Рейтинг эллипсоидов для дома: Актуальный рейтинг эллиптических тренажеров: лучшие модели эллипсоидов для дома по версии iChip.ru 

Электромагнитные эллиптические тренажеры для дома

Такие тренажеры оснащены электромагнитной системой торможения, которая управляется компьютерным процессором и не зависит от вращения педалей. Нагрузка меняется посредством электронного управления электромагнитного поля. В этой категории лучшие эллиптические тренажеры для дома, отзывы о которых чаще всего положительные, выделяются следующие:

Svensson Body Labs ComfortLine ESA

Один из самых демократичных эллипсоидов. Он довольно недорогой, и при этом весьма функциональный. Пользователи не жалуются на скрипы и шум. Достаточно широкий у него диапазон настроек. Тренажер позволяет обеспечить достаточную нагрузку, чтобы добиться своих целей. Преимущества этого эллипсоида можно выделить следующие:

• Доступна 21 программа, также можно задавать собственную программу;
• 16 различных уровней нагрузки;
• Настройки, которые удобны и понятны для пользователя;
• Достаточно низкая цена для функциональности тренажера.

Из слабых сторон пользователи отмечают то, что использовать его удобно лишь пользователям с ростом до 180 сантиметров.

AeroFIT E500

Если вы ищете электромагнитный эллиптический тренажер, и какой фирмы лучше вы пока не знаете, то можно обратить внимание на эту модель. Это эллипсоид профессионального уровня, который подходит и для домашних тренировок. Его можно советовать как спортсменам, так и обычным любителям, которые хотят держать себя в форме. У тренажера тяжелый маховик, достаточно надежная рама, а также широкие возможности для выбора программ и режимов. По сути, он может обеспечить полноценную альтернативу занятиям в фитнес-клубе.

Преимущества тренажера нужно выделить следующие:

• Наличие переднего привода;
• Усиленная рама;
• Возможность изменения шага;
• Ортопедический шаг до 66 сантиметров;
• 16 различных тренировочных программ;
• Максимальный вес пользователя – 150 кг.

Из недостатков нужно выделить высокую стоимость тренажера. Также он весьма тяжелый и габаритный. Ручки же могут показаться слишком короткими.

INFINITI XT7

Выбирая эллиптические тренажеры, какой лучше среди которых – вопрос сложный, обратите внимание на этот электромагнитный эллипсоид. Тренажер эргономичен. Он может подойти тем, кто не может пользоваться орбитреками со стандартными характеристиками ввиду высокого роста и большого веса. Сильные стороны тренажера следующие:

• Рассчитана пользователей весом до 150 килограмм;
• Переднеприводный;
• Имеет небольшие габариты;
• Комфортный и длинный шаг в 53 сантиметра.

Из недостатков нужно заметить то, что тренажер может скрипеть. Кроме того показатели кардиодатчика не всегда идеально точные.

Обзор эллиптических тренажеров для дома, которые считаются лучшими в своей категории, базируется на разных критериях. Перед покупкой стоит определиться с тем, какие показатели для вас наиболее важны, и каких целей вы хотите добиться с помощью тренажера. А составленные на основе отзывов пользователей рейтинги помогут сделать правильный выбор.

против эллипсоида: в чем разница?

Для любой съемки на рабочем месте, в которой вертикальные измерения играют значительную роль, возможность точно рассчитать локальную высоту имеет решающее значение.

Для карьеров и горнодобывающих предприятий, которые имеют дело с такими показателями, как глубина карьера и уклоны шельфа, это может показаться довольно очевидным. То же самое и с полигонами, где информация об объеме ячеек и оставшемся воздушном пространстве важна для планирования будущей работы.

Но даже для земляных работ на строительных площадках, где вертикальные измерения имеют меньший масштаб (остатки выемки / насыпи, высота отвала и т. Д.), наличие наиболее точных данных о высоте местности является ключом к точности, а значит, и к более разумной и рентабельной работе.

Чтобы помочь вам понять, как Propeller использует системы координат и науку о геодезии для получения высокоточных вертикальных измерений, мы хотим пролить свет на пару часто сбивающих с толку концепций: эллипсоиды и геоиды .

Для начала давайте развеем некоторые общепринятые представления о нашей планете: она не сферическая.(Не волнуйтесь; ваши друзья-теоретики заговора, которые говорят, что это плоско, тоже неправы.)

Точнее, форма Земли — эллипсоид , который иногда называют сфероидом . Хотя эллипсоиды круглые и гладкие, как сферы, они не симметричны, если разделены во всех направлениях. Поскольку окружность экватора Земли примерно на 42 мили (67 км) длиннее, чем ее меридианы, планету нельзя назвать идеальной сферой.

Ученые разработали несколько эллипсоидальных моделей Земли за эти годы.Самый известный из них служит основой для системы координат WGS84.

WGS84 — это географическая система координат, означающая, что она контекстуализирует точку на трехмерной поверхности — в данном случае на Земле — с использованием градусов широты и долготы. Если вы когда-либо использовали данные GPS, координаты были получены с использованием WGS84.

Сами по себе эллипсоидальные модели в основном используются для измерения расстояний по поверхности Земли, когда разница в милях и километрах, а не в дюймах и сантиметрах.Подумайте о нанесении на карту траектории полета или отслеживании дрейфа континентов на протяжении тысячелетий.

Еще больше усложняет ситуацию то, что земная поверхность на самом деле не является гладкой, как эти идеализированные эллипсоидальные модели. Поскольку плотность планеты непостоянна, гравитационные силы притягивают или выталкивают поверхность Земли в разных местах, в результате чего планета больше похожа на комковатую картошку, чем на яйцо.

Модели, которые напоминают комковатую картошку, которую мы называем домом, называются геоидами .Поверхность геоида представляет собой средний уровень моря (MSL) или предположение о поверхности океана, если приливов, ветров и других факторов, влияющих на его движение, не существовало. Единственный фактор, который влияет на форму МСЛ, — это гравитационное поле Земли.

В отличие от эллипсоидальных моделей, модели геоидов основаны на локальном или, по крайней мере, более локальном уровне, чем вся поверхность Земли. Например, геодезисты в США в настоящее время используют Североамериканскую вертикальную систему отсчета 1988 года (NAVD88).

То есть будут в ближайшие пару лет. Национальное геодезическое общество намерено заменить NAVD88 в 2022 году на более новую модель, полученную с использованием GPS, а не физических геодезических меток, используемых в текущей модели.

Модели эллипсоида и геоида (которых много) являются примерами вертикальных датумов. Для геодезистов вертикальные точки отсчета служат опорными точками, по которым можно определить высоту (положительные высоты и отрицательные впадины).

На самом деле существует два типа вертикальных датумов: приливных и геодезических. Для наших целей давайте проигнорируем данные приливов и отливов, которые относятся к границе раздела между океаном и сушей и поэтому менее применимы для большинства геодезистов.

При съемке материи в доли дюйма, поэтому очень важно, чтобы геодезисты использовали одни и те же геодезические системы координат на протяжении всего жизненного цикла проекта. Переключение моделей эллипсоида или геоида в середине потока приводит к расхождению данных.

Если у вас есть наборы данных, которые используют разные системы координат и системы отсчета (например, топографическая съемка и файл проекта), вам необходимо преобразовать один, чтобы он соответствовал другому. В противном случае измерения не совпадут.

Propeller разработала простой в использовании преобразователь координат, чтобы помочь в этом. Это также полезный инструмент для создания локальных сеток или произвольно определенных систем координат, специфичных для одного объекта.

Когда дело доходит до преобразования данных о высоте, следует иметь в виду три типа высоты :

1. Высота эллипсоида (h) — это разница между эллипсоидом и точкой на поверхности Земли.Ее также называют геодезической высотой (не путать с геодезическими базами). Если у вас есть координаты, полученные с помощью GPS-приемника, данные о высоте ссылаются на эллипсоид, а это означает, что вместо этого они должны быть преобразованы, чтобы соответствовать более точному геоиду.
2. Высота геоида (N) — значение смещения между опорным геоидом и моделями эллипсоида.
3. Ортометрическая высота (H) — АКА, которая вас действительно волнует — это расстояние между точкой на поверхности Земли и геоидом.Как мы уже обсуждали, геоид представляет средний уровень моря. Когда вы слышите данные о высоте, обозначенные как «X футов над (или ниже) уровнем моря», это означает ортометрическую высоту.

Чтобы обеспечить постоянство ортометрических высот на вашем участке, мы используем выбранные вами точки отсчета и эту простую формулу: H = h — N. Просто, не так ли?

В Propeller мы гордимся своей способностью предоставлять наиболее точные данные съемки с дронов.

Поговорите с членом нашей команды сегодня о размещении Propeller на ваших сайтах.

Эллипсоид | геометрия | Britannica

Эллипсоид , замкнутая поверхность которого все плоские поперечные сечения представляют собой эллипсы или окружности. Эллипсоид симметричен относительно трех взаимно перпендикулярных осей, которые пересекаются в центре.

Если a , b и c являются главными полуосями, общее уравнение такого эллипсоида будет x ² / a ² + y ² //90 b ² + z ² / c ² = 1.Особый случай возникает, когда a = b = c : тогда поверхность представляет собой сферу, а пересечение с любой проходящей через нее плоскостью представляет собой круг. Если две оси равны, скажем, a = b , и отличаются от третьей, c , то эллипсоид является эллипсоидом вращения или сфероидом ( см. Рисунок ), фигура образована вращением эллипс вокруг одной из его осей. Если a и b больше c , сфероид сплюснутый; если меньше, поверхность представляет собой вытянутый сфероид.

Подробнее по этой теме

геоид

… требуется справочная цифра, эллипсоид вращения используется для представления формы и размера Земли. Это поверхность, созданная …

Сплюснутый сфероид образован вращением эллипса вокруг своей малой оси; вытянутый вокруг своей большой оси. В любом случае пересечения поверхности плоскостями, параллельными оси вращения, являются эллипсами, а пересечения плоскостями, перпендикулярными этой оси, — окружностями.

Исаак Ньютон предсказал, что из-за вращения Земли ее форма должна быть эллипсоидной, а не сферической, и тщательные измерения подтвердили его предсказание. По мере того, как стали возможны более точные измерения, были обнаружены дальнейшие отклонения от эллиптической формы. См. Также Измерение Земли, модернизированный.

Получите подписку Britannica Premium и получите доступ к эксклюзивному контенту. Подпишитесь сейчас

Часто эллипсоид вращения (называемый опорным эллипсоидом) используется для представления Земли в геодезических вычислениях, потому что такие вычисления проще, чем вычисления с более сложными математическими моделями.Для этого эллипсоида разница между экваториальным радиусом и полярным радиусом (большая и малая полуоси соответственно) составляет около 21 км (13 миль), а сплющивание составляет примерно 1 часть на 300.

Калькулятор купола эллипсоида | Институт монолитных куполов

Использование калькулятора эллипсоидных куполов

Полуэллипсоидные купола обычно используются для строительства домов размером с дом. Сплюснутый эллипсоид — купол, немного похожий на сидящего на нем, — имеет круглое основание и эллиптическое поперечное сечение.Форма снижает общую высоту, обеспечивая больше «высоты над головой» относительно «стены» купола. Это может уменьшить площадь поверхности — снизить цену и обеспечить более эффективную площадь пола — по сравнению с аналогичными сферическими куполами.

Менее распространены, чем сплющенные эллипсоиды, вытянутые эллипсоиды представляют собой высокие формы, часто используемые для специализированных помещений в многокупольных постройках. Если сплющенный эллипсоид имеет высоту меньше радиуса основания, высота вытянутого эллипсоида больше, чем радиус основания.Оба варианта поддерживаются этим калькулятором. Также поддерживаются расчеты полушария, но вместо этого мы рекомендуем использовать Калькулятор сферического купола.

Все параметры хранятся в URL-адресе страницы, которую можно добавить в закладки, сохранить и поделиться ею. Используйте «Копировать в буфер обмена», чтобы скопировать и вставить результаты в свои заметки или электронные письма. Распечатайте страницу или сохраните в формате PDF, чтобы получить профессиональную копию чертежа и результатов.

Имейте в виду, что тот факт, что калькулятор может нарисовать структуру, НЕ означает, что она может быть построена.Этот калькулятор — всего лишь инструмент. Перед тем, как приступить к проекту, всегда консультируйтесь с квалифицированными специалистами.

Этот калькулятор регулируется нашими Условиями обслуживания.

Входы

Диаметр. Максимальный круговой размер основания купола и дополнительной стенки ствола. Радиус основания — половина диаметра — это экваториальный радиус (а) эллипсоида. Максимальный рекомендуемый диаметр составляет 100 футов (30 м).

Высота. Высота эллипсоидной части конструкции. Это вертикальный радиус (b) эллипсоида.

Стенка ствола. Высота дополнительного цилиндра стенки штока. Установите нулевую высоту стены (0), чтобы удалить расчеты стенок ствола.

Уровень. Необязательный горизонтальный уровень над полом, образующий часть конструкции. Он вычисляет воображаемый круг на этом уровне плюс верхняя часть конструкции от этого уровня до вершины. Уровень пригодится для расчета второго этажа.

Накладка. Масштабируемый графический оверлей, помогающий визуально представить размер и назначение здания.

шт. Выбираемая единица помечает выходы калькулятора и правильно масштабирует оверлей. Обратите внимание, что все числовые входы должны быть даны в одной выбранной единице.

Этаж

Диаметр. Диаметр пола — это круг, представляющий диаметр пола, стенки ствола и основания купола.

Радиус. Радиус этажа равен половине диаметра этажа и может использоваться для различных расчетов.

Окружность. Окружность пола — это расстояние вокруг пола в форме круга, стены ствола и основания купола.

Площадь. Площадь пола — это площадь круга, вписанного в диаметр пола.

Купол

Высота. Высота купола — это расстояние от основания купола до вершины.

Коэффициент эллиптичности. Отношение между экваториальным радиусом и вертикальным радиусом, описывающее эллипс поперечного сечения. Отношение больше единицы — это сплюснутый эллипсоид, а меньше единицы — вытянутый эллипсоид. Максимально рекомендуемое соотношение сжатого эллипсоида составляет 1,45 — мембрана Airform начинает сморщиваться при соотношении выше 1,45.

Расстояние до поверхности. Расстояние до поверхности купола — это длина от вершины по кривой купола до основания купола.

Площадь поверхности. Площадь поверхности купола технически представляет собой площадь боковой поверхности купола от основания до вершины.

Объем. Объем купола — это кубическая мера объема, заключенного в куполообразной части конструкции.

Стенка ствола

Высота. Высота стенки ствола описывает высоту цилиндра с диаметром дна и высотой стенки ствола. Он соединяет пол с основанием купола. Оставьте высоту стенки штока равной нулю (0), чтобы снять стенку штока.

Площадь поверхности. Площадь поверхности стенки штока — это площадь цилиндра, образованного стенкой штока.

Объем. Объем стенки штока — это кубическая мера объема, заключенного в цилиндр стенки штока.

Всего

Высота. Общая высота — это общая высота конструкции, определяемая суммой высот стенки ствола и купола.

Расстояние до поверхности. Общее поверхностное расстояние — это расстояние от поверхности купола от вершины до основания плюс высота стены ствола, равная расстоянию по поверхности здания от вершины до пола.

Площадь поверхности. Общая площадь поверхности складывается из площади поверхности купола и площади поверхности цилиндра стенки штока.

Объем. Общий объем — это кубическая мера общего объема, заключенного во всей конструкции.

Уровень @

Высота над полом. Высота уровня — это расстояние от пола до горизонтального «среза» на уровне, указанном над полом. Он эффективно создает часть всего здания.

Диаметр. Диаметр уровня — это расчетный диаметр на указанном уровне над полом.

Радиус. Радиус уровня — это рассчитанный радиус — половина диаметра уровня — на указанном уровне над полом.

Окружность. Окружность уровня — это периметр вокруг воображаемого среза на уровне, заданном над полом.

Площадь. Площадь уровня — это площадь круга, описываемого воображаемым срезом на уровне, заданном над полом.Обычно уровень устанавливается на 10 футов (3 м) для расчета диаметра и площади второго этажа.

Порция выше уровня

Оставшаяся высота. Воображаемый срез структуры на заданном уровне по существу создает вторую часть общей структуры. Оставшаяся высота рассчитывается как высота от указанного уровня до вершины купола.

Расстояние до поверхности. Расстояние до ровной поверхности — это общее расстояние от вершины купола до воображаемого среза на заданном уровне.Он будет правильно следовать за куполом и даже вниз по стенке ствола.

Площадь поверхности. Площадь ровной поверхности — это общая площадь поверхности остальной конструкции над воображаемым срезом на заданном уровне. Это удивительно полезная мера при расчете потребности в материалах для купола.

Объем. Объем уровня — это общий кубический объем, заключенный в оставшейся конструкции выше указанного уровня.

Накладки

Наложение — это масштабированная иллюстрация, помогающая передать размер, назначение и объем рассчитанной структуры.Они предназначены только для удобства. Не предпринимается никаких попыток «разместить» их внутри здания или определить их подходящее использование для конструкции. Они просто наглядное пособие.

Нет. Параметр нет удаляет наложение.

Лиц. Наложение человек — это оверлей по умолчанию. Это человек ростом 6 футов (1,8 м).

Автомобиль. Автомобиль Накладка — седан среднего размера с 6-футовым (1.8 м) стоящий рядом человек.

BBall. Накладка bball — это боковой силуэт стандартной американской баскетбольной площадки на шестидюймовом полу. Мы рекомендуем установить для параметра level значение 20,5 футов, чтобы показать стандартную высоту, необходимую для пола для соревнований.

Погрузчик. Погрузчик Накладка представляет собой небольшой фронтальный погрузчик — рабочая грузоподъемность 6000 фунтов (2800 кг) с ковшом — приблизительно 8 футов (2.5 м) рядом с человеком ростом 6 футов (1,8 м).

Тяжелый. Тяжелая накладка представляет собой большой фронтальный погрузчик — рабочий вес 66 000 фунтов (30 000 кг) — высота около 12,5 футов (3,8 м) рядом с человеком ростом 6 футов (1,8 м).

Калькулятор объема эллипсоида

Вы ищете калькулятор объема эллипсоида? Вы только что нашли идеальное место! Мы собираемся вычислить объем эллипсоида и дать вам пошаговое решение, чтобы вы могли изучить , как сделать это самостоятельно .

Прочтите статью ниже и откройте для себя формулу объема эллипсоида , свойства формы эллипсоида и другую полезную информацию.

Эллипсоид — полезная форма

Эллипсоид — это поверхность, которая может быть получена путем «сжатия» типичного шара. Он похож на мяч для американского футбола со сглаженными углами. 🏈 Что интересно, все поперечные сечения эллипсоида имеют форму эллипса .

Мы определяем эллипсоиды с помощью полуосей — отрезков линий, которые начинаются в самом центре эллипсоида и заканчиваются в точке , касательной к поверхности (вы можете думать об этом так же, как и вы о радиусе окружности ).Можно выделить три типа полуосей:

На основе поперечного сечения эллипсоида (эллипса):

• Большая полуось — самая большая; и
• Малая полуось — ось , расположенная под прямым углом к большой полуоси.

3D модификация:

• Третья ось расположена под прямым углом к ​​двум движущимся осям .

Все три полуоси встречаются в центре эллипсоида

Зачем нужен объем эллипсоида? 🤔 Эта форма довольно часто встречается в nature .Обычно используется в медицине , чтобы оценить объем различных органов, например:

Сам эллипс также используется при вычислении движения планет.

Как пользоваться калькулятором эллипсоидов?

Наш калькулятор объема эллипсоида прост в использовании и состоит из двух основных шагов:

1. Найдите длины всех трех осей вашего эллипсоида.

   Все они должны находиться под углом 90 ° ( прямых углов ) друг к другу.

2. Введите полученные значения и приятного вам результата! 🎉

Мы покажем формулу объема эллипсоида, а также наше решение — во всех возможных единицах, которые может пожелать ваша душа!

Вы все готовы к работе? Вы также можете попробовать наш универсальный калькулятор объема или калькулятор объема сферы. 🌎

Как рассчитать объем эллипсоида?

Объем эллиптической сферы можно вычислить с помощью простого и элегантного уравнения эллипсоида:

Объем = 4/3 * π * A * B * C ,

где:

• A , B и C — длины всех трех полуосей эллипсоида.

Формула эллипсоида

В этом разделе показано, как обозначить эллипсоид двумя разными способами.

Нам нужно использовать декартову систему координат в трех измерениях (x, y, z). Затем нам нужно установить начало системы координат (0, 0, 0) как центр эллипсоида .

1. Использовать значения полуосей

   Найдите эти три точки в системе координат:

   • (А, 0, 0)
   • (0, В, 0)
   • (0, 0, С)

   Это точки поверхности, которые составляют границу вашего эллипсоида.

2. Используйте формулу эллипсоида

   1 = (x 2 / A 2 ) + (y 2 / B 2 ) + (z 2 / C 2 )

   Это уравнение также полезно, если вам нужно найти значение любой из полуосей.

Эллипсоид — обзор | ScienceDirect Topics

2.2 Численный анализ локального электрического поля и сечения рассеяния для металлических наноструктур

Уравнения Максвелла решаются для сфер или эллипсоидов с подложкой или без нее [2, 32-34].Однако аналитические решения не были получены для других сложных структур, таких как треугольные, тетраэдрические частицы с / без несимметричных выступов или ямок, поскольку выделение переменных в дифференциальных уравнениях существенно затруднено. Поэтому ценным является численное моделирование, такое как метод FDTD, который переводит дифференциальные уравнения в разностные уравнения. Стационарные решения могут быть получены в заданных положениях для исходного электромагнитного поля с различными длинами волн и направлениями распространения.В методе FDTD наноструктура окружена виртуальными границами подходящего размера, а внутри область разделена на небольшие прямоугольные ячейки определенного размера (ячейки Δx × Δy, см. Рис. 2, здесь дано двумерное выражение для упрощения объяснения). А именно, металлические частицы и окружение изображаются как совокупность этих маленьких ячеек с определенным размером и диэлектрическими свойствами [35]. В этой системе ротор в уравнениях Максвелла задается следующими уравнениями для TM (поперечного магнитного) поля [36].

Рис. 2. Схематическое изображение выборочной системы и координаты, использованные в расчете FDTD.

Ezn (i, j) = CEZ (i, j) Ezn − 1 (i, j) + CEZLX (i, j) {Hyn − 1/2 (i + 1/2, j) −Hyn − 1 / 2 (i − 1/2, j)} — CEZLY (i, j) {Hxn − 1/2 (i, j + 1/2) −Hyn − 1/2 (i, j − 1/2)}

здесь

CEZ (i, j) = 1 − σ (i, j) Δt2ɛ (i, j) 1 + σ (i, j) Δt2ɛ (i, j), CEZLX (i, j) = Δt / ɛ (i , j) 1 + σ (i, j) Δt2ɛ (i, j) 1ΔxCEZLY (i, j) = Δt / ɛ (i, j) 1 + σ (i, j) Δt2ɛ (i, j) 1Δy

Hxn +1/2 (i, j + 1/2) = Hxn − 1/2 (i, j + 1/2) −CHXLY (i, j + 1/2) {Ezn (i, j + 1) −Ezn (i, j)} Hyn + 1/2 (i + 1/2, j) = Hyn − 1/2 (i + 1/2, j) −CHYLY (i + 1/2, j) {Ezn (i + 1, j) −Ezn (i, j)} CHXLY (i, j + 1/2) = Δtμ (i, j + 1/2) 1Δy, CHYLX (i + 1/2, j) = Δtμ (i + 1/2, j) 1Δx

Здесь σ (i, j), ɛ (i, j) и μ — проводимость, диэлектрическая проницаемость и магнитная проницаемость соответственно.Согласно этим уравнениям, локальное электромагнитное поле E ^n-1 и H ^n-1/12 при ортогональных координатах x = x (i), y = y (j) и в момент времени t = t ^n-1 , t ^n-1/2 , а затем H ^n-1/2 и E ⁿ в качестве последовательной и временной реакции на падающее электромагнитное поле. Схема Mur первого порядка или PML (идеально согласованный слой) использовалась в качестве поглощающего граничного условия в сочетании с методом рекурсивной свертки для металлов с заметной диэлектрической дисперсией в исследуемой здесь области длин волн [36].

В моделировании FTDTD-2D в разделе 3.2 предполагалось, что металлические наноструктуры представляют собой нанопроволоку с бесконечной высотой (длиной), перпендикулярной поперечному сечению различной формы, например круг, треугольник или эллипсоид. Локальное электрическое поле оценивалось по максимальной напряженности поля на металлических поверхностях с использованием достаточно малого размера ячейки, например 0,25 нм × 0,25 нм или 0,1 нм × 0,1 нм, где изменение поля происходит быстро на стыках или поверхностях частиц, в отличие от менее плотного размера ячеек для внешних частиц с размером 1 нм × 1 нм, как правило.Такие неоднородные сетки весьма полезны и эффективны для получения точных значений за довольно короткое время, особенно в трехмерных оценках. Фактический расчет проводился для металлических наночастиц различного размера, формы и упорядоченной структуры. Мы отметили, что точная зависимость резонанса LSP от длины волны не может быть воспроизведена в 2D-расчетах, так как высота наноструктур не учитывается. Однако было также подтверждено, что точная локальная интенсивность поля получается для параллельной поляризации плоскости X-Y с подробными размерами ячеек за гораздо более короткое время обработки по сравнению с 3D-моделированием.

Сечение рассеяния, отклик в дальней зоне, в разделе 3.4 от наночастиц Ag с адсорбатами R6G или без них было оценено на различных длинах волн с помощью трехмерного метода FDTD (FDTD-3D) с использованием диэлектрических постоянных составляющих [37, 38]. Диэлектрические постоянные красителя были выражены в модели затухающего гармонического осциллятора, ɛ = 1 + S / (ω ₀ ² — ω ² — iωΓ), здесь сила колебаний (S) 5 × 10 ³¹ с ⁻² , затухание (Γ) 2.5 × 10 ¹⁴ с ⁻¹ и резонансная длина волны (ω ₀ ) 3,2 × 10 ¹⁵ с ⁻¹ (λ ₀ = 589 нм) на основе экспериментальных наблюдений для родамина [ 39]. Чтобы обсудить эффективность связи между LSP и поглощением красителя, резонансная длина волны красителя была настроена между 400 нм и 700 нм. Мы приняли различные модельные структуры, такие как изолированные сферы, сфероид или смежные сферические частицы Ag с молекулами красителя или без них.Ячейки Yee построены из сеток 160 × 120 × 120 (2,3 × 10 ⁶ сеток) с 2 прогонами на сетку в направлениях x, y и z с использованием условий поглощения PML (идеально согласованный слой) [38], поскольку большее количество сеток сетки или ячейки меньшего размера не дают существенных различий в сечении рассеяния. Падающий свет в виде плоской волны с линейной поляризацией облучает ячейку на различных длинах волн. Обычно для создания конвергентного решения с использованием ЦП (Pentium 4, 3.0 ГГц) и Windows XP, что примерно в десять раз больше, чем при двухмерном расчете. Более мелкие сетки на стыке не дают существенных различий в рассеянии в дальней зоне, в то время как обеспечивают гораздо более точное распределение ближнего поля по сравнению с сетками с плохим разрешением. Таким образом, в настоящей оценке принят размер ячеек 2 нм.

Произошла ошибка при настройке вашего пользовательского файла cookie

Произошла ошибка при настройке вашего пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, используйте кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в cookie-файлах может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Модель сегментации эллипсоида

для анализа пакетов трехмерных конфокальных изображений с ослабленным светом флуоресцентных многоклеточных сфероидов

Abstract

В онкологии двумерные модели культивирования in vitro являются стандартными испытательными площадками для открытия и разработки методов лечения рака, но в последние десятилетия появились доказательства того, что такие модели имеют низкую прогностическую ценность с точки зрения клинической эффективности. Поэтому они все чаще дополняются более физиологически релевантными 3D-моделями, такими как культуры сфероидных микроопухолей.Если применяются подходящие флуоресцентные метки, наборы конфокальных трехмерных изображений могут характеризовать структуру таких объемных культур и, например, пролиферацию клеток. Однако ряд проблем мешают точному анализу. В частности, ослабление сигнала в ткани сфероидов препятствует получению полного изображения для сфероидов диаметром более 100 микрометров. А количественный анализ больших наборов данных 3D-изображений является сложной задачей, вызывая потребность в методах, которые можно было бы применять в крупномасштабных экспериментах и ​​учитывать препятствующие факторы.Мы представляем надежный, недорогой в вычислительном отношении метод 2.5D для сегментации сфероидных культур и для подсчета пролиферирующих клеток в них. Предполагается, что сфероиды имеют форму приблизительно эллипсоида. Они идентифицируются на основе информации, представленной в проекции максимальной интенсивности (MIP) и соответствующей проекции высоты, также известной как Z-буфер. Он предупреждает пользователя, когда потенциальные факторы, вносящие смещение, не могут быть компенсированы, и включает компенсацию затухания сигнала.

Образец цитирования: Barbier M, Jaensch S, Cornelissen F, Vidic S, Gjerde K, de Hoogt R, et al. (2016) Модель эллипсоидной сегментации для анализа ослабленных светом трехмерных конфокальных стеков изображений флуоресцентных многоклеточных сфероидов. PLoS ONE 11 (6): e0156942. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156942

Редактор: Томас Абрахам, Медицинский колледж Херши штата Пенсильвания, СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ

Поступила: 4 сентября 2015 г .; Принята к печати: 23 мая 2016 г .; Опубликован: 15 июня 2016 г.

Авторские права: © 2016 Barbier et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Файл S1 доступен в качестве вспомогательной информации. Описанные файлы Data_3, Data_4, Data_5 и Data_6 доступны в репозитории данных Dryad (doi: 10.5061 / dryad.0m9n7).

Финансирование: авторов MB, SJ, FC, RH, RG, EG и YTC были профинансированы фармацевтическими компаниями Janssen из Johnson & Johnson.Авторы SV и KG были поддержаны совместным предприятием Innovative Medicines Initiative в рамках Соглашения о гранте № 115188, ресурсы которого состоят из финансового вклада Седьмой рамочной программы Европейского Союза (FP7 / 2007–2013) и взносов натурой от Европейской Федерации. фармацевтических производств и ассоциаций. Спонсоры предоставили авторам поддержку в виде заработной платы, но не сыграли никакой дополнительной роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.Конкретные роли этих авторов сформулированы в разделе «Авторский вклад».

Конкурирующие интересы: У авторов этой рукописи есть следующие конкурирующие интересы: MB, SJ, FC, RH, RG, EG и YTC были сотрудниками Janssen Pharmaceutical Companies of Johnson & Johnson. Авторы подтверждают, что это не влияет на их приверженность всем политикам PLOS ONE в отношении обмена данными и материалами.

Введение

Успешность открытия и разработки лекарств в онкологии составляет всего 6% [1].Традиционные модели, используемые для тестирования онкологических препаратов, представляют собой однослойные культуры опухолевых клеток, выращенные на стеклянных и пластиковых подложках. Эти модели сильно отличаются от поведения солидной опухоли in vivo. Для сравнения, считается, что 3D-культуры более точно имитируют микроокружение опухоли [2], поскольку они допускают более сложные взаимодействия между раком и стромальными клетками и подвергают клетки воздействию более реалистичных механических сил. Исследования продемонстрировали важные различия в профилях транскрипции [3] и чувствительности к лекарствам [4-8] между 2D и 3D системами клеточных культур.Недавний обзор см. В [9]. Консорциум PREDECT нацелен на валидацию различных трехмерных моделей клеточных культур путем сравнения их гистологии и экспрессии белка с результатами, обнаруженными в образцах пациентов [10].

Важной категорией таких моделей являются сфероидные микроопухоли, выращенные в матриксе, таком как Matrigel ^® , с присутствием поддерживающих стромальных клеток или без них. Обычно раковые клетки высевают во внеклеточный матрикс в каждую лунку микротитровального планшета, и со временем развиваются множественные сфероиды разных размеров.Эти трехмерные многоклеточные сфероидные модели более точно отражают градиенты питательных веществ, кислорода и лекарств, которые могут быть обнаружены в опухоли, воспроизводя гипоксические, пролиферативные, апоптотические и некротические области [11, 12]. Подходящие красители или антитела могут быть применены для обнаружения этих областей / процессов, но точная количественная оценка пространственного распределения в трехмерном сфероиде по отношению к размеру сфероида является сложной задачей.

Значительные качественные различия могут быть обнаружены визуальной оценкой микрофотографий.Но точная и воспроизводимая количественная оценка статистически значимых различий требует автоматизированного анализа изображений, особенно в крупномасштабных исследованиях. Чтобы извлечь всю пространственную информацию из трехмерного образца, необходимо применить анализ трехмерного изображения, но это дорогостоящий процесс с вычислительной точки зрения. Более того, разрешение изображения в осевом направлении намного хуже, поэтому получение информации ограничено, если рассматривать ось z как эквивалентную другим. Чтобы обойти это, многие методы применяют гибридную форму, известную как 2.5D анализ [13, 14]. Обычно двухмерная проекция, которая сама по себе жертвует всей информацией о глубине, сочетается с методом извлечения и хранения ограниченного количества информации о глубине. Чтобы получить значимую информацию из анализа изображения 2.5D, эти методы должны включать допущения, позволяющие экстраполяцию обратно в трех измерениях. Ортогональная проверка с использованием независимо генерируемой «основной истины» важна для гарантии того, что анализ в достаточной степени представляет исходный набор данных.

Для точного выделения количественных характеристик в качестве отправной точки требуются изображения адекватного качества. Получение таких наборов данных трехмерного изображения осложняется рядом проблем, которые менее важны или отсутствуют в настройке 2D. К ним относятся сферические и хроматические аберрации (которые для ограниченной толщины образца обычно корректируются в конструкции объектива), плохое осевое разрешение, фотообесцвечивание и фототоксичность во время длительного сбора данных, а также поглощение и рассеяние света, приводящие к ослаблению сигнала в глубине образца.В этой статье мы сосредоточимся на том, как устранить экспериментальные ошибки, связанные с ослаблением света.

Во многих приложениях можно уменьшить влияние ослабления света. Перед визуализацией образцы тканей можно очистить химическим способом, используя такие монтажные среды, как SeeDB [15], Clarity [16], ClearT [17] или Scale [18]. Поскольку эффекты рассеяния света уменьшаются на более длинных волнах, качество изображения значительно улучшается за счет многофотонной микроскопии, в которой используется возбуждающий инфракрасный свет, проникающий глубже в ткань [19].Флуоресцентная микроскопия со световым слоем снижает влияние ослабления света за счет освещения и измерения образца под разными углами [20, 21]. Однако большинство этих технологий несовместимо со средней и высокой производительностью экспериментов на сотнях или тысячах образцов. В настоящее время их необходимо выполнять с использованием стандартных формирователей изображений с высоким содержанием контента и микротитровальных планшетов. Это ограничивает возможности конфокальной микроскопии с вращающимся диском, использование дальних красных красителей и применение программных методов для коррекции ослабления света после сбора данных [22, 23].

Доступны разнообразные инструменты для анализа флуоресцентных изображений трехмерных сфероидных культур, такие как количественная оценка используемых здесь маркеров пролиферации. Инструменты анализа изображений общего назначения включают как коммерчески доступные пакеты, такие как Imaris (Bitplane AG, Швейцария, http://bitplane.com) и Volocity (PerkinElmer, Inc., США), так и свободно доступные программные инструменты с открытым исходным кодом, такие как FIJI. (ImageJ) [24] и ICY [25]. Более того, в контексте обнаружения многоклеточных сфероидов и флуоресцентных пятен существует множество инструментов, совместимых с высокопроизводительным анализом и предназначенных для конкретных задач: Amida (морфология сфероидов) [26], AnaSP (объем сфероидов) [13], MINS (ядерный сегментация) [27], CellSegm (общая сегментация) [28], интеллектуальная 3D-FISH (обнаружение пятен) [29] и goIFISH (обнаружение пятен) [30].Однако на сегодняшний день не существует инструмента анализа, который рассматривал бы затухание сфероидного сигнала и мог бы использоваться с высокой пропускной способностью. В этой статье представлен метод анализа изображений 2.5D для культур трехмерных сфероидов, подходящий для данных Z-стека, полученных с помощью конфокальных формирователей изображений с высоким содержанием. Наш метод сегментирует весь трехмерный сфероид и обнаруживает внутри него отдельные помеченные клетки. Эти клетки окрашиваются определенным маркером, например маркером пролиферации клеток, таким как EdU. Его удобно применять в экспериментах со средней производительностью для оценки роста раковых клеток в различных условиях культивирования и лечения.Производительность предлагаемого подхода сравнивается с простым методом 2D MIP-анализа и полным 3D-анализом, выполненным с помощью Bitplane Imaris.

Результаты и обсуждение

Предлагаемый метод анализа состоит из двух основных частей: сегментация раковых сфероидов и идентификация положительных клеток на основе флуоресцентного мечения, присутствующего во всех раковых клетках и специфическом маркере, соответственно. Оба они подробно описаны в следующих разделах. В нашем примере набора данных раковые клетки помечены RFP, а специфическим маркером является EdU, маркер пролиферирующих клеток, как подробно описано в разделе «Материалы и методы».Параметры и выходные характеристики метода приведены в таблицах 1 и 2.

Сегментация многоклеточных сфероидов

Первый шаг — это двухмерная сегментация сфероидов на проекциях максимальной интенсивности (MIP). Затем к сегментированным двумерным сфероидальным маскам добавляются эллипсы. Наконец, эти эллипсы экстраполируются на трехмерные эллипсоиды. Процедура предполагает, что стопки трехмерных изображений корректируются на неравномерное фоновое освещение, чтобы устранить любое систематическое смещение в представлении высоты фоновых пикселей, а расстояние между двумя последующими срезами (часто называемое z-шагом) должно быть меньше, чем средний диаметр ячейки.

2D сегментация.

На рис. 1 показаны концепции MIP и соответствующего вида в высоту. В каждой координате (x, y) мы получаем максимальное значение интенсивности и координату z соответствующего воксела. Для базовой сегментации сфероидов, которая проиллюстрирована на рис. 2, мы сначала выбираем локально однородные области с высоты (показано на 2 (b)) [31]. Такие области соответствуют пикселям объекта (сфероида), в то время как фоновые пиксели имеют тенденцию быть более случайными по координате z.Путем применения фильтра диапазона, который вычисляет для каждого пикселя максимальную разность интенсивности соседних пикселей в пределах радиуса r _{диапазона} , получается мера локальной неоднородности, как показано на Фиг.2 (C). На рис. 2 (E) показана гистограмма разницы высот на рис. 2 (C), что указывает на то, что большое количество пикселей при более низких значениях принадлежит сфероидальным областям. Применение порогового значения max _z-range к изображению на фиг. 2 (C), значение, определяемое протяженностью первого пика на гистограмме, приводит к отделению объектов от фона.Наконец, результирующие объекты переднего плана идентифицируются с помощью маркировки связанных компонентов. Другой порог min _MIP , определяемый средним значением фоновой интенсивности MIP, применяется к средней интенсивности каждого объекта в MIP, чтобы гарантировать, что обнаруженные объекты имеют ожидаемую минимальную интенсивность флуоресценции, характерную для сфероидов. Применение такого порога предотвращает обнаружение ложных объектов.

Рис. 1. MIP и соответствующий вид по высоте.

Проекция с максимальной интенсивностью (MIP) и высота изображения показаны (ab), а для одной плоскости xz из изображения (c) указывается (красными / белыми квадратами), откуда произошли пиксели, то есть, какие координаты z дали наибольшую интенсивность.Соответствующие z-значения отображаются в виде высоты, а интенсивности пикселей отображаются в MIP. Когда два сфероида перекрываются в боковом направлении, MIP покажет сфероид с наибольшей интенсивностью.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156942.g001

Рис. 2. Сегментация сфероидов в 2D.

(a): часть проекционного изображения максимальной интенсивности канала RFP стека трехмерных изображений, (b): соответствующий вид высоты, (c): после применения фильтра диапазона к виду высоты, дающего локальную дисперсию в z-глубина, где яркие (темные) пиксели указывают фоновые (сфероидные) области, (d): гистограмма (a), показывающая, что передний план не может четко различаться, (e): гистограмма (c), показывающая разделение между передний план и задний план возможны.(f) после сегментации.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156942.g002

Подгонка эллипсов к двумерным сфероидальным маскам.

Подгонка эллипсов к сфероидам, сегментированным в 2D, выполняется путем минимизации среднеквадратичной ошибки разницы с сегментированной 2D-маской. На этом этапе мы предполагаем, что эллиптические сфероиды проверяются путем измерения округлости 2D-масок сегментации сфероидов. Сфероидные маски с низкой двумерной округлостью не имеют формы двумерного эллипса и не приведут к удовлетворительной подгонке трехмерного эллипсоида.Помимо фактической неправильности сфероидной формы, может быть несколько причин, которые могут способствовать созданию неправильных 2D-масок. К ним относятся сфероиды, которые не полностью видны в MIP, потому что они скрыты другими более яркими сфероидами, и сфероиды, которые были неправильно сегментированы на этапе 2D сегментации, например, путем слияния двух сфероидов. Поскольку эти сфероиды могут привести к неправильной маске трехмерной сегментации, они отфильтровываются на основе их двумерной округлости.

Приближение трехмерного эллипсоида.

Затем трехмерный эллипсоид соответствует каждому из двумерных эллипсов. Применяя эту процедуру, мы предполагаем, что сфероид имеет эллипсоидальную форму, которая либо близка к сферической, либо удовлетворяет менее строгому условию, что две оси эллипсоида ориентированы в плоскости xy. Первый случай применим к сфероидам, культивируемым в однородной матрице, а второй случай может иметь место для сфероидных культур, засеянных в слое, зажатом между двумя матрицами.Поскольку мы предполагаем, что 3-я ось эллипсоида расположена вдоль оси z, необходимо оценить положение центра эллипсоида и длину 3-й оси. (X, y) -координаты центра эллипсоида в 3D предполагаются как (x, y) -координаты центра 2D-эллипса, z-координаты центра и эллипсоида 3 ^rd Длина оси определяется профилем интенсивности по вертикальной оси. На рис. 3 показаны полученные подобранные эллипсоиды для стека изображений трехмерной культуры сфероидов.Теперь также можно оценить объем сфероида.

Рис. 3. Подгонка трехмерных эллипсоидов.

(a) Сегментированные сфероиды в 2D, наложенные на MIP. (b-c) Эллипсоиды, подогнанные к маске сфероида на (a). Проекции центральных срезов сфероидов с (b) верха (плоскость xy) и (c) стороны (плоскость xz) показаны наложенными на подогнанные эллипсоиды.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156942.g003

Определение анализируемой области эллипсоида.

Имеется убывающий градиент интенсивности от поверхности к центру сфероида. Следовательно, клетки могут быть идентифицированы неправильно. Эта проблема проиллюстрирована на рис. 4 (A), где xy- и xz-срезы через центр сфероида показывают типичное распределение интенсивности из-за ослабления сигнала. Обратите внимание, что сигнал канала EdU также снижается в нижних частях сфероида, что делает невозможным обнаружение EdU-положительных клеток в этой области. Также обратите внимание, что ослабление сигнала из-за визуализации глубоких тканей — не единственная причина деторирования сигнала.При использовании, например, точечных сканирующих микроскопов, другие факторы, такие как фотообесцвечивание, также могут стать существенными.

Рис. 4. Затухание света в многоклеточных сфероидах.

(a) Вид сверху в плоскости xy сфероида с подогнанным эллипсоидом, где показаны каналы RFP (561 нм), Hoechst (405 нм) и EdU (640 нм). (б) Тот же сфероид, вид сбоку (плоскость xz). Сигнал от нижней части сфероида не обнаруживается (если предположить, что сфероид имеет эллипсоидальную форму).(c) Параметры сфероида, полученные из вертикальной профильной кривой RFP-сигнала через центр эллипсоида: верхняя z-координата, максимальная интенсивность, анализируемая глубина (соответствует заданному пользователем минимальному проценту интенсивности).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156942.g004

Поскольку все клетки в сфероидах несут стабильный флуоресцентный маркер (таким образом, предполагается, что он постоянный в пределах одного сфероида), их вертикальный профиль интенсивности через центр сфероид можно использовать как меру ослабления сигнала.Действительно, постепенное снижение стабильного сигнала маркера (здесь соответствует сигналу RFP) с увеличением глубины в сфероидной ткани наблюдается на Фиг.4 (C). Чтобы измерить максимальную глубину сфероида, до которой могут быть точно обнаружены положительные клетки, мы предполагаем, что ослабление конкретного флуоресцентного маркера сопоставимо с ослаблением стабильного маркера. Когда длины волн обоих каналов существенно не различаются, это разумное предположение. Учитывая заданное пользователем значение минимального процента интенсивности, которое должно сохраняться после ослабления сигнала, мы можем определить глубину анализируемой области сфероида (см. Раздел «Материалы и методы»).

Анализируемая глубина впоследствии сравнивается с вертикальным диаметром сфероида. Выявлены три различных случая (как показано на рис. S1):

1. Виден весь сфероид. На результаты не влияет ослабление света.
2. Видно более половины сфероида. Верхнее полушарие эллипсоида будет проанализировано, а результаты экстраполированы на нижнюю половину, предполагая аналогичные характеристики.
3. Видно менее половины сфероида.Сфероид не может быть проанализирован, потому что положительное количество клеток не может быть экстраполировано с поверхности сфероида на ядро, где, как ожидается, доступность кислорода и питательных веществ будет различной [11].

Поскольку только половина сфероида должна быть видна, предлагаемая нами процедура анализа расширяет окно размеров сфероидов, которые могут быть проанализированы, позволяя диаметрам быть примерно вдвое больше. Кроме того, будут идентифицированы сфероиды, которые слишком велики для полного анализа (например, случай 3), и их можно будет исключить из анализа образца.В случае, если необходимо исключить значительное количество сфероидов, предлагаемый анализ больше не подходит, и необходимо использовать другие типы анализа культур сфероидных клеток.

Проверка аппроксимации эллипсоида.

Для того, чтобы протестировать предложенный этап 2D сегментации, мы сравнили результаты автоматизированной и ручной 2D сегментации данных, оценив чувствительность обнаружения сфероидов и точность результирующих контуров, как подробно описано в разделе «Материалы и технологии». Раздел «Методы».MIP 8 стопок изображений были вручную сегментированы, как описано в разделе «Материалы и методы», и мы обнаружили среднюю точность 0,911 ± 0,066 и чувствительность 0,928 в пределах 95% доверительного интервала [0,909, 0,944]. Чувствительность сильно зависит от порога min _MIP , а также от того, относится ли сегментированный контур к категории сфероидов или шумов, особенно для сфероидов, средняя интенсивность которых близка к фоновой. На фиг. S2 (A) и S2 (B) мы построили график чувствительности и соотношения ложных срабатываний (FP) и их интервала оценки Уилсона как функции порога интенсивности min _MIP .Чувствительность уменьшается вместе с количеством ложных срабатываний с увеличением порога, поэтому существует определенный компромисс, который следует учитывать при установке порогового значения. S2 (C) и S2 (D) Фиг. Рис. Иллюстрируют среднюю интенсивность сфероида как функцию различных категорий, указывая на то, что контуры сфероида, классифицированные как ложноположительные (FP), обычно имеют низкую интенсивность. Точность контуров сегментации сфероидов, которые определены в GT как «хорошо разделенные сфероиды», значительно высока (точно совпадающий контур имеет точность, равную 1) и показывает, что неоднородность изображения высоты является допустимой. мера для сегментации этого типа клеточных культур.

Сфероиды, перекрывающиеся в MIP, не подходят для анализа (как показано на рис. 5 (A)). Поскольку ожидается, что округлость перекрывающихся сфероидов будет ниже, идентификация сфероидов с небольшим значением округлости позволит удалить большинство из этих объектов. Чтобы проверить, действительно ли существует корреляция между перекрытиями и округлостью сфероидов, округлость, определенная с помощью 2D-маски автоматической сегментации, была нанесена на график относительно различных классов GT, то есть хорошо разделенных сфероидов (красный), смежных сфероидов (голубой) и перекрывающиеся сфероиды (зеленые) на рис. 5 (B), где заметное уменьшение округлости можно наблюдать в перекрывающихся сфероидах (p ***).

Рис. 5. Проверка алгоритма сегментации эллипсоида.

(a-c) Классификация сфероидов, скрытых другими в данных GT, сравнивается с автоматической идентификацией этих сфероидов на основе округлости 2D-масок сфероидов. (а) иллюстрирует типичную ситуацию, когда форма двумерной маски сфероида не эллиптическая, потому что сфероид перекрывается с другим (более ярким), зеленая пунктирная линия показывает GT-контур сфероида, а сплошные контуры являются результатом автоматического сегментация.(b) показывает округлость сфероида, полученную в результате автоматической сегментации, как функцию класса сфероида в GT, где различные классы заданы карикатурой на оси x, представляющей хорошо разделенные (красный), смежные (синие) или перекрывающиеся (темно-зеленые) сфероиды. (c) показывает процент правильно сегментированных пикселей с помощью автоматической сегментации как функцию округлости для класса хорошо разделенных (красный) и перекрывающихся (зеленый) сфероидов. (d) показывает сфероиды разных размеров, которые классифицируются в соответствии с их анализируемой областью: анализируется весь, более половины или менее половины сфероида (категория видимости).Над полосами отображается количество сфероидов для каждой категории видимости. Метки большой (синий), средний (красный) и маленький (зеленый) соответствуют сфероидам с количеством ячеек больше 200, от 50 до 200 и меньше 50 соответственно.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156942.g005

Чтобы убедиться, что порог округлости удаляет перекрывающиеся сфероиды, была построена доля правильно сегментированных пикселей сфероидных масок как функция их округлости для каждого сфероида. и помечены ручной классификацией наземной истины на Рис. 5 (C).Корреляция между ними очень значима (p ***) с расчетным значением r = 0,70 и доверительным интервалом [0,64, 0,75]. MANOVA, примененный к данным, показывает, что распределения двух показанных классов сфероидов значительно различаются (p ***). Рисунок далее показывает, что применение порога округлости действительно удаляет большинство перекрывающихся сфероидов. В качестве нежелательного побочного эффекта этого фильтра были удалены некоторые хорошо разделенные, но неэллиптические структуры. Они могут представлять собой инвазивные сфероиды, а не компактные микропухоли, и исключаются из анализа.На фиг. S5 указано происхождение сфероидов, которые опущены из-за слишком низкой округлости. Для рассматриваемых наземных изображений было пропущено менее 20% сфероидов, в основном из-за того, что они были затемнены во время построения изображений.

Наконец, на рис. 5 (D), связь между размером сфероида и ослаблением света проиллюстрирована с использованием набора образцов, содержащего контроль и культуры, обработанные SOC (стандарт лечения), как описано в разделе «Материалы и методы». Как и в предыдущем разделе, сфероиды были разделены на группы по 100%, более 50% или менее 50% видимых сфероидов.В то время как стандартный метод анализа изображений 2D MIP может анализировать сфероиды только в первой категории 100% видимости, наш подход также позволяет количественно определять сфероиды, принадлежащие ко второй категории (> 50%), которая в этом случае содержит примерно 25% от общего числа сфероидов, как видно из подсчета сфероидов для каждой категории видимости.

Идентификация клеток, положительных по данному ядерному маркеру

Клетки, положительные по данному ядерному маркеру, обнаруживаются либо с помощью дорогостоящего в вычислительном отношении 3D, либо с помощью быстрого 2.Алгоритм 5D точечного обнаружения на основе MIP и высоты изображения соответствующего флуоресцентного канала. Предполагается, что разрешения достаточно для разрешения отдельных ядер, которые физически разделены цитоплазмой (как показано в S1 Movie). В обоих подходах маркерные положительные пятна обнаруживаются с использованием фильтра Лапласа гаусса (LoG) в масштабе ожидаемого размера ядра, который показывает координаты пятен на исходном изображении как локальные минимумы. Параметр максимального радиуса пятна устанавливается так, чтобы разрешить слияние нескольких локальных минимумов, происходящих внутри ядра, при сохранении различия между отдельными ядрами.Оптимальный масштаб для ожидаемого размера ядер определяется заранее с помощью 2D MIP. Общая суммарная интенсивность LoG MIP максимизируется за счет оптимизации параметра масштаба между одной десятой максимального радиуса пятна и самим значением. Кривая общей суммарной интенсивности как функция параметра масштаба показана на S3 Fig. После этого пятна фильтруются на основе их интенсивности, с порогом, равным средней интенсивности сфероида в MIP (в результате получается один порог для каждого изображения). .В качестве примера результаты подхода показаны на панели (b) S3 Fig, где красные кружки представляют обнаруженные EdU-положительные клетки. Для алгоритма обнаружения пятна 2.5D исходный стек изображений заменяется его 2D MIP, а координата z пятна получается из обзора высоты.

Применение подхода к изучению распространения

Мы применили предложенный нами алгоритм для анализа изображений пролиферирующих клеток в трехмерных сфероидных культурах, продемонстрировав его эффективность на частично ослабленных стеках изображений.Это изображения культур клеток многоклеточного сфероидного рака простаты, обработанных в течение 17 дней цитотоксическим соединением (доцетаксел) или цитостатическим соединением (MDV-3100). Как показано на фиг. 6, опухолевые клетки были помечены RFP, стромальные клетки — GFP, а красители Hoechst и EdU были применены для идентификации ядер и пролиферирующих клеток соответственно. Анализировали объем сфероида и количество EdU-положительных клеток на сфероид. Объем и количество EdU-положительных клеток на сфероид в конечной точке эксперимента показаны для культуры раковых клеток PC346-c для обоих соединений (фиг. 7A и 7B).Под действием доцетаксела уменьшается как объем, так и количество EdU-положительных клеток на сфероид. Общее количество EdU-положительных клеток на объем изображения (четыре разных поля были отображены в лунке для образца), показанное на фиг. 7 (C), дополнительно указывает на то, что обработка доцетакселом снижает общее количество EdU-положительных клеток в культуре.

Рис. 6. Данные примера анализа распространения.

(а): Схема маркировки используемых клеток и красителей. (b-c): изображение 3D культуры раковых клеток in vitro, меченных / окрашенных EdU, RFP, GFP и Hoechst.Показана проекция максимальной интенсивности.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156942.g006

Рис. 7. Сравнение предложенного метода анализа с базовым методом анализа 2D MIP.

Пролиферация культуры сфероидных клеток, количественно определенная с помощью EdU-положительных клеток, из трехмерной гомогенной сфероидной культуры, обработанной цитотоксическим соединением (доцетаксел, 1e-8 M) и цитостатическим соединением (MDV-3100, 1e-7 M). На (а) показан объем сфероида, а на (b) — количество EdU-положительных клеток на сфероид.В (c) показано общее количество положительных ячеек EdU на объем изображения, где размер точек представляет собой общее соотношение переднего плана / фона MIP стека изображений. В (d) сравнивается количество положительных клеток EdU, основанное как на предложенном, так и на методе анализа 2D MIP. Показана нормализованная разница в EdU-положительных клетках, взвешенная с объемом сфероида.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156942.g007

Сравнение с результатами 2D-анализа.

Важное различие между нашим подходом и стандартным 2D MIP-анализом (как описано в разделе «Материалы и методы») заключается в том, что количество обнаруженных EdU-положительных клеток в большом сфероиде корректируется. Значимость этой разницы показана при сравнении двух подходов на графиках на рис. 7 (D). Как и ожидалось, значительная отличная от нуля разница между двумя подходами обнаружена в обработанных MDV культурах, представляющих культуру с более крупными сфероидами. Предлагаемый нами новый алгоритм корректирует сигналы, потерянные из-за ослабления света, в то время как маленькие сфероиды в основном приводят к тем же результатам.Таким образом, наш подход особенно полезен для сфероидных культур, содержащих изрядное количество более крупных сфероидов в культурах. В частности, это может привести к значительной разнице при сравнении двух образцов, содержащих разные средние размеры сфероидов, больших и малых, например, при визуализации культуры растущих сфероидов в разные моменты времени. Смещение выборки больших сфероидов из 2D MIP-анализа может привести к неточным выводам.

Сравнение с полным 3D-анализом.

Мы сравнили предложенный алгоритм с полным трехмерным анализом, выполненным в широко используемом коммерческом инструменте общего назначения Bitplane Imaris (Bitplane AG, Швейцария, http://bitplane.com). Мы сравнили обнаружение пролиферирующих клеток и вычисление объема совпадающих обнаруженных сфероидов. Из-за различий в алгоритмах сегментации перекрытие обнаруженных сфероидов составило 63%. В S4 (A) Fig сравниваются объемы обоих методов. Объем, полученный при полном 3D подходе, в среднем больше, чем в 2.5D подход для маленьких сфероидов, но меньший для больших сфероидов. На панели (b) это проиллюстрировано. Мы предполагаем, что из-за сегментации на основе интенсивности в Imaris очень маленькие сфероиды, как правило, кажутся вытянутыми вдоль z-направления из-за плохого z-разрешения, увеличивая общий объем, в то время как более крупные сфероиды, как правило, не полностью отображаются из-за ослабления сигнала. . Чтобы проверить эту гипотезу, мы изобразили сферичность сфероидов как функцию их объема на панели (c). Уменьшение подобранной кривой указывает на то, что более крупные сфероиды не сегментированы правильно.Чтобы проиллюстрировать влияние на анализ роста, мы наносим на график разницу между количеством положительных клеток EdU, полученными с помощью нашего подхода и Imaris. Этот график на панели (d) показывает, что для больших сфероидов (где категория видимости меньше 100%) наш подход приводит к большему количеству пятен, что соответствует коэффициенту корреляции (Спирмен), который был равен 0,26.

Чтобы продемонстрировать вычислительное преимущество использования подхода 2.5D, мы рассчитали время для обоих методов (на стандартной рабочей станции с процессором Intel ^® Core ™ i7-3920XM, работающим на скорости 2.9 ГГц и 8 ГБ ОЗУ). Используемые стопки изображений имели размер 1024 x 1256 x 91 пиксель (использовались два 16-битных канала). В Imaris на сегментирование сфероидов и обнаружение пятен уходило в среднем 7 минут. Наш подход 2.5D выполнил это за 3 минуты, а при использовании упрощенного алгоритма обнаружения пятна (на основе MIP и обзора высоты) это сократилось до 1 минуты.

Материалы и методы

Стек изображений многоклеточных сфероидных культур

Клеточные культуры, использованные для тестирования метода анализа, содержали клетки рака простаты человека LNCaP (ATCC, Роквилл, США) или клетки PC346c (линия клеток рака простаты, полученная из Медицинского центра Erasmus через консорциум PREDECT) и CAF-PF179T фибробласты, ассоциированные с раком человека (линия клеток, полученная из Института Вейцмана через консорциум PREDECT) [32], встроенные в Matrigel ^® (Corning # 356231, Lot # 3198769, сниженный фактор роста, без фенолового красного, концентрация: 4 мг / мл).Их суспендировали в матрице и засевали (10000 опухолевых клеток и 1000 стромальных клеток в 60 мкл / лунку) в 96-луночные планшеты (96-луночные черные микропланшеты для культивирования клеток из полистирола с дном μClear ^® ; Greiner, # 655090), которые были предварительно покрытый матрицей (30 мкл / лунку). Обработка культур цитотоксическим соединением (доцетакселом) или цитостатическим соединением (MDV-3100) началась на 6-й день, когда культуры находились в экспоненциальной фазе, и эксперимент был завершен на 23-й день, когда необработанные культуры достигли стационарной фазы. .Раковые и стромальные клетки стабильно экспрессировали tRFP и eGFP соответственно. Перед визуализацией культуры клеток окрашивали 10 мкМ EdU в течение 2 часов (Click-iT EdU Alexa Fluor 647 HCS; Life Technologies) для обнаружения пролиферирующих клеток и Hoechst 33342 (8,1 мкМ, 30 мин) для мечения всех ядер, а затем фиксировали 4% формальдегид.

Пакеты микроскопических изображений многоклеточных сфероидных культур получали с помощью конфокального вращающегося дискового микроскопа Yokogawa CellVoyager 7000 (Wako Automation, Сан-Диего, США) с использованием UPLSAPO 10x / 0.4 NA и расстояние между срезами в стопке по оси Z 10 мкм. Пары длина волны возбуждения – фильтр, используемые для каналов tRFP, eGFP, Hoechst и EdU, составляли 561 нм — BP 600/37, 488 нм — BP 522/35, 405 нм — BP 447/45 и 640 нм — BP 676/29. , соответственно.

Наземные изображения

Наземные достоверные данные были сгенерированы для трехмерных гомогенных многоклеточных сфероидных культур рака LNCaP путем ручного рисования двухмерной маски для каждого сфероида на MIP. Более того, каждый сфероид был отнесен к одному из случаев: (1) хорошо разделены, (2) перекрываются с более яркими сфероидами в MIP (делая их неотделимыми), (3) перекрываясь с менее яркими сфероидами в MIP (отображая их хорошо отделимы), (4) просто касаясь других сфероидов, и (5) касаясь границы 2D-проекции изображения.Маркировка проводилась с использованием плагина RoiManager в FIJI (ImageJ) [24], в результате чего контуры для случаев (1) — (5) были окрашены в красный, зеленый, пурпурный, голубой и синий цвета соответственно. Эти наземные данные использовались для проверки шага 2D сегментации алгоритма путем определения чувствительности и точности и представлены в файле S2.

Реализация алгоритмов анализа

Анализ стеков изображений проводился с использованием набора инструментов анализа изображений DIPimage (Технологический университет Делфта, Делфт, Нидерланды) для MATLAB ^® (выпуск 2014a, The MathWorks Inc., Натик, США). Алгоритмы доступны в виде пакета сценариев MATLAB в файле S1: исходный код алгоритмов анализа изображений, содержащий как код для генерации фигур, так и реализацию метода. Для запуска предоставленного кода требуется рабочая среда MATLAB с установленным набором инструментов DIPimage и следующие внешние библиотеки: набор инструментов биоформатов для MATLAB, JSONlab и ReadImageJROI. Реализация также доступна на GitHub: https://github.com/mbarbie1/ellipsoids-analysis-paper.мерзавец.

Статистический анализ

Статистический анализ был выполнен в R (https://www.r-project.org) с использованием RStudio IDE (https://www.rstudio.com). Данные были проверены на нормальность с использованием критерия Шапиро-Уилкса, значимость была получена с использованием T-критерия Велча и непараметрического U-критерия Манна-Уитни для ненормальных распределений. Чтобы сравнить многомерные распределения, например данные для размера сфероида и количества пролиферирующих клеток применяли MANOVA. Во всех таких случаях сравнивались только две группы, поэтому приближение F-статистики сводится к статистике T-квадрата Хотеллинга.Значимость обозначена как *: p <0,05, **: p <0,01 и ***: p <0,001.

Расчет параметров трехмерной аппроксимации эллипсоида

Координата z центра и длина вертикальной оси берутся из пикселей исходного 3D-изображения. Z-координата центра эллипсоида определяется как среднее значение z-координат внешнего края маски 2D сегментации. Чтобы получить длину вертикальной полуоси эллипсоида, мы рассматриваем окрестность, которая содержит 8 ближайших соседних пикселей центра эллипса ( x _c , y _c ) в xy- плоскость и достаточный диапазон (в 2 раза превышающий наибольший диаметр D эллипса) в направлении z:

Усреднение по этой окрестности дает профиль I (z) через центроид маски сегментации двумерных сфероидов (см. Рис. 4 (C)).Координата z вершины сфероида (которая меньше всего страдает от ослабления света) определяется из кривой профиля как координата z над центром сфероида, где кривизна становится нулевой (точка перегиба). Когда двумерная маска рассматриваемого сфероида имеет площадь ниже определенного порогового значения min _{, радиус} , вышеупомянутый подход не используется; вместо этого длина вертикальной оси аппроксимируется средней длиной осей эллипса в плоскости.

Характеристика затухания сигнала в сфероидах

Глубина, до которой сфероид поддается анализу, ограничена ослаблением сигнала в ткани сфероида.Мы вычисляем максимальную глубину (координату z) в сфероиде, для которой определенный пользователем процент интенсивности все еще сохраняется после ослабления сигнала. Чтобы получить эту глубину, мы предполагаем, что: (1) флуоресцентное окрашивание опухолевых клеток является постоянным в пределах каждого сфероида, (2) коэффициенты рассеяния и поглощения, определяющие ослабление сигнала, постоянны внутри сфероидной ткани и равны нулю снаружи, и (3) ) значения интенсивности первого среза сфероида не имеют затухания.

Ожидается, что затухание сигнала будет наибольшим в (x, y) -центре эллипсоида для каждой координаты z. Поэтому вертикальный профиль интенсивности через центр эллипсоида используется для характеристики затухания сигнала. Профили интенсивности I ( z ) определяются, как описано в предыдущем разделе (см. Рис. 4 (C)). Обычно они имеют крутой наклон к одному максимуму I _max = max _z I ( z ) около вершины сфероида, за которым следует уменьшение интенсивности.Мы рассматриваем I _max как интенсивность без затухания, а процент, оставшийся после затухания, определяется как P _att ( z ) = 100 I ( z ) / I _max . Определенный пользователем порог для минимального сохраняемого процента P _min приводит к диапазону [ z _max , z _{анализируемому} ], для которого P _att ( z )> P _мин действителен.Анализируемая глубина сфероида определяется как расстояние между первой z-координатой сфероида и z _{анализируемым} .

Другие методы анализа, использованные для сравнения

Для сравнения использовались двухмерный MIP-анализ, а также полный трехмерный анализ. Оба подхода подробно описаны ниже.

Базовый метод анализа 2D MIP.

Для 2D-анализа пролиферации в тестовых данных был применен следующий подход к анализу изображений: аналогично предложенному алгоритму была получена 2D-маска сегментации MIP RFP-канала, после чего EdU-положительные клетки были идентифицированы с помощью 2D-изображения. Алгоритм точечного обнаружения выполняется на канале EdU.Но, в отличие от предложенного анализа, все EdU-положительные клетки в 2D-областях сфероидных масок считаются принадлежащими соответствующим сфероидам, и никакой коррекции ослабления сигнала не предпринималось.

Рабочий процесс полного трехмерного анализа на основе Imaris.

Анализ изображений был проведен с использованием функции извлечения клеток из ImarisCell, компонента Bitplane Imaris (v8.1.2, Bitplane AG, Швейцария, http://bitplane.com), где «сфероиды и пролиферирующие клетки» переводятся как « клетки и клеточные везикулы ».Сфероиды были сегментированы с помощью инструмента для извлечения поверхности, и были извлечены морфологические особенности поверхностей сфероидов. Пролиферирующие клетки выявляли с помощью прибора для точечного обнаружения. Впоследствии обнаруженные поверхности и пятна были импортированы в модуль анализа клеток для определения границ сфероидов и пролиферирующих клеток. Наконец, были экспортированы характеристики, относящиеся к расположению сфероидов и количеству пролиферирующих клеток. В заключение отметим, что, хотя существует метод коррекции ослабления для однородного ослабления сигнала (через модуль Imaris ImarisXT), наши сфероидные культуры в значительной степени неоднородны, и этот метод нельзя применять.

Чувствительность и точность маски 2D сегментации

Чтобы количественно оценить отклонение автоматизированной сегментированной маски от основного истинного изображения, мы сравниваем области двухмерного сегментированного изображения R _GT = { M _j } основного истинного изображения с областями R _A = { m _i }, найдено с помощью автоматической сегментации. Для каждой области M _j мы ищем соответствующую область m _i , которая перекрывается с M _j более чем на 50%.Области M _i , для которых не найдена соответствующая область, считаются ложноотрицательными (FN), в то время как области m _i не принадлежат области наземной истинности M _j являются ложными срабатываниями (FP). Чувствительность определяется соотношением: TP / (TP + FN), где TP означает истинные положительные результаты. Ошибка чувствительности определяется доверительным интервалом, определенным Уилсоном, так называемым интервалом оценки Уилсона [33].

Для истинно положительных результатов (сегментированные области m _i , которые принадлежат наземной области истинности в соответствии с вышеуказанным критерием) точность сегментации может быть определена количественно путем назначения штрафа, определяемого тем, насколько близки контуры двух областей. . Это делается следующим образом: расстояние пикселей областей м _i \ M _j (включая все пиксели из м _i , не принадлежащие M _j ) и M _j \ m _i , от контура области M _j рассчитывается, используя расстояние изображения (в мкм) контурной маски M _j , которая взвешивает вклад ошибки неправильно классифицированных пикселей.Сигмоидальная функция f ( x ) = 1 / {1 + exp [- k ( x — x ₀ )]} с x ₀ = 1,5 мкм и k = 2 мкм ^-1 применяется к этому расстоянию, так что очень маленькие ошибки в контуре сфероида мало влияют на оценку ошибки, но большие ошибки имеют постоянный вес. Затем пиксели суммируются и нормализуются путем деления на площадь целевой области. Результирующий штраф e _i близок к нулю для почти перекрывающихся сфероидальных масок, а точность сфероидальной маски m _i может быть определена как 1 — e _i .

Дополнительная информация

S1 Рис. Связь между категориями видимости и размером сфероида.

Слева направо показаны сфероиды уменьшающихся размеров как представители различных категорий видимости: измерить можно менее половины сфероида, более половины или весь сфероид. Показаны xy- и xz-срезы в середине сфероидов, наложенные белыми пунктирными контурами эллипсоидов (которые были подогнаны вручную). В плоскостях xz нарисованный вручную тонкий пунктирный контур показывает приблизительную границу анализируемой области сфероидов.По мере уменьшения размера сфероида функция рассеяния точки (PSF) конфокального микроскопа приводит к искажению сферической формы.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156942.s001

(TIF)

S2 Рис. Зависимость чувствительности сегментации от порога интенсивности min

_MIP.

(a-b) Зависимость чувствительности, отношения FP / P и их 95% доверительного интервала (Wilson) от порога, установленного на средней интенсивности сегментированных сфероидов (мин. _MIP ).(c) Показывает среднюю интенсивность каждого сфероида как функцию их категории сегментации: истинные положительные результаты (красный), ложные положительные результаты (зеленый), сфероиды, пропущенные при сегментации (синий), маски сегментации, объединяющие несколько сфероидов в GT (пурпурный), и сфероиды, которые обнаруживаются как множественные маски сфероидов (коричневые). (d) Представляет количество сфероидов для каждой из категорий.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156942.s002

(TIF)

S3 Рис. Обнаружение пятен в пространстве шкалы.

Шаги обнаружения пятна показаны на примере стека изображений в файле Data_3, который доступен от Dryad (doi: 10.5061 / dryad.0m9n7). (a) показывает общую сумму интенсивности пикселей MIP-изображения, отфильтрованного по LoG, как функцию параметра гауссова масштаба σ (параметр сглаживания). Значение σ, которое максимизирует общую сумму яркости пикселей (отрицательного LoG), представляет собой оптимальный масштаб σ для обнаружения пятна. (b) показывает визуальное сравнение результатов обнаружения пятна, происходящего из подхода 3D LoG, используемого в нашем подходе (красные кружки), и обнаружения трехмерного пятна, рассчитанного с использованием Bitplane Imaris (синие кружки).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156942.s003

(TIF)

S4 Рис. Сравнение предложенного метода анализа с подходом к анализу в полном 3D (с использованием Bitplane Imaris).

(a) полученный объем сфероида как для полного трехмерного метода (синие точки), так и для нашего подхода (красные точки) показан для соответствующих сфероидов. (b) отношение объема, полученного от Imaris, к объему, полученному с помощью нашего подхода, вместе с линейной аппроксимацией данных. На панели (c) сферичность сферических поверхностей, полученных в Imaris, представлена ​​как функция объема.Здесь получается нелинейная аппроксимация. (d) разность количества пролиферирующих клеток, полученная с помощью нашего подхода, с теми, которые получены в Imaris, нанесены на график, где цвета соответствуют категории видимости: 100% (красные точки) и> 50% (зеленые точки). Для этих образцов не было сфероидов с видимостью <50%.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156942.s004

(TIF)

S5 Рис. Сфероиды опущены при аппроксимации эллипсоида из-за неоднородности формы.

Процент сфероидов, опущенных из-за низкой округлости, классифицируется на сфероиды несферической формы, затемненные сфероиды или сфероиды с неправильной сегментацией. В качестве набора данных используются изображения наземной достоверности из файла Data_4, который доступен от Dryad (doi: 10.5061 / dryad.0m9n7).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156942.s005

(PNG)

S2 Файл. 2D наземная правда.

Это zip-файл, содержащий вручную сегментированные двумерные маски с метками наземной истины (соответствующие стеки трехмерных изображений можно найти в файле Data_4, который доступен в Dryad (doi: 10.5061 / дриада.0м9н7)). Раковые сфероиды (LNCaP) подразделяются на пять различных классов: (1) хорошо разделенные, (2) перекрывающиеся с более яркими сфероидами в MIP (делая их неотделимыми), (3) перекрывающиеся с менее яркими сфероидами в MIP (визуализация он хорошо отделяется), (4) просто касаясь других сфероидов, и (5) касаясь границы 2D-проекции изображения. Открытие изображений в FIJI (ImageJ) с помощью ROI Manager позволяет визуально проверить данные.

https://doi.org/10.1371 / journal.pone.0156942.s007

(ZIP)

S1 Фильм. Алгоритм обнаружения пятна проиллюстрирован на стеке трехмерных изображений, представленных в виде фильма.

Это стек 3D-изображений из файла Data_6, который доступен от Dryad (doi: 10.5061 / dryad.0m9n7), сохраненный как фильм в формате AVI со сжатием JPEG. Он показывает канал EdU стека трехмерных изображений в файле Data_3, доступном от Dryad (doi: 10.5061 / dryad.0m9n7), с положительными ячейками EdU, аннотированными маленькими сферами. Этот фильм может служить примером результата алгоритма обнаружения пятна (3D-версия).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156942.s008

(AVI)

Благодарности

Руководители рабочего пакета и платформы и представители партнеров в IMI PREDECT: Джон Хикман (Institut de Recherche Servier), Майк Бербридж (Institut de Recherche Servier), Эмми Вершурен (Университет Хельсинки), Олли Каллиониеми (Университет Хельсинки), Юха Клефстрём (Университет Хельсинки), Катрин Брискен (Федеральная политехническая школа Лозанны), Варда Роттер (Институт науки Вейцмана), Моше Орен (Институт науки Вейцмана), Катарина Брито (Институт экспериментальной биологии и технологии), Джек Соша Медицинский центр Университета Неймегена), Гвидо Йенстер (Erasmus MC Rotterdam), Вистке ван Верден (Erasmus MC Rotterdam), Яак Вило (Тартуский университет), Юлия Шулер (Oncotest GMbH), Оути Монни (Biomedicum Genomics Ltd), Саймон Т.Барри (AstraZeneca), Сильвия Грюневальд (Bayer Schering Pharma AG), Пекка Каллио (Orion Pharma), Ханс-Йоахим Мюллер (F. Hoffmann-La Roche AG), Адам Нопора (F. Hoffmann-La Roche AG), Вольфганг Зоммергрубер ( Boehringer Ingelheim International GmbH), Элизабет Андерсон (Boehringer Ingelheim International GmbH), Хайко ван дер Куип (Robert Bosch Gesellschaft fuer medizinische Forschung mbH), Ральф Грэзер (Boehringer Ingelheim International GmbH), Йоланда Т. Чонг (компании Janssen Pharmaceutical ), Рональда де Хугта (фармацевтические компании Janssen из Johnson & Johnson), Мэтью Смолли (Кардиффский университет), Эрвина Богаерта (AbbVie).Далее М. Барбье благодарит авторов набора инструментов DIPimage (Технологический университет Делфта).

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: SV RH RG YTC EG. Проведены эксперименты: КГ СВ. Проанализированы данные: МБ. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: KG RH SV FC SJ EG IMI PREDECT Consortium. Написал статью: MB SJ SV KG RG YTC EG RH.

Список литературы

1. 1. Hay M, Thomas DW, Craighead JL, Economides C, Rosenthal J.Показатели успешности клинических разработок исследуемых препаратов. Nat Biotechnol. 2014; 32 (1): 40–51. pmid: 24406927.
2. 2. Левингер И., Вентура Ю., Ваго Р. Жизнь трехмерна, как и должны быть культуры рака in vitro. Adv Cancer Res. 2014; 121: 383–414. pmid: 24889536.
3. 3. Wrzesinski K, Rogowska-Wrzesinska A, Kanlaya R, Borkowski K, Schwämmle V, Dai J, et al. Культурный разрыв: экспоненциальный рост в классическом 2D и метаболическое равновесие в 3D-средах.PLoS One. 2014; 9 (9): e106973. pmid: 25222612
4. 4. Aljitawi OS, Li D, Xiao Y, Zhang D, Ramachandran K, Stehno-Bittel L, et al. Новая трехмерная стромальная модель для тестирования чувствительности лейкозных клеток к химиотерапии in vitro. Лимфома лейка. 2014; 55 (2): 378–91. pmid: 23566162; PubMed Central PMCID: PMC40.
5. 5. Лонгати П., Цзя Х, Эймер Дж., Вагман А., Витт М.Р., Реммарк С. и др. Трехмерные сфероиды карциномы поджелудочной железы индуцируют богатый матрицей, химиорезистентный фенотип, предлагая лучшую модель для тестирования на наркотики.BMC Рак. 2013; 13: 95. pmid: 23446043; PubMed Central PMCID: PMC3617005.
6. 6. Перче Ф, Торчилин В.П. Сфероиды раковых клеток как модель для оценки протоколов химиотерапии. Cancer Biol Ther. 2012. 13 (12): 1205–13. pmid: 22892843; PubMed Central PMCID: PMC3469478.
7. 7. Jiguet Jiglaire C, Baeza-Kallee N, Denicolai E, Barets D, Metellus P, Padovani L и др. Ex vivo культуры глиобластомы в трехмерном гидрогеле сохраняют исходную динамику роста опухоли и подходят для доклинического скрининга лекарственной и радиационной чувствительности.Exp Cell Res. 2014. 321 (2): 99–108. pmid: 24355810.
8. 8. Кошкин В., Аиллес Л.Е., Лю Г., Крылов С.Н. Метаболическое подавление устойчивой к лекарствам субпопуляции в раковых сфероидных клетках. J Cell Biochem. 2015. pmid: 26054050.
9. 9. Хикман Дж. А., Грэзер Р., де Хугт Р., Видик С., Брито С., Гутекунст М. и др. Трехмерные модели рака для фармакологии и биологии раковых клеток: определение сложности опухоли in vitro / ex vivo. Biotechnol J. 2014; 9 (9): 1115–28. pmid: 25174503.
10. 10. Hickman JA. Доведение наркотиков до суда. Int Innov. 2013: 80–2.
11. 11. Тома С. Р., Циммерманн М., Агаркова И., Кельм Дж. М., Крек В. Системы трехмерных культур клеток, моделирующие детерминанты роста опухоли при обнаружении раковых мишеней. Adv Drug Deliv Rev.2014; 69–70: 29–41. pmid: 24636868.
12. 12. Hirschhaeuser F, Menne H, Dittfeld C, West J, Mueller-Klieser W., Kunz-Schughart LA. Сфероиды многоклеточных опухолей: недооцененный инструмент снова набирает обороты.J Biotechnol. 2010. 148 (1): 3–15. pmid: 20097238.
13. 13. Piccinini F. AnaSP: программный пакет для автоматического анализа изображений многоклеточных сфероидов. Компьютерные методы Программы Biomed. 2015; 119 (1): 43–52. pmid: 25737369.
14. 14. Chen W, Wong C, Vosburgh E, Levine AJ, Foran DJ, Xu EY. Высокопроизводительный анализ изображений сфероидов опухоли: удобное программное приложение для автоматического и точного измерения размеров сфероидов. J Vis Exp. 2014; (89). pmid: 25046278; PubMed Central PMCID: PMC4212916.
15. 15. Ke M-T, Fujimoto S, Imai T. SeeDB: простой и сохраняющий морфологию агент оптической очистки для реконструкции нейронных цепей. Nat Neurosci. 2013; 16: 1154–61. pmid: 23792946
16. 16. Чунг К., Уоллес Дж., Ким С.И., Калянасундарам С., Андалман А.С., Дэвидсон Т.Дж. и др. Структурный и молекулярный опрос интактных биологических систем. Природа. 2013. 497 (7449): 332–7. pmid: 23575631; PubMed Central PMCID: PMC4092167.
17. 17. Куваджима Т., Ситко А.А., Бхансали П., Юргенс С., Гвидо В., Мейсон К.ClearT: метод очистки нейронов и ненейрональных тканей без использования моющих средств и растворителей. Разработка. 2013; 140: 1364–8. pmid: 23444362
18. 18. Хама Х., Курокава Х., Кавано Х., Андо Р., Шимогори Т., Нода Х. и др. Масштаб: химический подход к флуоресцентной визуализации. Nat Neurosci. 2011; 14: 1481–8. pmid: 21878933
19. 19. Helmchen F, Denk W. Двухфотонная микроскопия глубоких тканей. Нат методы. 2005. 2 (12): 932–40. pmid: 16299478.
20. 20. Пампалони Ф, Ансари Н, Стельцер Э.Глубокая визуализация живых клеточных сфероидов с высоким разрешением с помощью флуоресцентной микроскопии на основе световых пластин. Cell Tissue Res. 2013; 352 (1): 161–77. pmid: 23443300.
21. 21. Томер Р., Хайри К., Амат Ф, Келлер П.Дж. Количественная высокоскоростная визуализация целых развивающихся эмбрионов с одновременной многоэкранной световой микроскопией. Нат методы. 2012. 9 (7): 755–63. pmid: 22660741.
22. 22. Strasters KC. Количественный анализ в цитометрии конфокальных изображений. Кандидатская диссертация. Делфт: Издательство Делфтского университета, 1994.
23. 23. Strasters KC, van der Voort HTM, Geusebroek JM, Smeulders AWM. Быстрая коррекция затухания при флуоресцентной конфокальной визуализации: рекурсивный подход. Биовизуализация. 1994; 2: 78–92.
24. 24. Schindelin J, Arganda-Carreras I, Frize E, Kaynig V, Longair M, Pietzsch T. и др. Фиджи: платформа с открытым исходным кодом для анализа биологических изображений. Нат методы. 2012. 9 (7): 676–82. Epub 2012/06/30. pmid: 22743772; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC3855844.
25. 25. де Шомон Ф., Даллонжвиль С., Шенуар Н., Эрве Н., Поп С., Провуст Т. и др.Icy: открытая платформа информатики биоизображений для расширенных воспроизводимых исследований. Нат методы. 2012. 9 (7): 690–6. pmid: 22743774.
26. 26. Харма В., Щуков Х.П., Хаппонен А., Ахонен И., Виртанен Дж., Сиитари Х. и др. Количественная оценка динамических морфологических реакций на лекарства в трехмерных органотипических культурах клеток с помощью автоматического анализа изображений. PLoS One. 2014; 9 (5): e96426. pmid: 24810913; PubMed Central PMCID: PMC4014501.
27. 27. Лу Х, Канг М., Ксенопулос П., Муньос-Дескальцо С., Хаджантонакис А.К.Быстрый и эффективный метод ядерной сегментации 2D / 3D для анализа данных изображений ранних эмбрионов мыши и стволовых клеток. Отчеты о стволовых клетках. 2014. 2 (3): 382–97. pmid: 24672759; PubMed Central PMCID: PMC3964288.
28. 28. Hodneland E, Kogel T, Frei DM, Gerdes HH, Lundervold A. CellSegm — набор инструментов MATLAB для высокопроизводительной трехмерной сегментации ячеек. Исходный код Biol Med. 2013; 8 (1): 16. pmid: 23938087; PubMed Central PMCID: PMC3850890.
29. 29. Gue M, Messaoudi C, Sun JS, Boudier T.Smart 3D-FISH: автоматизация анализа расстояний в ядрах интерфазных клеток путем обработки изображений. Цитометрия А. 2005; 67 (1): 18–26. pmid: 16082715.
30. 30. Trinh A, Rye IH, Almendro V, Helland A, Russnes HG, Markowetz F. GoIFISH: система для количественной оценки неоднородности отдельных клеток по изображениям IFISH. Genome Biol. 2014; 15 (8): 442. pmid: 25168174; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC4167144.
31. 31. Паркер Д.Л., Чепмен Б.Е., Робертс Дж. А., Александр А. Л., Цуруда Дж. С..Повышенная детализация изображения за счет непрерывности в Z-буфере MIP: приложения к магнитно-резонансной ангиографии. J. Магнитно-резонансная томография. 2000. 11 (4): 378–88. pmid: 10767066
32. 32. Мадар С., Брош Р., Буганим Ю., Эзра О., Гольдштейн И., Соломон Х. и др. Модулированная экспрессия WFDC1 во время канцерогенеза и клеточного старения. Канцерогенез. 2009. 30 (1): 20–7. pmid: 18842679; PubMed Central PMCID: PMC2639035.
33. 33. Уилсон ЭБ. Вероятный вывод, закон преемственности и статистический вывод.J Am Stat Assoc. 1927. 22 (158): 209–12.
.

No related posts.