза
• E 461 Метилцеллюлоза
• E 462 Этилцеллюлоза
• E 463 Гидроксипропилцеллюлоза
• E 464 Гидроксипропилметилцеллюлоза
• E 465 Этилметилцеллюлоза
• E 466 Натрийкарбоксиметилцеллюлоза, целлюлозная камедь [Названия изменены Постановлением 1274/2013 от 6 декабря 2013 г.]
• E 468 Сшитая натрийкарбоксиметилцеллюлоза, сшитая целлюлозная камедь
• E 469 Ферментативно гидролизованная карбоксиметилцеллюлоза, Ферментативно гидролизованная целлюлозная камедь
• E 470a Натриевые, калиевые и кальциевые соли жирных кислот
• E 470b Магниевые соли жирных кислот
• E 471 Моно- и диглицериды жирных кислот
• E 472a Эфиры уксусной кислоты моно- и диглицеридов жирных кислот
• E 472b Эфиры молочной кислоты моно- и диглицеридов жирных кислот
• E 472c Эфиры лимонной кислоты моно- и диглицеридов жирных кислот
• E 472d Эфиры винной кислоты моно- и диглицеридов жирных кислот
• E 472e Эфиры моно- и диацетилвинной кислоты моно- и диглицеридов жирных кислот
• E 472f Смешанные эфиры моно- и диглицеридов жирных кислот уксусной и винной кислот
• E 473 Эфиры сахарозы и жирных кислот
• E 474 Сахарглицериды
• E 475 Полиглицериновые эфиры жирных кислот
• E 476 Полиглицерин полирицинолеат
• E 477 Пропан-1,2-диоловые эфиры жирных кислот
• E 479b Термически окисленное соевое масло, взаимодействующее с моно- и диглицеридами жирных кислот
• E 481 Стеароил-2-лактилат натрия
• E 482 Стеароил-2-лактилат кальция
• E 483 Стеарилтартрат
• E 491 Моностеарат сорбита
• E 492 Тристеарат сорбитана
• E 493 Монолаурат сорбитана
• E 494 Моноолеат сорбитана
• E 495 Монопальмитат сорбитана
• E 499 Растительные стерины, богатые стигмастерином [Добавлено Постановлением 739/2013 от 30 июля 2013 г.]
• E 500 Карбонаты натрия
• E 501 Карбонаты калия
• E 503 Карбонаты аммония
• E 504 Карбонаты магния
• E 507 Кислота соляная
• E 508 Хлорид калия
• E 509 Хлорид кальция
• E 511 Хлорид магния
• E 512 Хлорид олова
• E 513 Серная кислота
• E 514 Сульфат натрия
• E 515 Сульфаты калия
• E 516 Сульфат кальция
• E 517 Сульфат аммония
• E 520 Сульфат алюминия
• E 521 Сульфат алюминия-натрия
• E 522 Сульфат алюминия-калия
• E 523 Сульфат алюминия-аммония
• E 524 Гидроксид натрия
• E 525 Гидроксид калия
• E 526 Гидроксид кальция
• E 527 Гидроксид аммония
• E 528 Гидроксид магния
• E 529 Оксид кальция
• E 530 Оксид магния
• E 534 Тартрат железа [Добавлен Постановлением 2015/1739 от 28 сентября 2015 г.]
• E 535 Ферроцианид натрия
• E 536 Ферроцианид калия
• E 538 Ферроцианид кальция
• E 541 Натрий-алюминийфосфат кислый
• E 551 Диоксид кремния
• E 552 Силикат кальция
• E 553a Силикат магния
• E 553b Тальк
• E 554 Силикат натрия и алюминия
• E 555 Силикат алюминия и калия
• E 556 Силикат кальция и алюминия [Удалено Постановлением 380/2012 от 31 января 2014 г.]
• E 558 Бентонит [Удалено Постановлением 380/2012 от 31 мая 2013 г.]
• E 559 Силикат алюминия (каолин) [Удалено Постановлением 380/2012 от 31 января 2014 г.]
• E 570 Жирные кислоты
• E 574 Глюконовая кислота
• E 575 Глюконо-дельта-лактон
• E 576 Глюконат натрия
• E 577 Глюконат калия
• E 578 Глюконат кальция
• E 579 Глюконат железа
• E 585 Лактат железа
• E 586 4-гексилрезорцин
• E 620 Глутаминовая кислота
• E 621 Глутамат натрия
• E 622 Глутамат монокалия
• E 623 Диглутамат кальция
• E 624 Глутамат моноаммония
• E 625 Диглутамат магния
• E 626 Гуаниловая кислота
• E 627 Гуанилат динатрия
• E 628 Гуанилат калия
• E 629 Гуанилат кальция
• E 630 Инозиновая кислота
• E 631 Инозинат динатрия
• E 632 Инозинат калия
• E 633 Инозинат кальция
• E 634 5′-рибонуклеотиды кальция
• E 635 Динатрий 5′-рибонуклеотиды
• E 640 Глицин и его натриевая соль
• E 641 L-лейцин [Добавлено Постановлением 2015/649 от 24 апреля 2015 г.]
• E 650 Ацетат цинка
• E 900 Диметил полисилоксан
• E 901 Пчелиный воск, бело-желтый
• E 902 Канделильский воск
• E 903 Карнаубский воск
• E 904 Шеллак
• E 905 Воск микрокристаллический
• E 907 Гидрированный поли-1-децен
• E 912 Эфиры кислоты Монтана [Удалено Постановлением 957/2014 от 1 октября 2014 года]
• E 914 Окисленный полиэтиленовый воск
• E 920 L-цистеин
• E 927b Карбамид
• E 938 Аргон
• E 939 Гелий
• E 941 Азот
• E 942 Закись азота
• E 943a Бутан
• E 943b Изобутан
• E 944 Пропан
• E 948 Кислород
• E 949 Водород
• E 950 Ацесульфам K
• E 951 Аспартам
• E 952 Цикламаты
• E 953 Изомальт
• E 954 Сахарины
• E 955 Сукралоза
• E 957 Тауматин
• E 959 Неогесперидин DC
• E 960 Стевиолгликозиды [Добавлено Постановлением 1131/2011 от 11 ноября 2011 г.]
• E 961 Neotame
• E 962 Соль аспартама-ацесульфама
• E 964 Сироп полиглицитола [Добавлен Постановлением 1049/2012 от 8 ноября 2012 г.]
• E 965 Мальтитол
• E 966 Лактитол
• E 967 Ксилит
• E 968 Эритритол
• E 969 Advantame [Добавлено Постановлением 497/2014 от 14 мая 2014 г.]
• E 999 Экстракт квиллайи
• E 1103 Инвертаза
• E 1105 Лизоцим
• E 1200 Полидекстроза
• E 1201 Поливинилпирролидон
• E 1202 Поливинилполипирролидон
• E 1203 Поливиниловый спирт (ПВА)
• E 1204 Пуллулан
• E 1205 Основной сополимер метакрилата
• E 1206 Нейтральный сополимер метакрилата [Добавлено Постановлением 816/2013 от 28 августа 2013 г.]
• E 1207 Анионный сополимер метакрилата [Добавлено Постановлением 816/2013 от 28 августа 2013 г.]
• E 1208 Сополимер поливинилпирролидона и винилацетата [добавлен Постановлением 264/2014 от 14 марта 2014 года]
• E 1209 Поливиниловый спирт-полиэтиленгликоль- привитый -сополимер [Добавлено Постановлением 685/2014 от 20 июня 2014 г.]
• E 1404 Крахмал окисленный
• E 1410 Монокрахмалфосфат
• E 1412 Дикихмал фосфат
• E 1413 Фосфатный фосфат дистрахмала
• E 1414 Ацетилированный фосфат дистрахмала
• E 1420 Ацетилированный крахмал
• E 1422 Ацетилированный дистархат адипинат
• E 1440 Гидроксипропилкрахмал
• E 1442 Гидроксипропилдихрамм фосфат
• E 1450 Крахмал октенилсукцинат натрия
• E 1451 Крахмал ацетилированный окисленный
• E 1452 Крахмал октенилсукцинат алюминия
• E 1505 Триэтилцитрат
• E 1517 Глицерилдиацетат (диацетин)
• E 1518 Глицерилтриацетат (триацетин)
• E 1519 Бензиловый спирт
• E 1520 Пропан-1,2-диол (пропиленгликоль)
• E 1521 Полиэтиленгликоль

---

Эта страница была впервые представлена ​​6 декабря 2011 г. (первоначальная версия впервые опубликована: 29 июля 1996 г.)

---

---

На главную Foodlaw-Reading Индексная страница, щелкните здесь.

---

Улучшение эмульгирующих свойств белков гороха в качестве эмульгаторов на растительной основе посредством индуцированного Майяром гликирования в электроспряденных волокнах белок гороха – мальтодекстрин

Термообработанные электроспряденные волокна из изолята горохового белка (ИПП) –мальтодекстрин, содержащие гликированный ИПП, были проанализированы на предмет их межфазного натяжения и эмульгирующих свойств по сравнению с непрогретыми электроспряденными волокнами ИПП – мальтодекстрин. Межфазное натяжение на границе раздела масло-вода нагретых волокон было выше (19.2 ± 0,1 мН м ^-1 ) по сравнению с ненагретыми волокнами (16,3 ± 1,4 мН м ^-1 ) из-за ковалентно связанного гидрофильного мальтодекстрина в гликоконъюгатах. Применяемые в эмульсиях масло-в-воде (10% мас. / Мас., 0,7% белка, 103,4 МПа, 3 прохода), ненагретые волокна PPI – мальтодекстрин производили крупные капли (72–259 мкм) с мультимодальным распределением в диапазоне pH 2. –7. Наибольший размер капель был при pH 4, который был около pI PPI. Эмульсии также были склонны к флокуляции, что, скорее всего, было вызвано механизмом флокуляции истощения из-за избытка мальтодекстрина в водной фазе.Напротив, эмульсии, приготовленные из нагретых волокон PPI – мальтодекстрин, были мономодальными (36–55 мкм) при pH 2–7 и показали лишь незначительное увеличение размера капель, близкое к pI PPI. Улучшенные свойства нагретых волокон PPI – мальтодекстрин были приписаны усиленному стерическому отталкиванию, вызванному ковалентно связанным мальтодекстрином. Результаты показывают, что индуцированное Майяром гликирование PPI мальтодекстрином в электропряденых волокнах может быть использовано в качестве нового метода улучшения свойств PPI как эмульгатора на растительной основе.

У вас есть доступ к этой статье

Подождите, пока мы загрузим ваш контент… Что-то пошло не так. Попробуй еще раз?

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

---

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

---

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

---

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

границ | Важность мальтазы AmlE в использовании мальтозы и ее транскрипционная регуляция репрессором AmlR в бактериях, продуцирующих акарбозу Actinoplanes sp.SE50 / 110

Введение

Actinoplanes sp. SE50 / 110 (ATCC 31044) представляет собой природное производное SE50, которое было выделено из образца почвы во время программы скрининга Bayer AG в 1970 году (Frommer et al., 1979; Parenti and Coronelli, 1979). Было обнаружено, что он является естественным продуцентом ингибитора α-глюкозидазы акарбозы, который используется при лечении сахарного диабета (Wehmeier, 2004; Wehmeier and Piepersberg, 2004). После перорального применения акарбозы кишечные α-глюкозидазы человека подавляются, что приводит к замедленному высвобождению моносахаридов.Таким образом, уровень сахара в крови после приема пищи у пациентов с диабетом может быть существенно снижен, что полезно в контексте сердечно-сосудистых заболеваний (Rosak and Mertes, 2012).

Акарбоза — циклитолсодержащий аминогликозид. Гены биосинтеза кодируются кластером генов acb , который был идентифицирован в 1999 г. Stratmann et al. и впоследствии секвенировали (GenBank: Y18523.4) (Stratmann et al., 1999; Thomas, 2001). Акарбоза состоит из псевдодисахарида и мальтозы, связанной с α-1,4-гликозидами (Wehmeier and Piepersberg, 2009).

В контексте экономии ресурсов внеклеточного пространства предполагается, что вторичный метаболит акарбоза выполняет двойную функцию для Actinoplanes sp. SE50 / 110 — особенно когда он находится в конкурирующих ситуациях в пределах своей естественной среды обитания: предполагалось, что он действует как ингибитор чужеродных глюкозидаз, с одной стороны, и как «карбофор», с другой (Wehmeier and Piepersberg, 2004; Brunkhorst and Schneider, 2005). «Карбофор» описывает модельную идею акарбозы как транспортного средства, по которому можно перемещать сахара.Таким образом, молекулы сахара окружающей среды помечаются для повторного импорта и отделяются от других бактерий (Wehmeier and Piepersberg, 2004, 2009). После реимпорта метаболиты акарвиозила, вероятно, фосфорилируются и выгружаются, что приводит к рециркуляции акарбозы (Wehmeier and Piepersberg, 2004; Wendler et al., 2013). Благодаря своей двойной функции, акарбоза обеспечивает рост медленно растущих Actinoplanes sp. SE50 / 110 в разнообразном микробном сообществе.

Дисахарид мальтоза играет важную роль в образовании акарбозы, потому что он служит центральным предшественником биосинтеза акарбозы, с одной стороны, и источником углерода, с другой стороны.Таким образом, захват из внеклеточного пространства, внутриклеточное использование и регуляция представляют большой интерес для исследования Actinoplanes sp. SE50 / 110. В отличие от внеклеточного метаболизма сахара, о внутриклеточном метаболизме (Ortseifen, 2016) и его регуляции (Wolf, 2017) у Actinoplanes sp. SE50 / 110.

В соответствии с современными моделями хорошо изученных микроорганизмов Gammaproteobacterium , Escherichia coli и Actinobacterium Corynebacterium glutamicum , система мальтоза / мальтодекстрин определяется активностью двух ключевых ферментов: амиломальтазы Мальгидролазы и мальфосфата.В E. coli MalQ распознает малые мальтодекстрины, удаляет глюкозу с восстанавливающего конца и переносит мальтодекстринильный остаток на невосстанавливающий конец других мальтодекстринов (Boos and Shuman, 1998; Park et al., 2011). Как следствие, более крупные линейные мальтодекстрины образуются за счет активности MalQ, тогда как высвобождается глюкоза. Мальтотриоза — самый мелкий субстрат MalQ (Boos, Shuman, 1998; Park et al., 2011). Мальтоза не является первичным субстратом, но может служить акцептором реакций переноса (Boos and Shuman, 1998).Предполагается, что MalP разрушает линейные глюканы, образованные MalQ, путем последовательного фосфолиза. При этом образуется глюкоза-1P, которая направляется на гликолиз для роста и производства энергии (Boos and Shuman, 1998; Park et al., 2011). MalP не атакует мальтодекстрины размером ниже мальтотетраозы, вероятно, поскольку для MalQ требуются декстрины минимального размера (Boos and Shuman, 1998; Park et al., 2011). Для E. coli взаимодействие между MalQ и MalP позволяет эффективно использовать мальтодекстрины разного размера в клетке (Boos and Shuman, 1998; Park et al., 2011). Аналогичные результаты были получены для actinobacterium C. glutamicum (Seibold et al., 2009).

Предполагается, что другие глюкозидазы, а именно MalZ и MalS, разрушают линейные глюканы в E. coli . Оба фермента высвобождают глюкозу из восстанавливающего конца с мальтотриозой как наименьшим субстратом (Tapio et al., 1991; Boos and Shuman, 1998). В E. coli MalZ расположен в цитоплазме, тогда как MalS расположен в периплазме (Boos and Shuman, 1998).Здесь MalS предпочтительно отщепляет мальтогексаозу от невосстанавливающего конца высших мальтодекстринов, чтобы обеспечить транспорт из периплазмы в цитоплазму с помощью транспортных систем мальтоза / мальтодекстрин (Boos and Shuman, 1998). Таким образом, MalS посвящен грамотрицательным бактериям (Boos and Shuman, 1998). В то время как недостаток MalP имеет драматические физиологические эффекты, MalZ и MalS не являются существенными для использования мальтозы или мальтодекстрина в E. coli (Park et al., 2011). У грамположительной бактерии C.glutamicum , MalZ-гомолог еще не удалось идентифицировать (Seibold et al., 2009). Следовательно, в обоих модельных организмах MalP и MalQ играют ведущую роль в ассимиляции мальтозы, тогда как MalZ или MalS, по-видимому, незначительны.

Система мальтоза / мальтодекстрин грамположительной бактерии Firmicute Bacillus subtilis существенно отличается от моделей E. coli и C. glutamicum , поскольку в ней отсутствуют гомологи GlgX, MalQ, MalP и MalZ (Shim et al. al., 2009). Их роль в ассимиляции мальтодекстрина функционально замещается активностью мальтогенной амилазы (MAase, YvdF), пуллуланазы (AmyX), мальтозофосфорилазы (YvdK) и мальтазы, называемой MalL (Schönert et al., 1998, 2006). ; Шим и др., 2009).

В Actinoplanes sp. Также аннотируется ген мальтазы SE50 / 110, который ранее был назван MalL (Wendler et al., 2015a). В этой статье мы переименовали MalL в AmlE (фермент мальтазы Actinoplanes ). AmlE привлекает наше внимание, так как он сильно выражен при выращивании на мальтозе (Wendler et al., 2015а). Поскольку функциональный гомолог AmlE не был описан в системе мальтоза / мальтодекстрин хорошо изученных модельных организмов E. coli (Boos and Shuman, 1998; Park et al., 2011) и C. glutamicum (Seibold, 2008; Seibold et al., 2009), было высказано предположение, что AmlE отвечает за расщепление высокомолекулярных сахаров на глюкозу за счет гидролитической активности — сравнимой с гидролазой MalZ из E. coli (Ortseifen, 2016).

В контексте регуляции генов система мальтоза / мальтодекстрин была описана как сахарозависимая — в основном индуцированная мальтозой или подавленная глюкозой — в различных модельных организмах.В E. coli экспрессия генов mal строго индуцируется мальтозой / мальтотриозой и подавляется глюкозой. Это опосредуется главным активатором MalT, который сам по себе катаболитом репрессируется цАМФ / CAP, а также активностью репрессора Mlc (Boos and Shuman, 1998). У Actinomycetes Streptomyces lividans (Schlösser et al., 2001) и Streptomyces coelicolor (van Wezel et al., 1997a, b), MalR-гомолог регулирует индуцированную мальтозой и репрессированную глюкозой транскрипцию регулятора транспортера. malEFG .В S. lividans MalR был даже описан как плейотропный регулятор различных генов метаболизма сахара (Nguyen et al., 1997; Nguyen, 1999). В B. subtilis экспрессия мальтазы MalL была описана как индуцированная мальтозой и подавленная глюкозой / фруктозой (Schönert et al., 1998) вместе с другими ферментами метаболизма мальтозы / мальтодекстрина (Schönert et al. , 1998, 2006). Здесь регулятор типа LacI / GalR YvdE / MalR был предложен в качестве активатора транскрипции (Schönert, 2004; Schönert et al., 2006).

В Actinoplanes sp. SE50 / 110, исследования регуляции метаболизма сахара все еще находятся на ранней стадии. Здесь более 900 генов предположительно участвуют в регуляции транскрипции, из которых 697 аннотированы как регуляторы транскрипции согласно аннотации Wolf et al. (2017b) (GenBank: LT827010.1). Сахарозависимая экспрессия amlE и предполагаемого переносчика ABC-типа aglEFG была показана сравнительным протеомным анализом Actinoplanes sp.SE50 / 110 вырос на глюкозе и мальтозе (Wendler et al., 2015a), но механизмы регуляции остаются неясными. Недавние исследования регуляторов MalT ( ACSP50_3915 ) и MalT-подобного регулятора ( ACSP50_3917 ) показали, что ни один из них не отвечает за регуляцию генов метаболизма мальтозы / мальтодекстрина в SE50 / 110 (личное сообщение д-ра Тимо Вольф и Джулиан Дросте). Аналогичным образом было показано, что гомолог MalR является репрессором транскрипции acbDE и acbZ , но не оперона malEFG в Actinoplanes sp.SE50 / 110 (Wolf et al., 2017a). Предполагается, что регулятор эволюционно изменил регулятор с malEFG на кластер генов acb и был переименован в регулятор акарбозы C (AcrC) (Wolf et al., 2017a). Дальнейшие предполагаемые регуляторы транскрипции метаболизма сахаров не были проанализированы в Actinoplanes sp. SE50 / 110 пока нет.

Поскольку внутриклеточный метаболизм мальтозы и его регуляция ранее не исследовались в Actinoplanes sp.SE50 / 110, мы хотели оценить функцию фермента мальтазы Actinoplanes AmlE (ранее MalL) и соседнего локализованного регулятора, названного AmlR (регулятор мальтазы Actinoplanes ).

Материалы и методы

Программное обеспечение, инструменты и базы данных, используемые для биоинформатических исследований

Базовое локальное выравнивание было выполнено с помощью интерфейса Blast (Altschul et al., 1990, 1997, 2005) Национального центра биотехнологической информации (NCBI).Функциональный поиск домена белков выполняли с помощью инструмента множественного выравнивания последовательностей CCD (Conserved Domain Database) (Marchler-Bauer and Bryant, 2004; Marchler-Bauer et al., 2010, 2015, 2017). TMHMM Server v. 2.0 использовался для предсказания трансмембранных спиралей в белках (Krogh et al., 2001). Построение дерева и визуализация выполнялись с помощью инструмента Blast tree view 1.17.5 NCBI и программного обеспечения Dendroscope 3 (Huson and Scornavacca, 2012).

EDGAR 2.0 использовался для сравнительных исследований генома кластера генов aml (Blom et al., 2016). Инструмент MEME использовался для обнаружения новых, незащищенных мотивов в последовательности (Bailey and Elkan, 1994; Bailey et al., 2009), а инструмент FIMO — для полногеномного сканирования мотива (Grant et al., 2011).

Штаммы

Все штаммы, использованные в этой статье, перечислены в таблице 1.

Таблица 1. Список штаммов.

Среда и условия культивирования

Приготовление исходных глицериновых растворов и растворов спор

Actinoplanes sp.SE50 / 110

Для приготовления глицериновой массы Actinoplanes sp. SE50 / 110 (ATCC 31044) выращивали в комплексной среде NBS (11 г⋅л ^–1 глюкозы × 1H ₂ O, 4 г⋅л ^–1 пептона, 4 г⋅л ^–1 дрожжей экстракт, 1 г⋅л ^–1 MgSO ₄ ⋅7H ₂ O, 2 г⋅л ^–1 KH ₂ PO ₄ , 4 г⋅л ^–1 K ₂ HPO ₄ ) и смешивали 2: 3 со стерильным 86% (об. / Об.) Глицерином. Запасы глицерина хранили при -80 ° C.Для образования спор 200–300 мкл исходного раствора глицерина выращивали на чашках агара со средой с соевой мукой (SFM-агар) [20 г / л соевой муки ^–1 (SOBO ^® Naturkost (Кельн, Германия)], 20 г⋅л ^–1 D-маннита, 20 г⋅л ^–1 агара Bacto ^TM (Becton-Dickinson, Гейдельберг, Германия и 167 мкл 10 N NaOH в водопроводной воде). Споры можно было собрать через 5 -7 дней инкубации при 28 ° C, смыв их 3 мл дистиллированной воды с помощью ватного тампона.

Приготовление минимальной среды

Штаммы Actinoplanes sp.SE50 / 110 (ATCC 31044) выращивали на минимальной мальтозной среде (72,06 г⋅л ^–1 мальтоза⋅1H ₂ O, 5 г⋅л ^–1 (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , 0,184 г⋅л ^–1 FeCl ₂ ⋅4H ₂ O, 5,7 г⋅л ^–1 Na ₃ C ₆ H ₅ O ₇ ⋅2H ₂ O, 1 г⋅л ^–1 MgCl ₂ ⋅6H ₂ O, 2 г⋅л ^–1 CaCl ₂ ⋅2H ₂ O, микроэлементы (конечная концентрация: 1 мкМ CuCl ₂ , 50 мкМ ZnCl ₂ , 7.5 мкМ MnCl ₂ ) и фосфатный буфер, состоящий из 5 мкл ^–1 каждый, K ₂ HPO ₄ и KH ₂ PO ₄ в водной дистилляции). Для приготовления сред и стерилизации фильтром протоколы Wendler et al. отслеживались (Wendler et al., 2013, 2015b).

Для замены источника углерода мальтозы использовали 79,2 г⋅л ^–1 глюкозы⋅1H ₂ O или 72,0 г⋅л ^–1 C-Pur (Cerestar 01908, Cerestar GmbH, Крефельд, Германия). моногидрата мальтозы.Смеси мальтозы и глюкозы готовили в соотношении 90:10 и 50:50. Смесь 90:10 содержит 64,85 г⋅л ^–1 мальтозы⋅1H ₂ O и 7,9 г⋅л ^–1 глюкозы⋅1H ₂ O. Смесь 50:50 содержит 36,03 г⋅л ^{— 1} мальтоза 1H ₂ O и 39,6 г⋅л ^–1 глюкоза 1H ₂ O. Для крахмальной среды: 4% (мас. / Об.) Опалесцирующий раствор «растворимого в крахмале» от Acros Organics (часть компании Thermo Fisher Scientific, Гил, Бельгия).Для этого стерильную воду предварительно нагревали до 90 ° C на водяной бане и добавляли навеску при перемешивании. После этого были добавлены остаточные компоненты среды.

Культивирование во встряхиваемой колбе

Культивирование выполняли в 250 мл колбах для культивирования клеток Corning ^® Erlenmeyer с перегородками при 28 ° C и 140 об / мин в течение 7 дней. Для инокуляции готовили раствор спор, из которого 1 мл использовали для инокуляции 50 мл культуры. Сухой вес клеток определяли путем сбора 2 × 1 мл клеточной суспензии в взвешенные реакционные пробирки (14000 г, 2 мин), промывания их в деионизированной воде и сушки в течение 1 дня при 60–70 ° C, как описано Вольфом. и другие.(2017a). Супернатант хранили при -20 ° C для последующих анализов.

Количественное определение акарбозы

Супернатанты культур, выращенных на мальтозе Actinoplanes ssp. смешивали 1: 5 с метанолом встряхиванием и центрифугировали для удаления осадка (20000 g, 2 мин). Образец переносили во флаконы для ВЭЖХ и анализировали в системе ВЭЖХ серии 1100 компании Agilent (G1312A Binary Pump Serial # DE43616357, G1329A ALS autosampler Serial # DE43613 / 10, G1315A DAD Serial # DE72002469).В качестве стационарной фазы использовали колонку Hypersil APS-2 (125 × 4 мм, размер частиц 3 мкм) компании Thermo Fisher Scientific Inc. (Уолтем, Массачусетс, США), нагретую до 40 ° C. В качестве подвижной фазы использовали изократический поток 1 мл⋅мин ^–1 68% ацетонитрила (ACN) (растворитель B) и 32% фосфатный буфер (0,62 г⋅л ^–1 KH ₂ PO ₄ и 0,38 г L ^–1 Na ₂ HPO ₄ ⋅2H ₂ O) (растворитель A). Вводили 40 мкл каждого образца и разделяли в течение 10 минут.Обнаружение акарбозы проводили с помощью детектора DAD при 210 нм (эталон 360 нм) и определяли количественно по площадям пиков калибровочной кривой.

Аналитика субстратов

Супернатант центрифугировали (20000 g, 2 мин), разбавляли дидеионизированной водой и переносили во флаконы для ВЭЖХ. Анализ выполняли в системе ВЭЖХ smartline фирмы Knauer (Берлин, Германия). В качестве стационарной фазы использовали колонку VA300 / 7.8 Nucleogel Sugar 810-H (300 мм) и предколонку CC 30/4 Nucleogel Sugar 810-H (3 × 4 мм) Macherey-Nagel (Düren, Германия), нагретую до 72 °. С.В качестве подвижной фазы использовали изократический поток 0,8 мл⋅мин ^–1 2,5 мМ H ₂ SO ₄ . Вводили двадцать микролитров каждого образца и разделяли его в течение 25 минут. Обнаружение субстратов проводили с помощью детектора показателя преломления ERC GmbH (Riemerling, Германия) и определяли количественно по площадям пиков калибровочной кривой стандартов (1–20 г⋅л ^–1 ). Хроматограммы оценивали с помощью программного обеспечения Chromastar (SCPA GmbH, Weyhe, Германия).

Работа с рекомбинантной ДНК

Удаление гена

amlE ( ACSP50_2474 ) и amlR ( ACSP50_2475 ) с помощью CRISPR / Cas9 Technique

Для создания делеционных мутантов генов amlE ( ACSP50_2474 ) и amlR ( ACSP50_2475 ) методом CRISPR / Cas9 плазмида pCRISPomyces-2 (Cobb et al., 2015) использовался согласно протоколу Wolf et al. (2016). Спейсер и их обратный комплемент были заказаны в компании «Метабион ГмбХ» (Стейнкирхен, Германия) как олигонуклеотиды с перекрытием (дополнительная таблица S1). Олигонуклеотиды были отожжены до двухцепочечных и собраны с плазмидой с помощью сборки Bsa I-Golden Gate (Engler et al., 2008) в соответствии с протоколом Cobb et al. (2015). Для репарации двухцепочечного разрыва, индуцированного Cas9, матрицу ДНК клонировали в вектор с помощью сборки Гибсона (Gibson et al., 2009). В качестве ДНК-матрицы фланкирующие последовательности перед и после целевого гена (каждый цикл около 1 кБ) амплифицировали с помощью ПЦР с помощью высокоточной смеси для ПЦР Phusion ^® с буфером для ГХ (NEB, Ипсвич, Массачусетс, США). (согласно протоколу Cobb et al., 2015; Wolf et al., 2016). Последовательности праймеров показаны в дополнительной таблице S1. Реакционную смесь переносили в E. coli DH5αMCR путем химической трансформации согласно протоколу Beyer et al. (2015).Выращивание и селекцию E. coli проводили путем посева их на LB-среду с 15 г / л агар-агар ^–1 (Carl Roth, GmbH & Co.KG, Карлсруэ, Германия) с добавлением 50 мг / л ^{— 1} апрамицина-сульфат и инкубация 10–14 ч при 37 ° C. Положительные колонии были протестированы с помощью ПЦР и гель-электрофореза и подтверждены секвенированием вектора по Сэнгеру нашим внутренним центром секвенирования (последовательности праймеров для ПЦР: для: 5′-GGCGTTCCTGCAATTCTTAG-3 ‘, rev: 5’-TCGCCACCTCTGACTTGAGC- 3 ′).Клонирование планировалось и моделировалось с помощью программного обеспечения Clone Manager 9 (Scientific & Educational Software, Денвер, Колорадо, США) и SnapGene 4.3 (GSL Biotech LLC, Чикаго, Иллинойс, США).

Конъюгальный перенос на

Actinoplanes sp. SE50 / 110 и плазмидное отверждение

Конъюгацию проводили с E. coli ET12567 / pUZ8002 (Kieser et al., 2000) в качестве донорского штамма и компетентным штаммом Actinoplanes sp. Клетки SE50 / 110 согласно протоколу Schaffert et al.(2019).

Плазмидное лечение проводили согласно протоколу Wolf et al. (2016). Exconjugants тестировали на делецию с помощью ПЦР. ПЦР-фрагмент вырезали из геля и секвенировали с помощью нашего внутреннего центра секвенирования Sanger. Кроме того, геномная ДНК мутанта с делецией была секвенирована с помощью MinION ^® компании Oxford Nanopore (Оксфорд, Соединенное Королевство) для исключения нецелевых эффектов с помощью метода CRISPR / Cas9. Для этого геномную ДНК культуры, выращенной NBS, выделяли с помощью набора для микробной ДНК NucleoSpin ^® (Macherey-Nagel, Düren, Германия) и библиотеки, приготовленной с помощью набора для геномной ДНК 1D методом лигирования (Oxford Nanopore, Оксфорд, Великобритания).

Работа РНК

Отбор проб и выделение РНК

Для анализа транскриптома были взяты образцы 2 × 1 мл из культур Actinoplanes во время фазы роста, отделены от супернатанта центрифугированием (10 с) и быстро заморожены в жидком азоте. Гранулы хранили при -80 ° C до дальнейшей обработки. Разрушение клеток, выделение РНК и расщепление ДНК из осадка замороженных клеток выполняли с использованием 2 мл пробирок с лизирующим матриксом (сферические шарики диоксида кремния 0,1 мм, MP Biomedicals, Санта-Ана, Калифорния, США) и набора NucleoSpin ^® RNA Plus в комбинация с набором рДНКаз (Macherey-Nagel, Düren, Германия) в соответствии с протоколом Schaffert et al.(2019).

Количественная ПЦР с обратной транскрипцией (RT-qPCR)

Количественную ПЦР с обратной транскрипцией проводили согласно протоколу Wolf et al. (2017a) с использованием набора SensiFast SYBR No-Rox One-Step Kit (Bioline, Лондон, Великобритания) в 96-луночных планшетах для светоциклера (Sarstedt, Nümbrecht, Германия) в системе LightCycler 96 от Roche (Мангейм, Германия). программного обеспечения LightCycler ^® 96 SW 1.1 (Roche, Мангейм, Германия). Относительное количество РНК нормализовали по общей РНК (100 нг) и рассчитывали как 2 ^{–Δ Cq} .ΔCq рассчитывали как разницу средних значений Cq в мутантном штамме по сравнению с контрольным штаммом. Праймеры перечислены в дополнительной таблице S2.

RNAseq: подготовка библиотеки, секвенирование и обработка данных

РНК в трех экземплярах дикого типа и мутант с делецией выделяли из растущих культур и объединяли в эквимолярном пуле отдельно для дикого типа и мутанта с делецией (общее количество РНК по 2,5 мкг каждой в 26 мкл воды, свободной от РНКазы). Для удаления рРНК использовали набор для удаления рРНК Ribo-Zero для бактерий (Illumina, Сан-Диего, США).Успешное истощение рРНК проверяли с помощью чипа Agilent RNA 6000 Pico в Bioanalyzer (Agilent, Böblingen, Германия). Библиотеки кДНК получали в соответствии с протоколами от Pfeifer-Sancar et al. (2013) и Irla et al. (2015) с использованием набора мРНК TruSeq (Illumina, Сан-Диего, Калифорния, США). Библиотеки количественно оценивали с помощью чипа для анализа высокой чувствительности ДНК в биоанализаторе (Agilent, Böblingen, Германия) и секвенировали в прогоне HiSeq 1500 (2 × 75 нт) (Illumina, Сан-Диего, Калифорния, США).В результате секвенирования было получено около 10,7 миллиона пар чтения для библиотеки дикого типа и 10,2 миллиона пар чтения для библиотеки мутантных делеций, соответственно. Необработанные чтения были обрезаны по качеству с помощью Trimmomatic v0.3.5 (Bolger et al., 2014). Обрезанные чтения были сопоставлены с соответствующей эталонной последовательностью (GenBank: LT827010.1) с использованием bowtie2 в режиме парных концов (Langmead and Salzberg, 2012), что дало 20,7 и 19,5 миллионов сопоставлений. ReadXplorer использовался для визуализации и анализа дифференциальной экспрессии генов (Hilker et al., 2014, 2016).

Анализы из сырого экстракта протеина

Отбор и подготовка проб

Штаммы Actinoplanes выращивали в минимальной среде C-Pur при культивировании во встряхиваемой колбе, как описано выше. Чтобы провести сравнение с активностью в E. coli и Streptomyces ssp., Штаммы выращивали в комплексной среде NBS с добавлением 79 г / л ^-1 моногидрата глюкозы вместо 11 г / л ^-1 ( см. выше).

2.Собирали по 5 мл каждой культуры, дважды промывали промывочным буфером (0,1 М Трис (pH 7,4), 20 мМ KCl, 5 мМ MgSO ₄ ), ресуспендировали в 0,7 мл буфера для ресуспендирования (0,1 М Трис (pH 7,4), 20 мМ KCl, 5 мМ MgSO ₄ , 0,1 мМ ЭДТА, 1,5 мМ DTT, 10% (об. / об.) глицерина) и переносили в пробирку с завинчивающейся крышкой, содержащую микрошарики диоксида циркония / диоксида кремния (Bio Spec Products Inc., Bartlesville, United Состояний) размеров 0,1 и 0,05 мм. Клетки разрушали в гомогенизаторе (FastPrep FP120, Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) трижды по 20 с при установке скорости 6.5 и 5 минут на льду между ними. После центрифугирования (10 мин при 4 ° C) лизат переносили в колонку Easy Chromabond ^® (Macherey Nagel, Düren, Германия) для удаления остаточных углеводов в супернатанте. Перед нанесением образца колонки предварительно промывали 3 мл метанола, а затем 3 мл воды для регулирования условий связывания. Проточный поток (около 500 мкл) переносили в новую реакционную пробирку и добавляли 2 мл буфера для ресуспендирования.

Количественное определение общего белка проводили с помощью анализа Брэдфорда (Roti ^® -Nanoquant, Carl Roth GmbH & Co.KG, Карлсруэ, Германия). Образцы измеряли в 200 мкл анализа в мульти-титровальном планшете (96-луночные полистирольные планшеты Nunc ^TM с плоским дном от Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) в считывателе Tecan Infinite M200 (Ref 30016056, Tecan Group AG, Männedorf, Schweiz) согласно протоколу производителя. Для планирования и проведения экспериментов использовалось программное обеспечение i-control TM Microplate Reader (Tecan Group AG, Männedorf, Schweiz). BSA использовали в качестве стандарта для калибровочной кривой в диапазоне от 1 до 100 мкг / мл ^–1 .Для достижения аналогичных условий анализа образцы доводили до аналогичных количеств белка, что контролировалось вторым анализом Брэдфорда.

Процедура анализа

Ферментные анализы из сырых белковых экстрактов проводили в соответствии с протоколом Seibold et al. (2009) с уточненными условиями для Actinoplanes sp. SE50 / 110.

В тесте на гидролазу высвободившаяся глюкоза фосфорилировалась под действием гексокиназы до глюкозы-6P, которая является субстратом глюкозо-6P-дегидрогеназы.При окислении до 6-фосфоглюконолактона НАДФ восстанавливается до НАДФН. НАДФН имеет максимум поглощения при 340 нм. Интенсивность пика при 340 нм коррелирует с количеством высвобожденной глюкозы в образце.

Был приготовлен реакционный буфер, состоящий из 40 мкл 5x фосфатного буфера (50 мМ фосфат калия, pH 7,0), 20 мкл 10x MgCl ₂ -раствор (250 мМ), 4 мкл НАДФ (100 мМ, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Германия), 4 мкл АТФ (100 мМ, Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США), 2 ед. Гексокиназы из Saccharomyces cerevisiae (Sigma-Aldrich, St.Луис, Миссури, США), 2 ед. Глюкозо-6-Р-дегидрогеназы (AlfaAesar, Хаверхилл, Массачусетс, США) доведен до общего объема 90 мкл путем добавления ddH ₂ O. 10 мкл 100 мМ сахара ( мальтозу, трегалозу, мальтотриозу, мальтогептаозу или мальтодекстрин) или 10 мкл ddH ₂ O (пустой). Реакцию начинали после добавления 100 мкл образца. Высвобождение глюкозы измеряли по образованию НАДФН из НАДФ при 340 нм при 30 ° C в течение 3 часов.

Фосфоролитическую активность контролировали по высвобождению глюкозы-1P из активности предполагаемых мальтофосфорилаз.Для этого глюкоза-1P превращается в глюкозу-6P под действием фосфоглюкомутазы. Подобно тесту на гидролазу, глюкоза-6P служит субстратом для глюкозо-6P-дегидрогеназы, что приводит к восстановлению НАДФ до НАДФН.

Был приготовлен реакционный буфер, который состоял из 40 мкл 5x фосфатного буфера (50 мМ фосфат калия, pH 7,0), 20 мкл 10x MgCl ₂ -раствора (250 мМ), 4 мкл НАДФ (100 мМ, Carl Roth GmbH, Карлсруэ, Германия), 2 U-фосфоглюкомутаза (Sigma-Aldrich, St.Louis, США), 2 ед. Глюкозо-6-P-дегидрогеназы (AlfaAesar, Хаверхилл, Массачусетс, США) доведен до общего объема 90 мкл путем добавления ddH ₂ O согласно Seibold et al. (2009). Добавляли десять микролитров 100 мМ мальтогептаозы или мальтодекстринов или 10 мкл ddH ₂ O (пустой). Реакцию начинали после добавления 100 мкл образца. Высвобождение глюкозы-1P измеряли по образованию НАДФН из НАДФ при 340 нм при 30 ° C в течение 3 часов.

Невозможно контролировать активность трансгликозидазы, так как эта активность покрывается гидролитической активностью.

Каждый анализ выполняли с использованием трех биологических повторов, измеренных в двух технических повторах, и отдельного холостого опыта для каждого образца, которое вычитали из среднего значения обоих технических повторов. Реакции проводили в планшете с несколькими титрами (96-луночные полистирольные планшеты Nunc ^TM с плоским дном от Thermo Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) в считывателе Tecan Infinite M200 (Ref 30016056, Tecan Group AG, Männedorf, США). Швейцария).

Результаты

Исследования метаболизма мальтозы / мальтодекстрина в

Actinoplanes sp.SE50 / 110 С особым вниманием к структуре гена amlE-amlR Консервативные домены

генов кластера генов

aml и их геномная организация в Actinoplanes sp. SE50 / 110 и родственные виды

AmlE локализован в кластере генов вместе с двумя дополнительными генами (рис. 1): геном выше по течению ( ACSP50_2475 ), который ориентирован в направлении «голова к хвосту» и кодирует PurR / LacI-подобный регулятор транскрипции. и нижестоящий ген ( ACSP50_2473 ), кодирующий неохарактеризованный белок с дигуанилатциклазой и доменом фосфодиэстеразы.

Рисунок 1. Положение amlE в геноме Actinoplanes sp. SE50 / 110. Кластер гена aml состоит из генов, кодирующих регулятор транскрипции PurR / LacI-типа AmlR ( ACSP50_2475) , мальтазу AmlE ( ACSP50_2474 ) и неохарактеризованный белок с дигуанилатциклазой и фосфодиэстеразным доменом 90_.

Как и ACSP50_2475, который мы называем Actinoplanes регулятор фермента мальтазы AmlR, регуляторы PurR / LacI-типа являются частью семейства регуляторов LacI / GalR.Члены этого семейства регуляторов обычно являются репрессорами с N-концевым HTH-мотивом и C-концевым лиганд-связывающим доменом, сходным с периплазматическими сахаросвязывающими белками (Fukami-Kobayashi et al., 2003). Около 90% этого семейства регуляторов являются локальными регуляторами транскрипции метаболизма сахаров (Равчеев и др., 2014). Согласно поиску функционального домена NCBI (Marchler-Bauer et al., 2015, 2017), C-концевой периплазматический связывающий белок AmlR может быть классифицирован как суперсемейство периплазматического связывания типа 1 (данные не показаны).Члены этого семейства обычно связывают моносахариды, что приводит к изменениям активности связывания ДНК репрессорного домена.

ACSP50_2473, вероятно, участвует в метаболизме циклического дигуанилата (c-di-GMP), который является универсальным вторичным мессенджером, используемым в передаче сигналов (Römling et al., 2013). Поиск по консервативному домену (Marchler-Bauer et al., 2015, 2017) ACSP50_2473 показывает, что его генный продукт содержит консервативный домен GGDEF (Gly-Gly-Asp-Glu-Phe), который известен как активный сайт дигуанилата. циклазы (ДГК) (данные не представлены).Кроме того, обнаружен также EAL (Glu-Ala-Leu) -домен, известный как активный центр фосфодиэстераз (PDE) (данные не показаны). В то время как белки с доменом GGDEF, как было описано, катализируют циклический дигуанилат из двух молекул GTP (Römling et al., 2013; Tschowri, 2016), белки с доменом EAL, как описано, участвуют в его деградации: атакуя одну сложноэфирную связь кольцевого динуклеотида. , создается линейный динуклеотид (5′-фосфогуанилил- (3′ – 5 ′) — гуанозин, сокращенно: pGpG), который, как предполагалось, также действует как сигнальная молекула (обзор Römling et al., 2013; Цховри, 2016). Согласно TMHMM Server v. 2.0, инструменту для предсказания трансмембранных спиралей в белках (Krogh et al., 2001), ACSP50_2473 содержит N-концевой трансмембранный домен (данные не показаны).

AmlE представляет собой белок семейства 13 гликозидгидролаз. PhiBlast-анализ по базе данных прокариотических белков refseq NCBI (Altschul et al., 1997, 2005) показывает несколько белков семейства гликозидгидролаз 13 в семействе Micromonosporaceae с высокой идентичностью последовательности с AmlE (идентичность последовательностей между 76-90% и положительными). 100%) (рисунок 2).Гомологи также встречаются у родственных видов семейства Streptomycetaceae (идентичность последовательностей между 64-71% и положительными между 93-100%) (Рисунок 2). Это может указывать на дупликацию гена AmlE в этом таксоне.

Рис. 2. Анализ PhiBlast против прокариотической базы данных refseq NCBI (Altschul et al., 1997) показывает высокое распределение белков семейства 13 гликозидгидролаз с гомологией последовательностей с amlE в классе актинобактерий.

EDGAR 2.0, программная платформа для сравнительной геномики (Blom et al., 2016), был проведен поиск ортологичных генов AmlE в геноме родственных видов, чтобы увидеть, сохраняется ли организация amlE-amlR-ACSP50_2473 внутри семейства Micromonosporacea. Мы обнаружили аналогичный кластер генов, включающий PurR / LacI-подобный регулятор транскрипции и белок GGDEF-EAL-домена в Actinoplanes awajinensis sp. mycoplanecinus NRRL 16712, Actinoplanes teichomyceticus ATCC 31121 и Actinoplanes regularis DSM 43151 (Рисунок 3).

Рисунок 3. Кластер белков семейства 13 гликозидгидролаз с гомологией с amlE из Actinoplanes sp. SE50 / 110 и их геномное окружение согласно анализу с помощью программного обеспечения EDGAR 2.0. Ортологичные гены выделены цветом. Большинство сред включают гены, кодирующие предполагаемые транспортные белки ABC, алкансульфонатмонооксигеназу, UDP-N-ацетилглюкозаминпептид, N-ацетилглюкозаминилтрансферазу, которая окружена одним или двумя тандемно-ориентированными MerR-подобными регуляторами транскрипции.В четырех случаях был обнаружен ген, содержащий домен GGDEF-EAL, три из которых содержат ген с CsbD-подобным доменом, дивергентно размещенным от регулятора транскрипции LacI / PurR. Большинство сред содержат цинк-карбоксипептидазу или белок с мотивом HEXXH, который отсутствует в SE50 / 110. Ген, кодирующий сульфитоксидазу, встречается в 4 случаях, из которых один в A. utahensis локализован в направлении «голова к голове» к сенсорной гистидинкиназе (ген не окрашен особым образом). A. Regularis , кроме того, кодирует SAM-зависимую метилтрансферазу и регулятор транскрипции TetR в непосредственной близости от расположения гена amlE-amlR .Окружение гомологов amlE / amlR в A. friuliensis включает гипотетические гены или гены с неизвестной функцией, некоторые из которых содержат HTH- и оксидоредуктазный домен. В S. glaucescens GLA.O гомолог amlE является частью кластера генов биосинтеза акарбозы gac .

Среда этих кластеров генов включает гены, кодирующие предполагаемые транспортные белки ABC, алкансульфонатмонооксигеназу метаболизма серы, UDP-N-ацетилглюкозамин-пептид N-ацетилглюкозаминилтрансферазу, предположительно участвующую в гликозилировании белков, которая окружена генами, кодирующими два тандемно-ориентированных MerR-подобные регуляторы транскрипции (рис. 3).За исключением A. Regularis , небольшой белок с CsbD-подобным доменом аннотирован в непосредственной близости от расположения гена amlE-amlR (рис. 3). CsbD представляет собой бактериальный белок общей стрессовой реакции с неизвестной функцией, экспрессия которого опосредуется Sigma-B, альтернативным сигма-фактором (Prágai and Harwood, 2002). A. awajinensis, A. teichomyceticus и A. regularis включают ген, кодирующий цинк-карбоксипептидазу, который отсутствует в SE50 / 110. A. awajinensis и A. regularis дополнительно включают сульфитоксидазу метаболизма серы. A. Regularis , кроме того, кодирует SAM-зависимую метилтрансферазу и TetR-подобный регулятор транскрипции в непосредственной близости от расположения гена amlE-amlR .

В A. utahensis NRRL 12052, A. friuliensis DSM 43151, A. missouriensis 431 DSM 43046 и Streptomyces glaucescens GLA.O DSM 40922 предполагаемый гомолог amlE- встречается вместе с PurR / LacI / GalR-подобным геном регулятора транскрипции, но не с геном GGDEF-EAL-домена (рис. 3). Для A. utahensis и A. missouriensis была обнаружена аналогичная геномная среда, подобная описанной выше (фиг. 3). Окружение A. friuliensis существенно отличается: здесь расположены несколько гипотетических генов или генов с неизвестной функцией, некоторые из которых содержат неспецифические аннотации, такие как белок HTH-домена или оксидоредуктаза.

Интересно, что гомолог amlE из S. glaucescens GLA.O был идентифицирован как часть кластера генов биосинтеза акарбозы gac (рис. 3). Еще один гомолог amlE кодируется в S. glaucescens GLA.O: Здесь среда аналогична окружающей среде из S. lividans TK24 и S. coelicolor A3 (2), в которых AmlE -гомолог локализован вместе с другими генами метаболизма сахара, но не вместе с геном-регулятором типа LacI / PurR / GalR (данные не показаны).

Биоинформатический анализ метаболизма мальтозы / мальтодекстрина и исследование сахарозависимого профиля транскрипции

Чтобы сделать первые шаги в раскрытии метаболизма мальтозы / мальтодекстрина, мы провели поиск предполагаемых гомологов генов на моделях хорошо изученных организмов E. coli и C. glutamicum с помощью BlastP-анализа (Altschul et al. ., 1997, 2005). Мы обнаружили гомологи генов амиломальтазы MalQ, глюкозидазы MalZ и других генов метаболизма мальтозы / мальтодекстрина / гликогена (дополнительная таблица S3 и дополнительная фигура S1).Интересно, что MalP-гомолог не может быть идентифицирован в геноме Actinoplanes sp. SE50 / 110. Кроме того, BlastP-анализ по базе данных nr таксономической группы Actinomycetales показывает совпадения с наивысшими идентичностями и положительными (49% идентичностей, 64% положительных) для генов, аннотированных как гликогенфосфорилаза (GlgP), но не совпадений для генов, аннотированных как мальтодекстринфосфорилаза ( MalP) (данные не показаны). Это может указывать на недостаток MalP-фосфорилазы в этом таксоне.

AmlE-подобный белок не был описан для модельного организма E.coli или C. glutamicum. Согласно этому, анализы BlastP отображают только совпадения с недельной гомологией последовательностей с ферментами, аннотированными как гликозилтрансфераза ( C. glutamicum : 29% идентичностей, 43% положительных результатов) или альфа-фосфотреалаза ( E. coli : 36% идентичностей. , 50% положительных результатов) (Дополнительная таблица S3). Аналогично, мальтаза MalL из B. subtilis демонстрирует только недельное сходство последовательности с AmlE из A. sp. SE50 / 110 (30% идентичностей, 46% сходства).Других предполагаемых гомологов системы мальтоза / мальтодекстрин B. subtilis не было обнаружено в A. sp. SE50 / 110. Поэтому мы предполагаем, что система мальтоза / мальтодекстрин и роль MalL / AmlE развивались по-разному у B. subtilis и A. sp. SE50 / 110.

Другие предполагаемые гомологи amlE существуют в A. sp. SE50 / 110, а именно ACSP50_1177, ACSP50_6814 и ACSP50_6830 , обозначенные как α-гликозидазы (дополнительная таблица S3).

Поскольку экспрессия генов метаболизма мальтоза / мальтодекстрин и систем транспортеров была описана как сахарозависимая у E. coli, C. glutamicum и B. subtilis , мы проанализировали экспрессию идентифицированных гомологов генов в SE50. / 110 по глюкозе по сравнению с культурой, выращенной на мальтозе (дополнительный рисунок S2). Гены amlE и aglEFG были значимо дифференциально экспрессированы, демонстрируя пониженную экспрессию глюкозы по сравнению с мальтозой [log ₂ (кратное изменение]: amlE : 1390, aglE: 7.9, aglF : 4.6, aglG : 5.3) (Рисунок 4 и дополнительный рисунок S2). Для гена amlE репрессия глюкозы была дополнительно показана в смесях глюкозы и мальтозы (дополнительная фигура S3). На высокомолекулярных мальтодекстринах экспрессия amlE была аналогичной по сравнению с мальтозой (дополнительный рисунок S3).

Рисунок 4. Относительные количества транскриптов генов метаболизма и транспорта мальтозы / мальтодекстрина при выращивании на глюкозе по сравнению с выращенной на мальтозе культурой Actinoplanes sp.SE50 / 110 (относительное количество транскрипта мальтозы установлено равным 1). Достоверность дифференциальной транскрипции рассчитывали с помощью двустороннего теста t . Звездочки указывают значение значимости ( ^∗ p <α = 5%, ^∗∗ p <α = 1%) (вычисленное p -значения: amlE: 0,001533, malQ: 0,004633 , malZ: 0,05057, aglE : 0,01164, aglF : 0,03542, aglG : 0,01507, malE: 0.3132, malF: 0,07183, malG: 0,1593, pulA: 0,5535).

Интересно, что центральные гены метаболизма мальтозы / мальтодекстрина malZ и malQ , а также предполагаемые гены переносчиков мальтозы malEFG не были подавлены глюкозой (рис. 4). Для амиломальтазы MalQ отслеживали даже повышенную транскрипцию глюкозы по сравнению с мальтозой [log ₂ (кратное изменение): 3,3].

Важность и функция мальтазы AmlE

Фенотип роста делеционного мутанта Δ

amlE на различных источниках углерода

Мутант с делецией гена amlE был создан методом CRIPSR / Cas9.Мутант с делецией Δ amlE культивировали в минимальной среде на разных источниках углерода. По сравнению с диким типом, он показывает нормальный или слегка усиленный рост на глюкозе (рис. 5B, ▲) и сильную задержку роста на мальтозе (рис. 5A,). Согласно анализу субстратов, мальтоза не метаболизируется в мутанте с делецией Δ amlE , тогда как глюкоза потребляется на уровне дикого типа (дополнительные рисунки S4A, B). Рост Δ amlE был лучше на крахмале и C-pur по сравнению с ростом на мальтозе (фигура 5C и фигура 5D).C-Pur ( Cerestar 01908) представляет собой сахарный продукт разложения крахмала, который состоит в основном из мальтозы (43%) и мальтотриозы (40%) и высших мальтодекстринов (вероятно, мальтотетраозы, 16%) в соответствии с нашими анализами субстратов ( данные не показаны). Здесь Δ amlE достигает половины максимального сухого веса клеток по сравнению с диким типом (фиг. 5D,). На сложном крахмале-источнике углерода Δ amlE не достигает уровня дикого типа (фиг. 5C,).

Рисунок 5. Рост дикого типа (Δ) и делеционного мутанта Δ amlE (Δ) Actinoplanes sp. SE50 / 110 в минимальной среде с добавлением различных источников углерода: мальтозы ( A , черный), глюкозы ( B , синий), крахмала ( C , красный) и C-Pur ( D , зеленый). Мутант с делецией Δ amlE демонстрирует сильное ингибирование роста мальтозы ( A , количество биологических повторов n: n _{Δ amlE} = 4, n _wt = 5), снижение роста на крахмале. ( C , количество биологических повторов n: n _{Δ amlE} = 3, n _wt = 4) и почти такой же рост на глюкозе ( B , количество биологических повторов n : n _{Δ amlE} = 4, n _wt = 4) по сравнению с диким типом.В C-Pur Δ amlE достигает половины конечной сухой массы клеток по сравнению с диким типом ( D , количество биологических повторов n: n _{Δ amlE} = 4, n _wt = 4) . Средние значения средней максимальной сухой массы клеток (cdw _max ) делеционного мутанта Δ amlE и дикого типа сравнивали с помощью двустороннего t-теста [ p — значения: мальтоза (A) : 0,0003538, глюкоза (B) : 0,2021, крахмал (C) : 0.02508, C-pur (D) : 8.732e-06].

Чтобы исключить прямое ингибирующее действие мальтозы, были приготовлены смеси минимальной среды мальтозы и глюкозы в соотношении 50:50 и 90:10. При культивировании во встряхиваемой колбе мутант с делецией Δ amlE демонстрировал немного сниженный рост по сравнению с диким типом, но фенотип роста был значительно улучшен, приближаясь примерно к 80% от конечной сухой массы клеток дикого типа в обоих условиях (дополнительная фигура). S5).В смесях глюкозы и мальтозы делеционный мутант Δ amlE способен образовывать акарбозу в зависимости от фенотипа роста (дополнительный рисунок S6). Поскольку акарбоза является продуктом, связанным с ростом (Wendler et al., 2014; Wolf et al., 2017a), а фенотип роста не был полностью восстановлен в смесях мальтозы и глюкозы, конечный выход акарбозы снизился до r. а. 70% дикого типа. Однако это вернулось к эффектам роста. Состав и соотношение различных метаболитов акарвиозила, образованных Δ amlE , сравнимо с таковым из дикого типа: в обоих штаммах акарвиозил-мальтоза является основным компонентом при выращивании на мальтозе в качестве источника углерода, тогда как акарвиозил- глюкоза, акарвиозил-триоза и акарвиозил-тетраоза образуются в меньшей степени (данные не показаны), аналогично результатам, полученным Wendler et al.(2014). В смесях мальтозы и глюкозы доля акарвиозил-глюкозы выше, но аналогична для дикого типа и мутанта с делецией (данные не показаны). В целом, для AmlE не обнаружено прямой связи с синтезом акарвиозил-метаболита.

Ферментные анализы

подтверждают центральную роль в деградации мальтозы и отсутствии MalP в

Actinoplanes sp. SE50 / 110

Для оценки ферментативного спектра AmlE были проведены анализы активности необработанных белковых экстрактов делеционного мутанта Δ amlE и дикого типа в соответствии с протоколом Seibold et al.(2009). В связи с тем, что рост Δ amlE нарушается на мальтозе (раздел Фенотип роста делеционного мутанта ΔamlE о различных источниках углерода), а экспрессия amlE значительно подавляется в присутствии глюкозы (дополнительный рисунок). S3A), C-Pur был использован в качестве источника углерода, рост на котором ген amlE высоко экспрессируется у дикого типа (дополнительная фигура S3A). Крахмал не подходил для проведения анализа из-за мутности среды.Подобно предыдущим культивациям (фиг. 5D), Δ amlE достиг половины максимального сухого веса клеток дикого типа (дополнительная фигура S7). Анализ проводился на ранней стадии роста. Из-за различий в росте экстракты сырого протеина были доведены до аналогичных количеств протеина.

Гидролазная активность была обнаружена для мальтозы, мальтотриозы и мальтодекстринов в сырых белковых экстрактах Actinoplanes sp. SE50 / 110 (рисунок 6). Для мутанта с делецией Δ amlE на мальтозе определяли только ложную гидролазную активность (фиг. 6).Мальтотриоза и мальтодекстрин гидролизуются с одинаковой скоростью между 0 и 2000 с по сравнению с диким типом (фиг. 6). После этого гидролазная активность мальтотриозы и мальтодекстрина в сыром протеиновом экстракте Δ amlE снижается, вероятно, из-за высвобождения мальтозы из мальтотриозы и мальтодекстрина, который не служит субстратом. Что касается трегалозы, гидролазная активность не отличается у дикого типа и мутанта с делецией Δ amlE , но она была значительно ниже по сравнению с α-1,4-связанными сахарами (фиг. 6).Мальтогептаоза не подвергалась гидролизу (фиг. 6). В другом экспериментальном подходе также тестировали гидролазную активность α-1,6 связанной изомальтозы, но не было обнаружено различий для дикого типа и Δ amlE (дополнительная фигура S8). Активность трансгликозидазы (MalQ) невозможно контролировать с помощью этого вида анализа, поскольку она маскируется гидролитической активностью.

Рис. 6. Высвобождение НАДФН в анализах гидролитических ферментов, измеренное по оптической плотности при 340 нм.Показаны средние значения и стандартные отклонения для троек дикого типа (черный) и мутанта с делецией Δ amlE (красный). Образцы для анализа были взяты во время фазы роста после 47 часов культивирования (дополнительный рисунок S7).

Мы не смогли обнаружить активность фосфорилазы в сырых белковых экстрактах дикого типа и мутанте с делецией Δ amlE при использовании субстрата мальтогептаозы (фиг. 6). Для дальнейшей проверки использовали белковые сырые экстракты из клеток дикого типа Actinoplanes sp.Получали SE50 / 110 и E. coli DH5α, оба из которых выращивали в комплексной среде NBS. Чтобы подтвердить качество сырых белковых экстрактов и исключить инактивацию ферментативной функции из-за денатурации во время процесса экстракции, гидролитическая активность была определена как положительная для всех экстрактов заранее (данные не показаны). MalP-анализ выполняли с использованием мальтогептаозы субстратов и смеси мальтодекстринов. Действительно, MalP-активность не была обнаружена в Actinoplanes sp. Дикого типа.SE50 / 110, тогда как сильная фосфоролитическая активность была показана для E. coli на обоих субстратах (фигура 7).

Фигура 7. Высвобождение НАДФН в анализах ферментов MalP, измеренных по поглощению при 340 нм необработанного белкового экстракта из Escherichia coli DH5α (синий) и Actinoplanes sp. SE50 / 110 (черный). Показаны средние значения и стандартные отклонения трех повторов.

Аналогичные результаты были получены для сырых экстрактов S. lividans TK23, производного S.lividans 66 (Kieser et al., 2000), S. coelicolor A3 (2) M145 (ATCC BAA-471) и S. glaucescens GLA.O (DSM 40922): здесь активность MalP не измерялась. ни один (дополнительный рисунок S9), что соответствует анализу сходства последовательностей, описанному выше.

Регулятор PurR / LacI-типа AmlR является локальным репрессором транскрипции оперона

aml

Регулятор транскрипции PurR / LacI-типа AmlR (ACSP50 _ 2475) из семейства регуляторов LacI / GalR является многообещающим кандидатом для регуляции сахарозависимой экспрессии из-за его положения перед amlE (рис. ).

Мутант с делецией был создан методом CRISPR / Cas9, далее обозначаемый как Δ amlR. Регулирующий мутант демонстрирует нормальный рост на мальтозе (фиг. 8, ▲) и серьезное ингибирование роста глюкозы как источника углерода (фиг. 8,). Этот фенотип роста можно восстановить в смесях мальтозы и глюкозы (дополнительный рисунок S10). Образование акарбозы в Δ amlR на минимальной мальтозной среде существенно не отличается от дикого типа (значение p двустороннего теста t = 0.0965) (дополнительный рисунок S11).

Фигура 8. Рост дикого типа () и делеционного мутанта ▲ amlR (Δ) Actinoplanes sp. SE50 / 110 в минимальной среде, дополненной глюкозой из источника углерода (темно-синий, количество биологических повторов n: n _{Δ amlR} = 3, n _wt = 3) или мальтозой (черный, номер биологических реплик n: n _{Δa mlR} = 3, n _wt = 5).Показаны средние значения и стандартные отклонения сухой массы клеток при культивировании во встряхиваемой колбе. Сравнение делеционного мутанта Δ amlR с диким типом демонстрирует сходное поведение при росте мальтозы (▲) и сильное ингибирование роста глюкозы ().

Чтобы оценить регуляторный эффект на оперон aml , была выделена РНК из делеционного мутанта Δ amlR и дикого типа, и относительные количества транскриптов amlE ( ACSP50_2474 ) и ACSP50_2473 , измеренные с помощью RT -qPCR.Значительное увеличение количества транскриптов было обнаружено в отсутствие регулятора AmlR, когда клетки выращивали на глюкозе (фиг.9). Было обнаружено, что оба гена — amlE и ACSP50_2473 — примерно в 23-25 ​​раз сильнее транскрибируются в мутанте-регуляторе. Это указывает на функцию репрессора транскрипции.

Фигура 9. Относительная транскрипция amlE (ACSP50_2474) и ACSP50_2473 в делеционном мутанте Δ amlR по сравнению с диким типом Actinoplanes sp.SE50 / 110, когда клетки выращивают на мальтозе или глюкозе. В среде с минимальной мальтозой экспрессия оперона aml снижена в Δ amlR по сравнению с диким типом [log ₂ (кратное изменение) 0,67 ( amlE ) и 0,49 ( ACSP50_2473 )]. В среде с минимальной глюкозой экспрессия примерно в 24 раза выше в Δ amlR по сравнению с диким типом [log ₂ (кратность изменения) 23,43 ( amlE ) и 25,24 ( ACSP50_2473 )].Все эти различия были проверены двусторонним тестом t [ p -значения (от слева до справа ) = 0,0749, 0,0182, 0,0313, 0,0150]. Звездочкой обозначено значение значимости p <α = 5%.

Для культуры, выращенной на мальтозе, относительные количества транскриптов amlE схожи в Δ amlR по сравнению с диким типом и немного уменьшены для ACSP50_2473 , но лишь в небольшой степени (Фиг.9).

Мы также проанализировали транскрипцию соседних локализованных генов. Они не отличаются от дикого типа (дополнительная фигура S14A). Единственным исключением является единственный ген ( ACSP50_2471 ) в середине оперона транспортера ACSP50_2470-2 . Этот оперон очень слабо транскрибируется как на глюкозной, так и на мальтозной минимальной среде. В связи с этим мы относим этот результат к техническому побочному эффекту, вызванному низкой базовой транскрипцией оперона и низким качеством РНК, что было обусловлено фенотипом плохого роста Δ amlR на глюкозе.

Последовательность перед amlE была проанализирована с помощью набора MEME (Bailey and Elkan, 1994; Bailey et al., 2009), чтобы найти палиндромные последовательности, которые могут служить предполагаемыми сайтами связывания для репрессора AmlR. Одна единственная палиндромная область была идентифицирована перед amlE , которая перекрывается с -35-гексамером промоторной области (фиг. 10).

Фигура 10. Палиндромная область перед amlE , перекрывающаяся с промоторной областью. (A) Положение палиндрома (желтый) в промоторной области amlE (синий и красный указывают кодирующие последовательности, а серый — гексамеры -10 и -35). (B) Мотив, сгенерированный и визуализированный набором цМемов, показанный как 2-битный логотип (Bailey and Elkan, 1994; Bailey et al., 2009).

Палиндром перед amlE соответствует ожиданиям PurR / LacI-ассоциированного связывающего мотива: палиндромы LacI-типа обычно расположены на 140–30 п.н. выше стартового кодона (75%) (Ravcheev et al., 2014). Большинство палиндромов — это даже палиндромы, тогда как неканонические палиндромы были обнаружены только в 4% всех случаев (Равчеев и др., 2014). Большинство четных палиндромов содержат консенсусную пару ЦТ в центре (Равчеев и др., 2014). Идентифицированный мотив в -35-области промотора amlE представляет собой четный палиндром с центральной парой CG. Мотив, состоящий из 12 нуклеотидов, сравнительно короткий. Однако палиндромные сайты связывания только с 12 консервативными нуклеотидами уже были описаны для PurR-подобных регуляторов транскрипции Ravcheev et al.(2014). Вариации палиндрома сканировали по всему геному с помощью инструмента FIMO (Grant et al., 2011). Точная последовательность, показанная на фиг. 10B, встречается в геноме только один раз: перед amlE.

Для идентификации дальнейших предполагаемых мишеней репрессора AmlR были проведены дополнительные анализы транскриптома Δ amlR и дикого типа, выращенного на минимальной среде с глюкозой: для глобального предварительного скрининга мы использовали объединенную библиотеку для RNAseq (дополнительный файл S2) и подтвердили эти результаты для всего 25 генов с помощью RT-qPCR (дополнительный рисунок S14).

Из-за ограничений роста (рис. 8) и, как следствие, низкого качества РНК, что усложняет анализ транскриптомов, реакция на уровне РНК была очень разнообразной (дополнительный рисунок S12), и были затронуты различные функциональные классы (дополнительный рисунок S13). Согласно анализу DeSeq2 (Love et al., 2017), в общей сложности 313 генов были существенно дифференцированно транскрибированы (список дифференциально транскрибируемых генов в дополнительном файле S2). Неожиданно для мутанта с делецией репрессора, 207 генов были значительно меньше и 106 значительно сильнее транскрибировались в Δ amlR по сравнению с диким типом (дополнительная фигура S12).Они кодируют транспортные системы (29), метаболические реакции (86), клеточные процессы и передачу сигналов (33), репликацию и репарацию ДНК (3), а также хранение и обработку информации (31), включая 23 предполагаемых регулятора транскрипции, а также другие функции (дополнительный рисунок S13). ).

Сложный ответ на уровне транскрипции и фенотип роста Δ amlR объясняет сложные, многогранные и плейотропные вторичные эффекты, а не первичный эффект за счет делеции AmlR.В этом контексте сверхэкспрессия гена ACSP50_2473 в мутанте-регуляторе (фиг. 9) может играть жизненно важную роль, поскольку он, вероятно, участвует в метаболизме глобального вторичного мессенджера c-di-GMP.

Обсуждение

Реконструкция метаболизма мальтозы / мальтодекстрина в

Actinoplanes sp. SE50 / 110

Дисахарид мальтоза является основным источником углерода в большинстве сред для культивирования Actinoplanes sp. SE50 / 110, потому что он служит поставщиком энергии, с одной стороны, и ключевым предшественником биосинтеза акарбозы, с другой.Однако раньше об использовании мальтозы было мало что известно.

Мы реконструировали метаболизм мальтозы / мальтодекстрина у Actinoplanes sp. SE50 / 110, следуя моделям E. coli (Boos and Shuman, 1998; Park et al., 2011), C. glutamicum (Seibold et al., 2007, 2009; Seibold and Eikmanns, 2007; Woo et al., 2010) и других микроорганизмов (дополнительный рисунок S1 и рисунок 11). Путем функционального предсказания улучшенной аннотации генома Wolf et al.(2017b) и сравнение гомологии с помощью анализа BlastP (Altschul et al., 1997, 2005), мы смогли отнести гомологи генов ко всем описанным функциям, за исключением MalP. Поскольку ни одна из функций MalP-фосфоролиза не может быть доказана с помощью анализа in vitro из сырых белковых экстрактов дикого типа, мы убеждены, что эта функция отсутствует у Actinoplanes sp. SE50 / 110.

Обращает на себя внимание отсутствие MalP-функции в SE50 / 110, так как для моделей E. coli и C.glutamicum , как MalQ, так и MalP, как было описано, необходимы для эффективного использования мальтодекстринов разного размера (Boos and Shuman, 1998; Seibold et al., 2009; Park et al., 2011).

Интересно, что вместо фосфоролитической активности MalP гидролитическая активность AmlE оказалась незаменимой для ассимиляции мальтозы у Actinoplanes sp. SE50 / 110.

AmlE представляет собой мальтазу, которая, как сообщается, чрезмерно экспрессируется в A. sp. SE50 / 110 при выращивании на мальтозе в качестве источника углерода (Wendler et al., 2015a). С помощью нашего анализа мы могли определить центральную роль в ассимиляции мальтозы, поскольку активность мальтазы полностью отсутствует в сырых белковых экстрактах Δ amlE . Центральная функция в гидролизе трегалозы, изомальтозы или высших мальтодекстринов не может быть подтверждена нашим анализом. В соответствии с этим, наблюдались серьезные недостатки роста для Δ amlE на мальтозе в качестве источника углерода. Этот фенотип роста можно частично восстановить путем добавления более высоких мальтодекстринов или глюкозы.Оказалось, что AmlE в основном ответственен за деградацию мальтозы, которую нельзя заменить другими гликозидазами системы мальтоза / мальтодекстрин. На основании этого мы заключаем, что активности MalQ- и MalZ-гомологов недостаточны для удовлетворения потребностей клетки в делеционном мутанте Δ amlE при выращивании на мальтозе. Это соответствует тому, что мы ожидали от других бактерий: в E. coli сообщалось, что мальтоза не служит субстратом для MalQ и MalZ, и требуется минимальная длина трех гликозильных остатков (Boos and Shuman , 1998; Park et al., 2011). Следовательно, также предполагаемые гомологи amlE , идентифицированные в SE50 / 110 путем сравнения последовательностей, не представляют собой истинных функциональных гомологов AmlE.

Мы предполагаем, что в Actinoplanes sp. SE50 / 110, AmlE выполняет основную функцию в ассимиляции мальтозы в системе мальтоза / мальтодекстрин (фиг. 11). Эта функция незаменима, что может быть связано с отсутствием фосфоролитической функции (MalP), из-за которой ассимиляция мальтозы и мальтодекстринов зависит от трансгликолитической и гидролитической активности.

Интересно, коррелирует ли присутствие AmlE-гомологов в классе Actinomycetales с отсутствием MalP-функции. BlastP-анализы по базе данных nr таксономической группы Actinomycetales показывают, что большинство этих видов кодируют гликогенфосфорилазу GlgP, а не мальтодекстринфосфорилазу MalP. Это может указывать на то, что у других видов этого отряда отсутствует функция MalP, что было доказано для трех репрезентативных видов семейства Streptomycetaceae. Хотя, насколько известно авторам, системы мальтоза / мальтодекстрин этих хозяев еще не были проанализированы и поэтому нуждаются в дальнейшем исследовании.

В совокупности мы предлагаем первую модель метаболизма мальтозы / мальтодекстрина у Actinoplanes sp. SE50 / 110, для которого, по-видимому, характерно отсутствие MalP и присутствие AmlE. Возможность переноса этой модели на других представителей таксона еще предстоит изучить.

Встречаемость гена

amlE-amlR в семействе Micromonosporaceae и взаимосвязь с кластером генов биосинтеза акарбозы

Белки гликозидгидролазы 13, гомологичные AmlE, широко распространены.У видов семейства Micromonosporaceae amlE -гомологи были обнаружены в опероне вместе с геном-регулятором PurR / LacI / GalR в генетической среде, кодирующей различные функциональные классы. Напротив, он локализован без регулирующего гена и вместе с другими белками метаболизма сахара у видов семейства Streptomycetaceae. Это указывает на то, что — несмотря на высокое сходство последовательностей — гомологи amlE из Actinoplanes могли развиться отдельно от гомологов из Streptomyces .

Интересно, что S. glaucescens GLA.O аннотирует второй amlE -гомолог, который является частью кластера гена акарбозы gac . Здесь, сравнимо с расположением в Actinoplanes ssp., Он встречается вместе с LacI / GalR-подобным регулятором транскрипции (GarC2, Rockser and Wehmeier, 2009). Присутствие этой генной структуры в опероне gac S. glaucescens удивительно и поднимает вопросы, связаны ли и как метаболизм акарбозы и сахара друг с другом.

Обе системы — оперон aml и acb — участвуют в метаболизме сахара, но имеют разные области влияния: в то время как AmlE отвечает за внутриклеточную ассимиляцию мальтозы, акарбоза участвует во внеклеточном метаболизме, действуя как ингибитор. чужеродных α-глюкозидаз и карбофора (Wehmeier, Piepersberg, 2009). Регуляторный баланс обеих систем может быть жизненно важным, поскольку мальтоза является субстратом или предшественником обеих систем.

В SE50 / 110 обе системы разделены пространственно и нормативно.Прямого участия AmlE в биосинтезе акарбозы или прямого регуляторного эффекта AmlR на гены acb в данной работе не наблюдалось. Поэтому мы предполагаем, что оперон aml и acb развились отдельно в Actinoplanes sp. SE50 / 110. Эта гипотеза подтверждается тем фактом, что оперон aml встречается у других видов семейства Micromonosporaceae, а генный кластер acb — нет. Тем не менее, в S . glaucescens GLA.O, оба включены в один — кластер генов gac — вместе с двумя регуляторными генами: упомянутым ранее регулятором типа LacI / GalR (GarC2) и вторым регулятором, названным GarC1, гомологичным регулятору акарбозы. AcrC SE50 / 110, описанный Wolf et al. (2017a) и Rockser и Wehmeier (2009).

Мы подозреваем эволюцию кластера генов acb следующим образом: В SE50 / 110 кластер генов acb развился раньше и был интегрирован в глобальный метаболизм сахара.Во время этой эволюции регулятор AcrC переключил свой регулон с генов malEFG на acbD, acbE и acbZ , как предполагали Wolf et al. (2017a). В GLA.O оперон aml и кластер генов биосинтеза акарбозы были включены на более поздней стадии, что потребовало одновременного переноса соответствующих регуляторных генов, а именно AmlR-гомолога GarC2 и AcrC-гомолога GarC1.

Таким образом, метаболизм сахара и акарбозы тесно связан друг с другом, поскольку для синтеза метаболитов акарвиозила требуются прекурсоры сахара (Wendler et al., 2014), его производство строго связано с ростом (Wendler et al., 2014; Wolf et al., 2017a), и предполагается, что его продукт участвует в приобретении молекул сахара (Wehmeier and Piepersberg, 2004, 2009 ). Совместная эволюция расположения гена amlE-amlR вместе с кластером генов биосинтеза акарбозы маловероятна для Actinoplanes sp. SE50 / 110, но мог произойти для вида S. glaucescens GLA.O. Эта взаимосвязь метаболизма сахара и акарвиозила требует дальнейшего изучения.

Анализ транскриптома

выявил отсутствие глобального регулятора системы мальтоза / мальтодекстрин и показал, что AmlR является локальным глюкозозависимым репрессором транскрипции оперона

aml

Экспрессия генов, участвующих в поглощении и ассимиляции мальтозы и мальтодекстринов, была описана как сахарозависимая у различных видов, таких как E. coli (Boos and Shuman, 1998), S. lividans (Nguyen et al. , 1997; Nguyen, 1999; Schlösser et al., 2001), S. coelicolor (van Wezel et al., 1997a, b) и B. subtilis (Schönert et al., 1998, 2006).

В Actinoplanes sp. SE50 / 110, сахарозависимая экспрессия генов mal предполагалась в прошлом, поскольку первые признаки были предоставлены обширным протеомным анализом (Wendler et al., 2015a). Действительно, глобальный регулятор транскрипции mal генов еще не обнаружен.

Чтобы получить дополнительные знания, мы провели анализ транскриптома трех экземпляров дикого типа, выращенных на мальтозе или глюкозе в качестве основного источника углерода.Мы смогли подтвердить репрессию глюкозы для amlE и aglEFG , что соответствует предыдущим результатам Wendler et al. (2015a). Поразительно, что ни один другой ген метаболизма мальтозы / мальтодекстрина не экспрессировался по-разному. Следовательно, система mal SE50 / 110 не регулируется в глобальном масштабе в зависимости от сахаров мальтозы или глюкозы.

Путем делеции регулятора транскрипции PurR / LacI-типа AmlR была продемонстрирована глюкозозависимая репрессия оперона aml .В Δ amlR , amlE и ACSP50_2473 транскрибируются в 23 раза, соответственно, в 25 раз выше, чем у клеток дикого типа, когда клетки выращивали на глюкозе. Предполагаемый палиндромный связывающий мотив из 12 нуклеотидов был идентифицирован в промоторной области amlE , что соответствует ожиданиям связывающего мотива PurR / LacI-типа. Мотив встречается только один раз в геноме Actinoplanes sp. SE50 / 110.

Таким образом, мы предполагаем, что AmlR является локальным репрессором оперона aml .

Глобальные эффекты путем удаления локального репрессора транскрипции и предполагаемой связи с метаболизмом c-di-GMP

Делеционный мутант Δ amlR проявляет сильное ингибирование роста глюкозы и сложный ответ на уровне транскриптома. Поскольку AmlR действует как локальный репрессор транскрипции, и в этой статье не удалось идентифицировать другие первичные мишени, мы предполагаем вторичные эффекты за счет сверхэкспрессии ACSP50_2473 .

ACSP50_2473 представляет собой белок тандемного домена GGDEF-EAL. Actinoplanes sp. SE50 / 110 содержит в общей сложности 67 белков домена GGDEF или EAL, 48 из которых содержат мотив GGDEF-EAL-тандем (данные не показаны). Наличие обоих доменов с противоположной ферментативной активностью было описано как ферментативная головоломка (Ross et al., 1987; den Hengst et al., 2010; Hull et al., 2012; Römling et al., 2013; Mouri et al., 2017): с одной стороны, один из двух доменов может выполнять новые функции в связывании субстратов или во взаимодействиях белок-белок (Römling et al., 2013). С другой стороны, оба домена могут быть ферментативно активными, но по-разному регулироваться, что обсуждалось спорно в прошлом (Römling et al., 2013). Однако, хотя ферментативная функция ACSP50_2473 остается неясной, мы думаем, что он каким-то образом участвует в метаболизме c-di-GMP / pGpG.

Циклический дигуанилат — один из наиболее распространенных вторичных мессенджеров у бактерий. Он играет жизненно важную роль в передаче сигналов во время таких процессов, как образование биопленок, подвижность, вирулентность, клеточный цикл и дифференцировка (Römling et al., 2013). C-di-GMP является конформационно гибким и может связываться как линейный мономер, интеркалированный димер или тетрамер с различными эффекторными комплексами (обзор Tschowri, 2016). Из-за этой гибкости биоинформатическое предсказание сайтов связывания c-di-GMP затруднено: на сегодняшний день описано 6 классов эффекторов c-di-GMP (обзор в Tschowri, 2016). Также сообщалось о кросс-системной активации между вторичными мессенджерами нуклеотидов и гибридными вторичными мессенджерами c-AMP-GMP (Fong and Yildiz, 2008; Pesavento and Hengge, 2009; Davies et al., 2012; Ремлинг и др., 2013; Луо и др., 2015). Благодаря этому c-di-GMP может участвовать на нескольких регуляторных уровнях, таких как аллостерическая регуляция, регуляция транскрипции и локализованный протеолиз, и, по-видимому, реагирует на различные параметры окружающей среды (обзор у Pesavento and Hengge, 2009). Огромное количество белков с отвечающим или координирующим доменом c-di-GMP, а также их множественность у отдельных видов подняли вопрос о том, как можно достичь специфичности передачи сигналов без вредных перекрестных помех (Pesavento and Hengge, 2009; Seshasayee et al., 2010). Предполагалось, что как глобальные, так и локальные концентрации c-di-GMP определяют фенотипический выход (обзор в Pesavento and Hengge, 2009; Römling et al., 2013). Согласно этому, компьютерный анализ 11 248 GGDEF и EAL-содержащих белков из 867 прокариотических геномов показал, что половина из них содержит сигнал для локализации на клеточной поверхности, с помощью которого их активность может быть пространственно разделена (Seshasayee et al., 2010) .

Мы обнаружили N-концевой трансмембранный домен в ACSP50_2473.Благодаря этому и его организации в структуре гена amlE-amlR , может быть возможен локальный эффективный диапазон, f. е. в предоставлении обратной связи регулятору транскрипции AmlR. Однако из-за сильного торможения роста и сложного транскриптомного ответа, наблюдаемого в Δ amlR , мы предполагаем дальнейшее участие в глобальном механизме «переключения образа жизни» c-di-GMP / pGpG.

Мы провели поиск показаний для c-di-GMP / pGpG-опосредованных регуляторных процессов в Δ amlR .Действительно, анализ транскриптома показал дифференциальную транскрипцию нескольких генов биосинтеза вторичных метаболитов и генов, участвующих в споруляции, делении клеток, дыхании, передаче сигналов, включая 2 дополнительных тандемных белка GGDEF-EAL и 23 регулятора из различных семейств регуляторов. Возможно, что транскрипция этих генов модулируется c-di-GMP / pGpG-зависимыми эффекторными комплексами, которые могут вызывать глобальные эффекты.

Однако метаболизм вторичных мессенджеров нуклеотидов, в частности метаболизм c-di-GMP, изучен плохо (Pesavento and Hengge, 2009; Römling et al., 2013). Следовательно, невозможно описать все последствия, которые могут быть вызваны сверхэкспрессией ACSP50_2473 на глюкозе. Путем предварительного скрининга транскриптома Δ amlR стало возможным выявить предполагаемые вторичные эффекты, вызываемые комплексами c-di-GMP / pGpG-эффектор. Мы обнаружили множество предполагаемых генов-мишеней с широким спектром функций, касающихся морфологических и регуляторных изменений, которые требуют дальнейшего изучения.

Очень интересно, что структура гена amlE-amlR , по-видимому, участвует в глобальных физиологических процессах.Поскольку мальтоза является одним из важнейших источников углерода для Actinoplanes sp. SE50 / 110, который одновременно служит предпочтительным предшественником синтеза акарвиозил-метаболита (Wendler et al., 2014), соединение с другими системами, участвующими в росте и морфологических изменениях, кажется разумным. Для обитающих в почве микроорганизмов, которые должны быстро адаптироваться к изменениям в питании, может быть полезно гибко выбирать между использованием мальтозы в качестве источника энергии или в качестве предшественника биосинтеза акарбозы, что может обеспечить дальнейшие источники углерода через механизм карбофора. или подавлением микробных конкурентов.

Заявление о доступности данных

Наборы данных, созданные для этого исследования, можно найти в базе данных ArrayExpress, https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-MTAB-8404/ (инвентарный номер E-MTAB-8404).

Авторские взносы

LS разработал, спланировал и интерпретировал экспериментальную работу, составил рукопись и выполнил исследования in silico , эксперименты по выращиванию Δ amlE , ферментативные анализы и анализы транскриптомов. LS и JD сконструировали делеционные мутанты Δ amlE и Δ amlR с помощью CRISPR / Cas9.SD поддержала лабораторные работы по экспериментам по выращиванию Δ amlR и анализу субстратов. TB секвенировал РНК-библиотеку. БД выполнила обработку и отображение данных. JK, SS-B и MP помогли интерпретировать данные и отредактировали рукопись. JK и AP координировали исследование.

Финансирование

Это исследование финансировалось Bayer AG (Леверкузен, Германия). Мы признательны Deutsche Forschungsgemeinschaft и Фонду публикаций открытого доступа Билефельдского университета за поддержку платы за обработку статей.

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Мы благодарим доктора Кристиана Рюкерта за практические советы и доктора Винфрида Розена, доктора Янину Янсонг и Тилля Земке за консультации по проекту.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https: // www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2019.02448/full#supplementary-material

Сноски

Список литературы

Альтшул, С. Ф., Гиш, В., Миллер, В., Майерс, Э. У. и Липман, Д. Дж. (1990). Базовый инструмент поиска локального выравнивания. J. Mol. Биол. 215, 403–410. DOI: 10.1016 / S0022-2836 (05) 80360-2

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Альтшул, С.Ф., Мэдден, Т.Л., Schäffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W., et al. (1997). Gapped BLAST и PSI-BLAST: новое поколение программ поиска по базам данных белков. Nucleic Acids Res. 25, 3389–3402. DOI: 10.1093 / nar / 25.17.3389

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Альтшул, С. Ф., Вуттон, Дж. К., Герц, Э. М., Агарвала, Р., Моргулис, А., Шеффер, А. А., и др. (2005). Поиск в базе данных белков с использованием матриц замещения, скорректированных по составу. FEBS J. 272, 5101–5109. DOI: 10.1111 / j.1742-4658.2005.04945.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бейли, Т. Л., Боден, М., Буск, Ф. А., Фрит, М., Грант, К. Э., Клементи, Л. и др. (2009). Пакет MEME: инструменты для обнаружения и поиска мотивов. Nucleic Acids Res. 37, W202 – W208. DOI: 10.1093 / nar / gkp335

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бейли Т. Л. и Элкан К. (1994). Подбор модели смеси путем максимизации ожидания для обнаружения мотивов в биополимерах. Proc. Int. Конф. Intell. Sys. Мол. Биол. 2, 28–36.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Бентли, С. Д., Чейтер, К. Ф., Серденьо-Таррага, А.-М., Чаллис, Г. Л., Томсон, Н. Р., Джеймс, К. Д. и др. (2002). Полная последовательность генома модельного актиномицета Streptomyces coelicolor A3 (2). Природа 417, 141–147. DOI: 10.1038 / 417141a

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бейер, Х.М., Гоншорек, П., Самоделов, С. Л., Мейер, М., Вебер, В., и Зурбригген, М. Д. (2015). Клонирование AQUA: универсальный и простой подход к клонированию без использования ферментов. PLoS One 10: e0137652. DOI: 10.1371 / journal.pone.0137652

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Blom, J., Kreis, J., Spänig, S., Juhre, T., Bertelli, C., Ernst, C., et al. (2016). EDGAR 2.0: усовершенствованная программная платформа для сравнительного анализа содержания генов. Nucleic Acids Res. 44, W22 – W28.DOI: 10.1093 / nar / gkw255

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Боос, В., и Шуман, Х. (1998). Система мальтоза / мальтодекстрин Escherichia coli : транспорт, метаболизм и регуляция. Microbiol. Мол. Биол. Ред. MMBR 62, 204–229.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Brunkhorst, C., и Schneider, E. (2005). Характеристика транспорта мальтозы и мальтотриозы у бактерий-продуцентов акарбозы Actinoplanes sp. Res. Microbiol. 156, 851–857. DOI: 10.1016 / j.resmic.2005.03.008

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кобб Р. Э., Ван Ю. и Чжао Х. (2015). Высокоэффективное мультиплексное редактирование генома видов Streptomyces с использованием инженерной системы CRISPR / Cas. ACS Synth. Биол. 4, 723–728. DOI: 10.1021 / sb500351f

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дэвис, Б. В., Богард, Р. В., Янг, Т.С., и Мекаланос, Дж. Дж. (2012). Скоординированная регуляция дополнительных генетических элементов продуцирует циклические динуклеотиды для вирулентности V. cholerae . Ячейка 149, 358–370. DOI: 10.1016 / j.cell.2012.01.053

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

ден Хенгст, К. Д., Тран, Н. Т., Бибб, М. Дж., Чандра, Г., Лески, Б. К. и Баттнер, М. Дж. (2010). Гены, необходимые для морфологического развития и продукции антибиотиков у Streptomyces coelicolor , являются мишенями для BldD во время вегетативного роста. Mol. Microbiol. 78, 361–379. DOI: 10.1111 / j.1365-2958.2010.07338.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Энглер К., Кандзия Р. и Мариллонне С. (2008). Одноразовый, одноэтапный прецизионный метод клонирования с высокой производительностью. PLoS One 3: e3647. DOI: 10.1371 / journal.pone.0003647

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фонг, Дж. К. Н., и Йылдыз, Ф. Х. (2008). Взаимодействие между циклическим AMP-циклическим белком рецептора AMP и циклической передачей сигналов di-GMP в формировании биопленки Vibrio cholerae . J. Bacteriol. 190, 6646–6659. DOI: 10.1128 / JB.00466-08

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фроммер В., Юнге Б., Мюллер Л., Шмидт Д. и Трущайт Е. (1979). Neue ferminhibitoren aus mikroorganismen. Planta Med. 35, 195–217. DOI: 10.1055 / с-0028-1097207

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фуками-Кобаяси, К., Татено, Ю., и Нисикава, К. (2003). Параллельная эволюция специфичности лиганда между репрессорами семейства LacI / GalR и периплазматическими сахаросвязывающими белками. Mol. Биол. Evol. 20, 267–277. DOI: 10.1093 / molbev / msg038

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гибсон, Д. Г., Янг, Л., Чуанг, Р.-Й., Вентер, Дж. К., Хатчисон, К. А., и Смит, Х. О. (2009). Ферментативная сборка молекул ДНК до нескольких сотен килобаз. Nat. Методы 6, 343–345. DOI: 10.1038 / nmeth.1318

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Грант, С. Г., Джесси, Дж., Блум, Ф.Р. и Ханахан Д. (1990). Дифференциальное спасение плазмиды из ДНК трансгенных мышей в мутанты с ограничением метилирования Escherichia coli . Proc. Nat. Акад. Sci. США 87, 4645–4649. DOI: 10.1073 / pnas.87.12.4645

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Hilker, R., Stadermann, K. B., Doppmeier, D., Kalinowski, J., Stoye, J., Straube, J., et al. (2014). Readxplorer – визуализация и анализ нанесенных на карту последовательностей. Биоинформатика 30, 2247–2254.DOI: 10.1093 / биоинформатика / btu205

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Hilker, R., Stadermann, K. B., Schwengers, O., Anisiforov, E., Jaenicke, S., Weisshaar, B., et al. (2016). Readxplorer 2-подробный анализ карт чтения и визуализация из одного источника. Биоинформатика 32, 3702–3708. DOI: 10.1093 / биоинформатика / btw541

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Халл, Т. Д., Рю, М.-Х., Салливан, М.Дж., Джонсон, Р. К., Клена, Н. Т., Гейгер, Р. М. и др. (2012). Циклические Di-GMP фосфодиэстеразы RmdA и RmdB участвуют в регуляции морфологии и развития колоний в Streptomyces coelicolor . J. Bacteriol. 194, 4642–4651. DOI: 10.1128 / JB.00157-12

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ирла, М., Нешат, А., Браутасет, Т., Рюкерт, К., Калиновски, Дж., И Вендиш, В. Ф. (2015). Транскриптомный анализ термофильной метилотрофной бациллы methanolicus MGA3 с использованием РНК-секвенирования дает подробные сведения о ее ранее неизведанном ландшафте транскрипции. BMC Genomics 16:73. DOI: 10.1186 / s12864-015-1239-4

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кизер Т., Бибб М. Дж., Баттнер М. Дж., Чейтер К. Ф. и Хопвуд Д. А. (2000). Практическая генетика Streptomyces. Норвич: Фонд Джона Иннеса.

Google Scholar

Крог А., Ларссон Б., фон Хейне Г. и Зоннхаммер Э. Л. (2001). Прогнозирование топологии трансмембранного белка с помощью скрытой модели маркова: приложение для полных геномов. J. Mol. Биол. 305, 567–580. DOI: 10.1006 / jmbi.2000.4315

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лав М., Андерс С. и Хубер В. (2017). DESeq2. Биопроводник. Версия 1.16.1.

Google Scholar

Ло Ю., Чжао К., Бейкер А. Э., Кучма С. Л., Когган К. А., Вольфганг М. С. и др. (2015). Иерархический каскад вторичных мессенджеров регулирует поведение поверхности Pseudomonas aeruginosa . мБио 6. doi: 10.1128 / мБио.02456-14

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Marchler-Bauer, A., Bo, Y., Han, L., He, J., Lanczycki, C.J., Lu, S., et al. (2017). CDD / SPARCLE: функциональная классификация белков по архитектуре подсемейных доменов. Nucleic Acids Res. 45, D200 – D203. DOI: 10.1093 / nar / gkw1129

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Марчлер-Бауэр, А., Дербишир, М. К., Gonzales, N.R., Lu, S., Chitsaz, F., Geer, L.Y., et al. (2015). CDD: база данных сохраненных доменов NCBI. Nucleic Acids Res. 43, D222 – D226. DOI: 10.1093 / nar / gku1221

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Marchler-Bauer, A., Lu, S., Anderson, J. B., Chitsaz, F., Derbyshire, M. K., DeWeese-Scott, C., et al. (2010). CDD: база данных консервативных доменов для функциональной аннотации белков. Nucleic Acids Res. 39, D225 – D229. DOI: 10.1093 / nar / gkq1189

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Моури, Ю., Кониси, К., Фудзита, А., Тэдзука, Т., и Охниши, Ю. (2017). Регуляция образования спорангия с помощью BldD в редких актиномицетах actinoplanes missouriensis. J. Bacteriol. 199: e00840-16. DOI: 10.1128 / JB.00840-16

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Нгуен, Дж. (1999). Регуляторный белок reg1 из Streptomyces lividans связывает промоторную область нескольких генов, репрессированных глюкозой. FEMS Microbiol. Lett. 175, 51–58. DOI: 10.1111 / j.1574-6968.1999.tb13601.x

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Нгуен, Дж., Франсу, Ф., Вироль, М. Дж., И Герно, М. (1997). Гены амилазы и хитиназы у Streptomyces lividans регулируются reg1, плейотропным регуляторным геном. J. Bacteriol. 179, 6383–6390. DOI: 10.1128 / jb.179.20.6383-6390.1997

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Орцейфен, В.(2016). Genombasierte Modellbildung zur Biosynthese von Acarviostatin-Metaboliten in Drei Actinoplanes sp. SE50 / 110-Stämmen. Билефельд: Universität Bielefeld.

Google Scholar

Ортсейфен В., Винклер А., Альберсмайер А., Вендлер С., Пулер А., Калиновски Дж. И др. (2015). Полная последовательность генома актинобактерии Streptomyces glaucescens GLA.O (DSM 40922), состоящая из линейной хромосомы и одной линейной плазмиды. J. Biotechnol. 194, 81–83. DOI: 10.1016 / j.jbiotec.2014.11.036

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Паренти Ф. и Коронелли К. (1979). Представители рода actinoplanes и их антибиотики. Annu. Rev. Microbiol. 33, 389–411. DOI: 10.1146 / annurev.mi.33.100179.002133

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Park, J.-T., Shim, J.-H., Tran, P.L., Hong, I.-H., Yong, H.-U., Oktavina, E.F., et al. (2011). Роль мальтозных ферментов в синтезе гликогена Escherichia coli . J. Bacteriol. 193, 2517–2526. DOI: 10.1128 / JB.01238-10

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Пфайфер-Санкар К., Менц А., Рюкерт К. и Калиновски Дж. (2013). Комплексный анализ транскриптома Corynebacterium glutamicum с использованием усовершенствованной методики RNAseq. BMC Genomics 14: 888. DOI: 10.1186 / 1471-2164-14-888

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Prágai, Z.и Харвуд К. Р. (2002). Регуляторные взаимодействия между Pho и сигма (B) -зависимыми регуляторами общего стресса bacillus subtilis. Микробиология 148, 1593–1602. DOI: 10.1099 / 00221287-148-5-1593

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Равчеев Д.А., Хорошкин М.С., Лайкова О.Н., Цой О.В., Сернова Н.В., Петрова С.А. и др. (2014). Сравнительная геномика и эволюция регулонов факторов транскрипции LacI-семейства. Фронт.Microbiol. 5: 294. DOI: 10.3389 / fmicb.2014.00294

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Rockser, Y., and Wehmeier, U.F (2009). Кластер gac-генов для продукции акарбозы из Streptomyces glaucescens GLA.O: идентификация, выделение и характеристика. J. Biotechnol. 140, 114–123. DOI: 10.1016 / j.jbiotec.2008.10.016

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Römling, U., Гальперин М.Ю., Гомельский М. (2013). Циклический ди-GMP: первые 25 лет универсального бактериального вторичного мессенджера. Microbiol. Мол. Биол. Ред. 77, 1–52. DOI: 10.1128 / MMBR.00043-12

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Розак ​​К., Мертес Г. (2012). Критическая оценка роли акарбозы в лечении диабета: соображения пациентов. Diabetes Metab. Syndr. Ожирение. 5, 357–367. DOI: 10.2147 / DMSO.S28340

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Росс, П., Weinhouse, H., Aloni, Y., Michaeli, D., Weinberger-Ohana, P., Mayer, R., et al. (1987). Регуляция синтеза целлюлозы в acetobacter xylinum с помощью циклической дигуаниловой кислоты. Nature 325, 279–281. DOI: 10.1038 / 325279a0

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Schaffert, L., März, C., Burkhardt, L., Droste, J., Brandt, D., Busche, T., et al. (2019). Оценка векторных систем и промоторов для сверхэкспрессии гена биосинтеза акарбозы acbC в actinoplanes sp.SE50 / 110. Microb. Cell Fact. 18: 114. DOI: 10.1186 / s12934-019-1162-5

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шлёссер А., Вебер А. и Шремпф Х. (2001). Синтез переносчика ABC мальтодекстрина Streptomyces lividans зависит от присутствия регулятора MalR. FEMS Microbiol. Lett. 196, 77–83. DOI: 10.1111 / j.1574-6968.2001.tb10544.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Schönert, S.(2004). Maltose- und Maltodextrin-Verwertung in Bacillus Subtilis. Констанц: Университет Констанца.

Google Scholar

Шёнерт, С., Будер, Т., и Даль, М.К. (1998). Идентификация и ферментативная характеристика индуцируемой мальтозой α-глюкозидазы MalL (сахароза-изомальтаза-мальтаза) Bacillus subtilis . J. Bacteriol. 180, 2574–2578.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Schönert, S., Seitz, S., Krafft, H., Feuerbaum, E.-A., Andernach, I., Witz, G., et al. (2006). Утилизация мальтозы и мальтодекстрина Bacillus subtilis . J. Bacteriol. 188, 3911–3922. DOI: 10.1128 / JB.00213-06

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Зайболд, Г. (2008). Charakterisierung des Glycogen- und Maltosestoffwechsels von Corynebacterium Glutamicum. Ulm: Repositorium der Universität Ulm с открытым доступом.

Google Scholar

Зайболд, Г., Демпф, С., Шрейнер, Дж., И Эйкманнс, Б. Дж. (2007). Образование гликогена в Corynebacterium glutamicum и роль АДФ-глюкозопирофосфорилазы. Микробиология 153, 1275–1285. DOI: 10.1099 / mic.0.2006 / 003368-0

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Зайболд, Г. М., и Эйкманнс, Б. Дж. (2007). Продукт гена glgX Corynebacterium glutamicum необходим для деградации гликогена и для быстрой адаптации к гиперосмотическому стрессу. Микробиология 153, 2212–2220. DOI: 10.1099 / mic.0.2006 / 005181-0

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Зайболд, Г. М., Вурст, М., и Эйкманнс, Б. Дж. (2009). Роль мальтодекстрина и гликогенфосфорилаз в утилизации мальтозы и метаболизме гликогена у Corynebacterium glutamicum . Микробиология 155, 347–358. DOI: 10.1099 / mic.0.023614-0

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сешасаи, А.С. Н., Фрейзер, Г. М., Ласкомб, Н. М. (2010). Сравнительная геномика передачи сигналов cyclic-di-GMP у бактерий: посттрансляционная регуляция и каталитическая активность. Nucleic Acids Res. 38, 5970–5981. DOI: 10.1093 / nar / gkq382

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Shim, J.-H., Park, J.-T., Hong, J.-S., Kim, K. W., Kim, M.-J., Auh, J.-H., et al. (2009). Роль мальтогенной амилазы и пуллуланазы в метаболизме мальтодекстрина и гликогена Bacillus subtilis 168. J. Bacteriol. 191, 4835–4844. DOI: 10.1128 / JB.00176-09

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Стратманн А., Махмуд Т., Ли С., Дистлер Дж., Флосс Х. Г. и Пиперсберг В. (1999). Белок AcbC из видов Actinoplanes представляет собой C7-циклитолсинтазу, родственную 3-дегидрохинатсинтазам, и участвует в биосинтезе ингибитора -глюкозидазы акарбозы. J. Biol. Chem. 274, 10889–10896. DOI: 10.1074 / JBC.274.16.10889

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Тапио, С., Йе, Ф., Шуман, Х.А., и Боос, В. (1991). Ген malZ Escherichia coli , члена мальтозного регулона, кодирует мальтодекстринглюкозидазу. J. Biol. Chem. 266, 19450–19458.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Томас, Х. (2001). Метаболизмы акарбозы в Actinoplanes sp. SE50 / 110. Вупперталь: Университет Вупперталь. Кандидатская диссертация.

Google Scholar

ван Везель, Г. П., Уайт, Дж., Бибб, М. Дж., И Постма, П. В. (1997a). Кластер генов malEFG из Streptomyces coelicolor A3 (2): характеристика, нарушение и транскрипционный анализ. Mol. Genet Genet. 254, 604–608. DOI: 10.1007 / s004380050458

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

ван Везель, Г. П., Уайт, Дж., Янг, П., Постма, П. У. и Бибб, М. Дж. (1997b). Субстратная индукция и подавление глюкозой утилизации мальтозы Streptomyces coelicolor A3 (2) контролируется malR, членом семейства регуляторных генов lacl-galR. Mol. Microbiol. 23, 537–549. DOI: 10.1046 / j.1365-2958.1997.d01-1878.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Wehmeier, U. (2004). Acarbose, ein therapeutisch eingesetzter wirkstoff: биосинтез и функции. БИОспектрум 10, 34–36.

Google Scholar

Wehmeier, U.F., и Piepersberg, W. (2004). Биотехнология и молекулярная биология ингибитора альфа-глюкозидазы акарбозы. Заявл. Microbiol. Biotechnol. 63, 613–625. DOI: 10.1007 / s00253-003-1477-2

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Wehmeier, U.F., и Piepersberg, W. (2009). Глава 19 энзимология биосинтеза аминогликозидов — вывод из кластеров генов. Methods Enzymol. 459, 459–491. DOI: 10.1016 / S0076-6879 (09) 04619-9

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Wendler, S., Hürtgen, D., Kalinowski, J., Klein, A., Niehaus, K., Schulte, F., и другие. (2013). Цитозольные и внеклеточные протеомы actinoplanes sp. SE50 / 110 позволил идентифицировать генные продукты, участвующие в метаболизме акарбозы. J. Biotechnol. 167, 178–189. DOI: 10.1016 / j.jbiotec.2012.08.011

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Wendler, S., Ortseifen, V., Persicke, M., Klein, A., Neshat, A., Niehaus, K., et al. (2014). Зависимый от источника углерода биосинтез метаболитов акарвиозы в actinoplanes sp. SE50 / 110. J. Biotechnol. 191, 113–120. DOI: 10.1016 / j.jbiotec.2014.08.019

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Wendler, S., Otto, A., Ortseifen, V., Bonn, F., Neshat, A., Schneiker-Bekel, S., et al. (2015a). Сравнительный протеомный анализ actinoplanes sp. SE50 / 110, выращенный с мальтозой или глюкозой, показывает незначительные различия в отношении белков биосинтеза акарбозы, но основные различия в отношении транспортеров сахаридов. J. Proteom. 131, 140–148. DOI: 10.1016 / j.jprot.2015.10.023

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Wendler, S., Otto, A., Ortseifen, V., Bonn, F., Neshat, A., Schneiker-Bekel, S., et al. (2015b). Комплексный протеомный анализ actinoplanes sp. SE50 / 110 подчеркивает расположение белков, кодируемых акарбозой и кластером генов биосинтеза пиохелина. J. Proteom. 125, 1–16. DOI: 10.1016 / j.jprot.2015.04.013

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Вольф, Т.(2017). Регуляция транскрипции биосинтеза акарбозы у ACTINOPLANES sp. SE50 / 110 проанализирован с помощью секвенирования следующего поколения, транскриптомики и редактирования генома. Билефельд: Publikationen an der Universität Bielefeld.

Google Scholar

Wolf, T., Droste, J., Gren, T., Ortseifen, V., Schneiker-Bekel, S., Zemke, T., et al. (2017a). Регулятор типа MalR AcrC является репрессором транскрипции генов биосинтеза акарбозы в actinoplanes sp. SE50 / 110. BMC Genomics 18: 562.DOI: 10.1186 / s12864-017-3941-x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Wolf, T., Gren, T., Thieme, E., Wibberg, D., Zemke, T., Pühler, A., et al. (2016). Целевое редактирование генома у редких актиномицетов actinoplanes sp. SE50 / 110 с помощью системы CRISPR / Cas9. J. Biotechnol. 231, 122–128. DOI: 10.1016 / j.jbiotec.2016.05.039

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Вольф, Т., Шнейкер-Бекель, С., Нешат, А., Орцейфен В., Вибберг Д., Земке Т. и др. (2017b). Улучшение генома продуцента акарбозы actinoplanes sp. SE50 / 110 и уточнение аннотаций на основе анализа последовательности РНК. J. Biotechnol. 251, 112–123. DOI: 10.1016 / j.jbiotec.2017.04.013

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ву, Х. М., Ноак, С., Зайболд, Г. М., Уиллболд, С., Эйкманнс, Б. Дж., И Ботт, М. (2010). Связь между фосфатным голоданием и метаболизмом гликогена у Corynebacterium glutamicum , выявленная метаболомикой. Заявл. Environ. Microbiol. 76, 6910–6919. DOI: 10.1128 / AEM.01375-10

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мальтодекстрин веганский? — Your Vegan Journey

Мальтодекстрин — это полисахарид, у которого есть несколько полезных свойств. свойства в качестве пищевой добавки. ¹ Благодаря всем достижениям в технологии производства, которые использовались за последние 20 лет или около того, возможности для применения этой молекулы в пищевых продуктах увеличивается все время.

Потому что он настолько повсеместен на этикетках пищевых продуктов из-за множества использования, веганы часто сталкиваются с ингредиентом и хотят знать, подходит ли он для потребления.

Это веганский? Да, мальтодекстрин 100% веганский. По сути, это цепочка, состоящая из молекул простого сахара. глюкоза. Количество единиц может варьироваться, но в среднем цепочка насчитывает около семи молекулы глюкозы связаны вместе на молекулу мальтодекстрина. ²

Однако тот факт, что мальтодекстрин сам по себе является веганским, не означает, что каждое применение соединения является веганским.Итак, мы рассмотрим различные варианты использования соединения как в веганских, так и в невеганских приложениях, чтобы вы знали, когда пищевой продукт, содержащий этот ингредиент, подходит для веганского употребления.

Мальтодекстрин в веганской пище

Кукурузный и кукурузный сироп

Кукурузные сиропы можно приготовить разными способами. Например, HFCS (кукурузный сироп с высоким содержанием фруктозы) производится путем ферментативной изомеризации, которая преобразует молекулы глюкозы во фруктозу, повышая процент фруктозы в пище товар.

Кукурузные сиропы можно сушить, из них получается кукурузный сироп. твердые вещества из глюкозы и мальтодекстринов. ³

Кукурузный крахмал — это крахмал, полученный из кукурузы. Кукуруза содержит много мальтодекстринов, которые, опять же, представляют собой полисахариды с короткой цепью. Это достаточно мал, чтобы связываться с нашими вкусовыми рецепторами, и чем меньше молекула, тем слаще на вкус.

Итак, это полезно знать, потому что если кто-то обеспокоен мальтодекстрин не веганский, им нужно только учитывать, что он присутствует в природе кукурузы, которая является одним из основных продуктов питания для веганов.

Обезжиренные растительные ингредиенты

Жир играет важную роль в пище. Из ложного мяса Что касается муки, жир помогает улучшить ощущение во рту и добиться желаемых текстурных свойств.

Однако высокое общее содержание жира в результате добавления жир (или жир, естественно присутствующий в пище) увеличивает общее количество калорий. Так, несколько растительных ингредиентов для улучшения восприятия пищи потребителями. можно использовать вместо жира для получения тех же свойств без добавления калорий.

Несколько коммерческих мучных смесей (все они, как правило, веганские) включать заменители жира. ⁴

Особые ингредиенты, которые обычно используются в качестве заменителей жира включают крахмалы, такие как мальтодекстрин, а также камеди, бета-глюкан и клетчатку (как растворимые, так и нерастворимые). ⁵

Гидролизаты крахмала

Это необычный ингредиент, в котором вы не сомневаетесь встречается при сканировании этикеток на соответствие веганам.

Поскольку крахмал состоит из повторяющихся единиц глюкозы и может быть разбитым на эти отдельные единицы, его можно разбить на более мелкие молекулы, такие как мальтодекстрин, просто декстрин и декстроза (глюкоза), для достижения более сладкий вкус желателен для некоторых пищевых продуктов, таких как кондитерские изделия, консервы, и вино.

В пищевой промышленности глюкоза, полученная из крахмала, называется декстрозы и измеряет степень превращения глюкозы (из крахмала) в эквиваленты декстрозы или DE. ⁶

Любой продукт гидролиза крахмала, включая мальтодекстрин, является считается гидролизатом крахмала. ⁷

Фактически, наиболее распространенные твердые гидролизаты крахмала, используемые в пищевая промышленность в наши дни — это сухие вещества кукурузного сиропа (DE = 24-48) и сухие мальтодекстрины (ДЭ <20). ⁸

Устойчивый «крахмал»

Возможно, вы слышали о резистентном крахмале или RS.Это было набирает популярность в последнее время из-за его функционального использования в продуктах питания промышленность.

RS делится на четыре категории: RS1, RS2, RS3 и RS4. ⁹

Однако существует пятый тип растворимого полисахарида, называемый «Устойчивый мальтодекстрин». Потому что это не настоящий крахмал, обычно называется RS, но неудобоварим, как RS из-за перестановки молекулы крахмала в неперевариваемую форму. ¹⁰

Непитательные подсластители

Непитательные подсластители — это подсластители, не содержащие калорийность.Их используют в пищевых продуктах, потому что они снижают калорийность и возможность маркировки «без сахара».

Однако, хотя они и заменяют сладость сахара, им не хватает важные функциональные характеристики сахара, а именно: связывание, набухание, сбраживание, и текстурирование.

По этой причине в продукты с пониженным содержанием сахара и без сахара, чтобы компенсировать потерю этих функциональные свойства.

Соединения, заменяющие сахар, включают: мальтодекстрин, а также целлюлоза, полидекстроза и сахарные спирты. ^11,12

Например, Equal Granular объединяет мальтодекстрин и аспартам. Мальтодекстрин служит несладким наполнителем. ¹³

Equal (оригинал) представляет собой смесь мальтодекстрина, декстрозы и аспартам. Наполнитель важен, потому что сладкое вещество (аспартам) настолько слаще сахара, что для этого потребуется непрактичные измерительные инструменты для правильного дозирования.

Добавляя мальтодекстрин, вы можете использовать искусственный подсластители, такие как Equal, в соотношении (объеме) 1: 1 при использовании их в качестве сахара заменять.

Сухой маргарин

Вы, наверное, встречали порошковый маргарин на еде. этикетки. Сухой маргарин получают путем удаления жиров (растительных масел) и химическая обработка, сушка, а затем объединение высушенного вещества с различные сухие ингредиенты, такие как мальтодекстрины, твердые вещества кукурузного сиропа, красители, и гуаровая камедь.

Это не обычный домашний ингредиент, но он используется довольно часто. немного в пищевой промышленности, где его восстанавливают горячей водой и используют для добавить аромат в соусы, супы, овощи и выпечку. ¹⁴

Из-за добавления твердых веществ в нем меньше калорий по сравнению с к обычному маргарину.

Хлебобулочные изделия

В хлебобулочные изделия обычно используются некоторые пищевые добавки. как торт. Мальтодекстрин используется в жмыхе для улучшения стабильности и вкуса. ¹⁵

Содержание углеводов (в основном сахара) вызывает озабоченность. для людей, заботящихся о своем здоровье, а также людей с диабетом или гипогликемией, поэтому мальтодекстрин и аналогичные добавки используются для продуктов с пониженным содержанием сахара и без сахара. печенье и пирожные. ¹⁶

Исследования в области производства более здоровых полуфабрикатов продолжает разрабатывать тесто для торта и печенье практически без добавления простые сахара. ¹⁷

Одна проблема, с которой столкнулись исследователи при сокращении количество сахарозы в тортах и ​​печенье уменьшает набухание свойства, внесенные сахаром. Производителям коммерческих продуктов питания удалось решить эту проблему, используя определенные наполнители, такие как мальтодекстрины, полидекстроза, сахарные спирты, целлюлоза и нерастворимые волокна. ¹⁸

Веганское мороженое

В последнее время на рынке появилось несколько видов мороженого без молока. раз. В веганском мороженом используется мальтодекстрин, целлюлозная камедь и другие вещества. веганские добавки для усиления вкуса и действия как стабилизаторы. ¹⁹

Напитки

Спортивные напитки, такие как Gatorade, являются веганскими, если они не используются не веганские красители. Они обеспечивают углеводы в нескольких формах, включая: мальтодекстрин, сахароза и глюкоза.

Многие люди считают, что электролиты, такие как калий и натрий — основные компоненты спортивных напитков, которые помогают людям поддерживать водный баланс.

Однако углеводы, такие как мальтодекстрин, вносят существенный вклад в увлажняющий эффект спортивных напитков, потому что глюкоза (свободная глюкоза и глюкоза, расщепленная из мальтодекстрина) помогает воде абсорбироваться в желудочно-кишечном тракте.

Mock Meats

Во многих альтернативах нежирному мясу используется мальтодекстрин. в сочетании с другими растительными крахмалами (модифицированные пищевые крахмалы и овсяные волокна или овсяные хлопья) отруби), чтобы действовать как разбавители при приготовлении соевого белка и текстурированных овощей. белок (ТВП). Также распространены овощные камеди, такие как каррагинан. ²⁰

Использование мальтодекстрина не для веганов

Мясо с пониженным содержанием жира

Как и в случае с ложным мясом, жир в говяжьем фарше можно уменьшить с помощью использование наполнителей, таких как мальтодекстрин. Пищевая добавка часто используется с другие невеганские ингредиенты, такие как обезжиренное сухое молоко, для приготовления нежирного мяса товары. ²⁰

Продукты со вкусом сыра

Пищевые продукты, такие как сырные слоенки, Doritos и т. Д., Используют наполнители как мальтодекстрин. Такие ингредиенты помогают улучшить вкус и снизить жирность содержание обработанных закусок. ²¹

Основной состав сырной глазури состоит в основном из частично гидрогенизированные растительные масла, сухой сыр чеддер и другие невеганские ингредиенты, такие как сырный ароматизатор и сывороточный протеин.

Приправа для начо часто включает сухой сырный порошок (пармезан, Чеддер и др.) И сахар обычно в виде мальтодекстрина. ²²

Порошковое масло

Мы уже говорили о порошкообразном маргарине выше. Порошковое масло возможно, даже чаще.Его получают путем удаления жиров из натурального сливочного масла, сушить и химически обрабатывать их, а затем комбинировать с другими невеганскими такие ингредиенты, как сухая сыворотка.

Использование разбавителей, таких как мальтодекстрин, снижает калорийность и содержание холестерина. ¹⁴

Обычные заменители жира на основе углеводов включают CrystaLean, Maltrin, Lycadex, Paselli SA2, Paselli EXCEL, Paselli D-LITE и Star-Dri. Эти используется для гелеобразования, стабилизации, текстурирования и загущения. ²³

Мороженое с пониженным содержанием жира

Мороженое без молока — не единственное мороженое, из которого делают использование таких добавок, как мальтодекстрин.В мороженом мальтодекстрин действует как ароматизатор. усилитель и стабилизатор. ¹⁹

Использование мальтодекстрина помогает нежирному мороженому приятная кремовая текстура до такой степени, что вы часто не замечаете пониженное содержание жира содержание. Без мальтодекстрина и других смол (целлюлоза и т. Д.) Мороженое может на вкус действительно пот, но ему не хватало бы кремовой нежности, тающей во рту.

Фактически, текстура уступает только вкусу, когда дело доходит до воспринимаемое качество мороженого. Основной вклад в текстуру вносит общее количество твердых веществ, присутствующих в жидкой смеси для мороженого до ее замораживания.

Лучше всего молочный жир, но разбавители, такие как мальтодекстрин, близкая секунда.

Разбавители заменяют утраченные твердые частицы, удаляя некоторые молочного жира, который помогает вернуть приятное ощущение во рту и в противном случае теряется кремообразность.

Какао-напитки

Мальтодекстрин является обычным ингредиентом коммерческого горячего какао. смешивание. Многие горячие смеси какао содержат молоко с пониженным содержанием жира, поэтому мальтодекстрин очень полезен. часто используется для придания кремообразности.

Фактически, мальтодекстрин входит в стандартную комплектацию большинства горячих какао. смеси.В патенте США № 5264228 указано, что коммерческие сухие смеси какао имеют для приготовления с использованием обезжиренных сухих веществ молока и мальтодекстрина, а также подкислителя, эмульгатор и искусственный подсластитель. ²⁴

К счастью, довольно легко приготовить партию веганский горячий шоколад. Достаточно немного какао-порошка, немного сахара, и растить молоко. Но когда дело доходит до покупки отдельных пакетов горячего шоколадные смеси, они обычно, если не всегда, содержат молоко.

Вот и все, что касается веганского статуса мальтодекстрина.Спасибо чтение.

Вы также можете ознакомиться со следующими статьями по теме:

Ссылки

1. Дениз Л. Хофман, Винсент Дж. Ван Буул, Фред Дж. П. Х. Браунс (2016). «Питание, здоровье и регулятивные аспекты усвояемости Мальтодекстрины ». Crit Rev Food Sci Nutr. 56 (12): 2091–2100. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4940893/
2. Understanding Food: Principles and Preparation (стр. 420). Эми Браун — Wadsworth Cengage Learning — 2011
3. Понимание еды: принципы и приготовление (стр. 372).Эми Браун — Wadsworth Cengage Learning — 2011
4. Смеси уменьшают жирность хлебобулочных изделий. Пищевые технологии 48 (6): 168–170, 1994.
5. Шукла Т.П. Выпечка обезжиренных лепешек. Зерновые продукты World 42 (3): 142–143, 1997.
6. Storz E, and KJ Steffens. Технико-экономическое обоснование для определение эквивалента декстрозы (DE) продуктов гидролиза крахмала с помощью ближней инфракрасной спектроскопии (NIRS). Starch / Starke 56: 58–62, 2004.
7. Chronakis IS. По молекулярным характеристикам, композиционные свойства и структурно-функциональные механизмы мальтодекстрины: обзор.Критические обзоры в области пищевой науки и питания 38 (7): 599–637, 1998.
8. Понимание еды: принципы и приготовление (стр. 393). Эми Браун — Wadsworth Cengage Learning — 2011
9. Leake LL. Анализ резистентного крахмала. Пищевые технологии 60 (7): 67–69, 76, 2006.
10. Mermelstein NH. Анализ на резистентный крахмал. Food Technology 63 (4): 80–84, 2009
11. Ang Дж. Ф. и Г. А. Кросби. Сформулированные продукты с пониженной калорийностью с порошковой целлюлозой. Food Technology 59 (3): 35–38, 2005.
12. Понимание Еда: принципы и приготовление (стр. 443). Эми Браун — Уодсворт Сенагаж Обучение — 2011
13. Equal® Часто задаваемые вопросы: ингредиенты, пищевая ценность и безопасность. http://www.equal.com/faqs/
14. Понимание Еда: принципы и приготовление (стр. 459). Эми Браун — Уодсворт Сенагаж Обучение — 2011
15. Понимание Еда: принципы и приготовление (стр. 483). Эми Браун — Уодсворт Сенагаж Обучение — 2011
16. Сангронис E и M Sancio. Разработка и характеристика печенья из рисовых отрубей.Acta Cientifi ca Venezolana 41 (3): 199–202, 1990.
17. Zoulias EI, V Oreopoulou и E Kounalaki. Влияние замены жира и сахара на свойства cookie. Журнал продовольственной и сельскохозяйственной науки 82 (14): 1637–1644, 2002.
18. Bullock LM, et al. Замена простых сахаров в тесте для печенья. Пищевые технологии 46 (1): 82–86, 1992.
19. Понимание Еда: принципы и приготовление (стр. 545). Эми Браун — Уодсворт Сенагаж Обучение — 2011
20. ДеФрейтас Z, et al. Влияние каррагинана на растворимые в соли белки мяса в модельных системах.Journal of Food Science 62 (3): 539–543, 1997.
21. Понимание Еда: принципы и приготовление (стр. 153). Эми Браун — Уодсворт Сенагаж Обучение — 2011
22. Понимание Еда: принципы и приготовление (стр. 353). Эми Браун — Уодсворт Сенагаж Обучение — 2011
23. Понимание Еда: принципы и приготовление (стр. 466). Эми Браун — Уодсворт Сенагаж Обучение — 2011
24. Понимание Еда: принципы и приготовление (стр. 562). Эми Браун — Уодсворт Сенагаж Обучение — 2011

Microsoft Word — 164.docx

% PDF-1.6 % 1 0 объект >>>] / OFF [] / Order [] / RBGroups [] >> / OCGs [6 0 R 7 0 R] >> / Pages 3 0 R / StructTreeRoot 8 0 R / Тип / Каталог >> эндобдж 5 0 obj > / Шрифт >>> / Поля [] >> эндобдж 2 0 obj > поток 2017-04-10T15: 29: 34 + 02: 002017-04-10T15: 29: 34 + 02: 002017-04-10T15: 29: 34 + 02: 00PScript5.dll, версия 5.2.2application / pdf

Microsoft Word — 164 .docx

рафаэлла

uuid: 1538595d-3c97-446d-80b9-eea73953d610uuid: aea764ec-c658-4194-92c5-633301fb2607 Acrobat Distiller 11.0 (Windows) конечный поток эндобдж 3 0 obj > эндобдж 8 0 объект > эндобдж 62 0 объект > эндобдж 63 0 объект > эндобдж 282 0 объект > эндобдж 283 0 объект > эндобдж 284 0 объект > эндобдж 285 0 объект > эндобдж 286 0 объект > эндобдж 287 0 объект > эндобдж 288 0 объект > эндобдж 289 0 объект > эндобдж 290 0 объект > эндобдж 291 0 объект > эндобдж 292 0 объект > эндобдж 293 0 объект > эндобдж 294 0 объект > эндобдж 295 0 объект > эндобдж 296 0 объект > эндобдж 297 0 объект > эндобдж 298 0 объект > эндобдж 299 0 объект > эндобдж 61 0 объект > эндобдж 17 0 объект > / MediaBox [0 0 595.

No related posts.