Матрих протеин: Matrix 5.0 от Syntrax — цена: от 1692 руб. — купить протеин недорого в Москве

Протеин Syntrax Matrix 5.0 — калорийность, полезные свойства, польза и вред, описание

Калории, ккал: 

393

Углеводы, г: 

9.5

Matrix 5.0 – популярная многосоставная протеиновая смесь от американской компании Syntrax. Упаковка продукта представляет собой ламинированный пакет на многоразовой гибкой молнии-застежке, позволяющей сохранить полезность смеси в течение всего периода употребления. В продаже доступен протеин со вкусом шоколада, ванили, а также мятного пряника, клубники и печенья «Арахисовое масло».

Калорийность протеина Syntrax Matrix 5.0

Калорийность протеина Syntrax Matrix 5.0 составляет 393 ккал на 100 грамм сухого продукта.

Состав протеина Syntrax Matrix 5.0

Для изготовления используются: ультрафильтрованный и неденатурированный концентрат сывороточного протеина, ультрафильтрованный и неденатурированный концентрат молочного протеина, включая мицеллярный казеин, неденатурированный яичный белок, гидролизованная пшеничная клейковина, натуральные и искусственные ароматизаторы, соевый лецитин, натрия хлорид, ацесульфам-К, сукралоза.

Продукт имеет насыщенный аминокислотный состав. Питательность одной порции (мерная ложка – около 30-32 грамм): калории – 120, белков – 23 г, жиров – 2 г, углеводов – 3 г, а также натрия – 150 мг и калия – 270 мг.

Упаковка содержит около 76 порций. Продукт не является лекарством.

Протеин Syntrax Matrix 5.0 в спорте

Поскольку продукт содержит три вида разных изолятов, он идеален для строительства сухой мышечной массы, уменьшения жировых отложений, обладает антиоксидантными свойствами и повышает иммунитет спортсмена (calorizator). Благодаря употреблению данного продукта обеспечивается положительный азотистый баланс и стабильный уровень инсулина в крови, что очень важно для процессов восстановления и роста мышц организма.

Способ приготовления протеина Syntrax Matrix 5.0

Для удобства измерений порций в упаковке имеется специальная мерная ложка (около 30-32 грамм смеси). На приготовление одного коктейля необходимо размешать в стакане воды или молока низкой жирности мерную ложку смеси. Важно понимать, что чем выше жирность молока, тем более калорийным получится коктейль (калоризатор). Принимать протеин можно до 2-3 раз в день: сразу после пробуждения, по окончании интенсивных тренировок и непосредственно перед сном, не забывая «вписывать» приём коктейля в свою суточную калорийность.

Противопоказания к применению протеина Syntrax Matrix 5.0

Индивидуальная непереносимость компонентов продукта, беременность и кормление грудью, лица младше 18 лет. Перед применением проконсультироваться с врачом.

Протеин Syntrax — Matrix 5.0

Matrix 5.0 от Syntrax – великолепное сочетание цены и качества

Чтобы создать идеальную формулу протеиновой смеси Matrix 5.0, компании Syntrax понадобилось несколько лет. Первым делом ученые Syntrax полностью отказались от дешевых низкокачественных источников белка, отдав предпочтение только лучшим: ультрафильтрованному сывороточному протеину, ультрафильтрованному молочному протеину, неденатурированному яичному белку и глютаминовым пептидам. Эти источники белка 

не имеют себе равных в обеспечении прироста качественной мышечной массы и улучшении общего состояния организма.

Немаловажно, что Синтракс так же позаботилась и о вкусовых свойствах своего продукта. После долгих испытаний в лабораториях, протеин Matrix 5.0 приобрел превосходный шоколадный и ванильный вкус, которым редко обладают протеиновые смеси.

Порция Syntrax Matrix 5.0 это:

• Всего лишь 110 килокалорий;
• 23 грамма белка;
• 2 грамма углеводов;
• 0 грамм аспартама.

Сывороточный белок, мицеллярный казеин и яичный белок – отличные источники аминокислот, необходимых вашему организму. Каждый из них имеет свои специфические особенности. Из-за богатого аминокислотного состава и высокого содержания различных факторов роста и микроэлементов яичный белок часто называют «идеальным белком». Поэтому яичный белок — это самый дорогой вид белка. Сывороточный протеин является быстрейшим источником белка и обладает превосходными иммуностимулирующими способностями. Казеин – это самый медленный белок, он обеспечивает ваши мышцы аминокислотами в течение длительного времени и обладает самыми высокими антикатаболическими свойствами. Таким образом, первоклассная протеиновая смесь Матрикс 5.0 сводит к минимуму недостатки и подчеркивает сильные стороны каждого из этих видов белка.

Из-за совершенного сочетания разных протеинов Matrix 5.0 от Syntrax можно использовать как первоклассный источник белка в любое время суток. Кроме того, формула Матрикс хорошо сбалансирована и подходит как для людей, стремящихся набрать мышечную массу, так и для желающих избавиться от лишних килограммов. Протеиновая смесь Matrix 5.0 обеспечивает необходимое для поддержки правильного функционирования почек и иммунной системы количество антиоксидантов в организме.

Неоспоримый плюс: чтобы приготовить коктейль из Matrix 5.0, вам не нужен блендер – эта протеиновая добавка отлично размешивается в шейкере и даже ложкой в обычном стакане!

Благодаря вышеперечисленным преимуществам, протеиновая добавка Matrix 5.0 от компании Syntrax зарекомендовала себя на рынке спортивного питания как качественный и доступный продукт.

Применение:

Размешайте одну мерную ложку в 250-300 мл воды или  молока. Принимайте два — три раза в день, чтобы восполнить запасы протеина. Помните,что наилучшее время приема — с утра после пробуждения, после интенсивных тренировок и перед сном.

Противопоказания:

Индивидуальная непереносимость компонентов продукта.

состав, плюсы и минусы рекомендации по применению

Среди комплексных протеинов высокого качества следует упомянуть о Syntrax Matrix. Его формула разработана специально для тех атлетов, которые хотят от протеиновой добавки всего и сразу, а именно: быстрого усвоения, в то же время длительного высвобождения аминокислот, а также компонентов высочайшего качества по доступной цене. Все это совмещает в себе протеин от Синтракс.

Особенности протеина Matrix

Здесь стоит остановиться на особенностях отдельных компонентов. В составе Матрикс содержится смесь, включающая в себя сывороточный протеин, мицеллярный казеин и яичный альбумин.

• Сывороточный протеин известен своими способностями быстро насыщать мышцы аминокислотами в тот момент, когда это особенно необходимо. Скорость поступления аминокислот из сыворотки составляет примерно полчаса. Таким образом, это незаменимый компонент для употребления после тренировки, позволяя быстро восстанавливать мышцы и предупреждать повышение уровня кортизола, то есть предупреждать катаболизм.
• Мицеллярный казеин состоит их мицелл, способных притягиваться и собираться в сгусток, обеспечивая длительное высвобождение аминокислот. Мицеллы казеина обеспечивают расщепление аминокислот от 8 до 12 часов. Такой компонент защищает мышцы от разрушения во время сна и после нагрузок, постоянно подпитывая мышцы строительным материалом. Именно этого часто не хватает в обычных сывороточных протеинах. Но в отличие от чистого казеина, Матрикс начинает действовать в два раза быстрее.
• Яичный альбумин – самый биодоступный и легкоусваиваемый белок, который усваивается организмом почти полностью. Как единственный компонент в протеиновых добавках будет стоить дороже, поэтому приобретать яичный протеин не очень-то выгодно. Альбумин яиц содержит широкий аминокислотный комплекс.

Какие вкусы и объемы упаковок протеина Syntrax бывают

Среди разнообразия линейки Матрикс, протеин можно встретить со вкусом:

• молочного шоколада;
• мятного печенья;
• печенье-крема;
• клубничного крема;
• шоколада;
• ванили;
• бананового крема;
• арахисового масла;
• апельсина.

В линейке встречаются упаковки объемом:

• 454 г;
• 938 г;
• 2275 г;
• 2290 г.

Состав протеина Syntrax Matrix

1 порция 30 г содержит:

• Калории – 150 ккал.
• Белки – 25 г.
• Углеводы – 1,5 г.
• Жиры – 1 г.
• ВСАА – 7 г.

Также в 100 граммах Матрикса присутствует комплекс аминокислот, состоящий из:

• Аргинина — 2,5 гр.
• Глютамина — 8,4 гр.
• Гистидина — 2,1 гр.
• Изолейцина — 5,8 гр.
• Лейцина — 10,3 гр.
• Лизина — 8,7 гр.
• Метионина — 2,2 гр.
• Фенилаланина- 3,6 гр.
• Треонина — 6,4 гр.
• Триптофана — 1,9 гр.
• Валина — 6 гр.

Плюсы протеина Матрикс

1. Протеин изготовлен из сырья высокого качества, без дешевых и синтетических примесей.
2. Комплекс вобрал в себя лучшие виды белка из молока, сыворотки и яиц.
3. Сравнительно невысокая цена.
4. Матрикс, в одно время, быстро расщепляется на аминокислоты благодаря сывороточным и яичным белкам, в другое время – долго высвобождается благодаря мицеллярному казеину.
5. Содержит мало жиров и углеводов по сравнению с аналогичными комплексными протеинами. Это позволяет принимать продукт тем людям, которые следят за весом и работают на рельеф мышц.
6. Несмотря на то, что это комплексный продукт, его состав приближен к изолятам многих конкурентов.
7. Также содержит пептиды глютамина.
8. Матрикс подвергается клиническим испытаниям.

Минусы добавки

1. Наличие яичного альбумина может вызвать аллергию у лиц, чувствительных к этому компоненту.
2. Продукт содержит лактозу, поэтому не рекомендуется принимать при ее непереносимости.

Кому подойдет, и для каких целей

Этот новаторский продукт подойдет и тем, кто хочет увеличить мышечную массу, и тем, кому необходимо улучшить рельеф, без потери мышечной массы.

Как принимать Matrix protein

При наборе мышечной массы:

• Принимайте протеин утром, после основного приема пищи, если есть необходимость в дополнительном источнике белка.
• За два часа до тренировки, чтобы компоненты успели частично усвоиться и не доставляли дискомфорт при нагрузках, или сразу после тренировки.
• И последнюю порцию перед сном.

1 мерный стакан порошка можно разводить водой, молоком, соком, объемом 200-250 мл, в зависимости от необходимой консистенции.

Не стоит превышать прием протеина более 3 порций в день.

При тренировках на рельеф употребляйте протеин на воде. Достаточно двух порций в день:

1. до или после тренировки;
2. и на ночь.

В дни отдыха можно принять протеин утром.

Аналоги Matrix

Матрикс можно сравнить с его конкурентом – комплексным протеином BSN Syntha 6. Конечно, в БСН больше источников белка, но среди них есть и яичный альбумин, и мицеллярный казеин, и сывороточный протеин. Но, несмотря на то, что в Синте присутствует изолят и концентрат сыворотки, Матрикс по составу больше похож на изолированный протеин. В одной порции Синты содержится 200 ккал, и целых 18 углеводов и 6 г жира.

Заключение

Вот такую гамму компонентов собрал Матрикс, а это не может оставить равнодушными спортсменов, которые ценят продукты спортивного питания, не содержащие дешевых примесей из растительных источников белка, например сои, которой производители любят разбавить и удешевить продукт.

Обзор протеина Matrix в видео формате

А также читайте, обзор протеинов Impact Whey от MyProtein →

как принимать, состав и отзывы

Протеин Matrix 5.0 от Syntrax нужен для восполнения дефицита белка при занятиях спортом. С традиционным рационом сложно получить рекомендуемые для фитнеса 1,5-2 г белка на килограмм массы тела, поэтому используются порошковые добавки. «Матрикс» отличается ярким вкусом, содержит не только сывороточный, но и яичный белок, и продается по доступной цене. Это добавка нового поколения, легко растворимая без специального шейкера в воде, и удобная для повседневного употребления.

Состав Matrix 5.0 от Syntrax

Перед нами комплексная протеиновая добавка. Она состоит из:

• Пептидных фракций;
• Молочного и сывороточного белка;
• Яичного альбумина;
• Казеиновых белков

Время усвоения разных белков отличается, поэтому комплексные добавки более удобны для тех, кто хочет постоянно иметь некий запас аминокислот для восполнения белкового дефицита.

Пептидные фракции глютамина отличаются быстрым и легким усвоением, они хорошо работают, когда необходимо немедленно восполнить запас аминокислот.

Яичный альбумин считается самым полноценным белком, он усваивается чуть медленней, чем сыворотка, но содержит полный набор аминокислот.

Сывороточный протеин считается эталонным для приготовления спортивных добавок. Он полноценный по составу, и быстро усваивается. Качественная сыворотка не содержит жиров и сахара, и не является источником лактозы.

Молочный белок добавлен в формулу, чтобы немного замедлить усвоение. Самый «долгоиграющий» белок тут – казеин. Благодаря нему, порция «Матрикса» — это полноценный прием пищи.

Три преимущества «Матрикс»

Бюджетная стоимость. «Синтракс» экономит на пластиковых банках и этикетках. Протеин расфасован в пакеты с зиппером, мерная ложка прилагается. Это позволяет предлагать качественный белковый продукт по цене на 20% дешевле, чем у других производителей. Протеин Matrix 5.0 от Syntrax хорош для замены приемов пищи или дополнительного питания.

Возможность гибко варьировать время приема. Комплекс содержит белки с разной скоростью усвоения, потому можно пить этот протеин как утром, после пробуждения, так и вечером, перед сном, а также вместо перекуса, и после тренировки.

Полноценный состав включает в себя все аминокислоты, и всего 5 г углеводов из лактозы молочного протеина на 100 г порошка. Это ничтожное количество, им можно пренебречь, если речь не идет о соревновательной сушке.

Протеин отличается разнообразием вкусов. От классических «Ванили», «Клубники» и «Шоколада», до новых «Арахисовая паста», «Печенье», и «Фруктовый», эта добавка подойдет на все случаи жизни.

Как принимать Matrix 5.0 от Syntrax

Одна порция порошка содержит 32 г вещества. Нужно развести это в 200 мл воды или молока, либо сока, если нужны углеводы дополнительно. Коктейль принимают утром до завтрака, после тренировки и перед сном, это даст примерно 90 г белка в сутки. Такое количество позволит дополнить типичный рацион до 2 г белка на 1 кг массы тела. Есть ли смысл пить больше протеина? Один источники утверждают, что за раз усваивается только 30 г белка, другие не так радикальны в высказываниях, и считают, что усваивается все, вопрос только в скорости пищеварения.

Протеин не принимают «курсами» или периодами. Пока человек тренируется в зале, и ему требуется дополнительный белок, он может пить протеиновую добавку. Собственно, нет никакой проблемы с ее употреблением и теми, кто не тренируется в зале, но по какой-то причине не может получить весь необходимый белок из пищи.

Отзывы

Если судить по отзывам атлетов, это один из самых вкусных протеинов. Людям особенно нравится «молочный шоколад» и «мятное печенье». Эти два вкуса – в абсолютном «топе» фаворитов. Кто-то утверждает, что коктейль на воде не такой густой, как, например, у «Квест» или других американских марок, но это обусловлено отсутствием в составе гуаровой камеди в больших количествах. «Матрица» нравится людям за недорогую цену, хороший вкус, и богатый аминокислотный состав.

Отзывов о нарушении работы пищеварительной системы от этого протеина не замечено. Люди отмечают хороший вкус, и отсутствие проблем. Есть отдельная категория отзывов от выступающих спортсменов. Те, кто убирает протеин на подводке к сцене, не сталкиваются с какими-либо проблемами с «заливкой». Так или иначе, любой протеин содержит подсластители, которые задерживают воду. Это надо учитывать, если цель состоит в выступлении по бодибилдингу.

Помимо коктейлей, с Matrix 5.0 от Syntrax можно готовить запеканки, блины, печенье и даже протеиновые торты. Он может заменять муку в диетической выпечке, успешно смешивается с другими ингредиентами и придает блюдам приятный вкус.

Протеин Matrix 5.0 от Syntrax – выгодное решение как для профессиональных атлетов, так и для любителей фитнеса.

Syntrax Matrix 2.0 — Протеины

Matrix 2.0 это протеин который имеет не только прекрасный вкус, но и усиливает способности организма к восстановлению, росту мышечных тканей и способствует улучшению анаболических процессов всего организма. Качество смеси действительно находится на высшем уровне и позволяет добиваться ошеломляющих результатов тысячам спортсменам, это один из самых популярных протеинов на рынке спортивного питания и самый верный путь для набора сухой мышечной массы,которая останется с Вами надолго.

— Один из лучших протеинов продолжительного действия.
-23г белка в каждой порции из сывороточного протеина, мицеллярного казеина и яичного альбумина
-Жизненно важные питательные вещества для поддержания здоровья и восстановления мышц
-Гарантированно превосходный вкус – один из лучших на сегодняшний день
-Устойчивые по усвояемости глютаминовые пептиды

Вкусы, разработанные компанией Syntrax действительно восхитительны, Благодаря тому, что сыворотку комплексного протеина Matrix подвергли специальной обработке для быстрого приготовления,  теперь порция порошка мгновенно растворяется в вашем любимом напитке . Никаких комочков, никакого взбивания в блендере, никакой грязи на кухне…. Перемешали ложкой – и Matrix готов!

Состав на порцию (31 г):

Калории – 120, в т. ч. Калории от жиров – 15
Всего жиров – 2 г, в т. ч. Насыщенные жиры – 1 г
Холестерин – 40 мг
Натрий – 150 мг
Калий – 270 мг
Всего углеводов – 3 г
Протеин – 23 г

Ингредиенты: Протеиновая смесь Matrix (ультрафильтрованный и неденатурированный концентрат сывороточного протеина, ультрафильтрованный и неденатурированный концентрат молочного протеина (включает в себя казеин), неденатурированный яичный белок, гидролизованная пшеничная клейковина (источник глютаминовых пептидов)), натуральные и искусственные ароматизаторы, лецитин, хлорид натрия, аспартам, ацесульфам калия.

Рекомендации по применению: Смешать 1-2 мерные ложки Matrix 2.0 в 230-450 мл воды, обезжиренного молока, либо другого напитка на ваш выбор. Для максимального эффекта Matrix 2.0 следует принимать 3 раза в день. Первую порцию утром сразу после пробуждения, вторую – после тренировки и третью – перед сном.

Комплексный протеин SYNTRAX Matrix 2 lbs 907 г, Апельсиновый крем

Описание Matrix 2 lbs

• Неденатурированный сывороточный протеин
• Мицеллярный казеин и яичный белок
• Анаболические и антикатаболичские протеины
• Глютаминовые пептиды
• Легко смешивается
• Протеин, имеющий лучший вкус!

Проблема: стандартный протеин, который является низкокачественным, содержит вызывающий скопления жира мальтодекстрин, с ужасным вкусом, требующий блендер, чтобы размешаться полностью и содержащий всего один вид быстроусваиваемого протеина. Без сомнения, большинство из стандартных протеинов стоят дешево, но кто захочет давиться таким не удобным и не полезным протеином день ото дня?

Решение: Matrix! Проведя годы за созданием формулы Matrix, мы создали протеин, который решает все проблемы стандартных протеинов. Самое важное то, что мы полностью ушли от таких дешевых источников протеина, как денатурированные натрия и кальция казеинат. Мы знаем, чтобы быть лучше, мы должны использовать только высококачественные неденатурированные источники протеина, такие как ультрафильтрованный сывороточный протеин, ультрафильтрованный молочный протеин, неденатурированный яичный белок и глютаминовые пептиды. Стоимость намного выше, но результат оправдывает себя. Смесь этих протеинов имеет не только имеет великолепный вкус, но и недосягаемую полезность для здоровья и обменных процессов организма, особенно при строительстве новой мышечной массы.

Сделав абсолютно лучший протеин на рынке, мы знали, что должно сделать что-то еще. Мы решили, что мы не успокоимся пока не создадим абсолютно лучший вкус протеина на рынке. После многих проб, мы пришли к нескольким вкусам, которые буквально вызывают экстаз при употреблении.

Завершая решение проблемы, мы сделали так, чтобы Matrix полностью растворялся в вашем любимом напитке, не оставляя комочков. Больше никаких комочков или блендеров, которые только добавляют вам работы по мытью посуды. С Matrix вам нужна только ложка!

Факты:

1. Что такое Matrix ?

Matrix — это смесь высококачественного протеина.

2. Что делает Matrix отличным от конкурентов?

Любой другой экономичный протеин на рынке спортивного питания — это просто сывороточный протеин. Matrix подороже, но он содержит комбинацию из трех разных высококачественных протеинов, таких как сывороточный протеин, мицеллярный казеин и яичный протеин (белый яичный протеин).

3. Зачем нужна смесь различных видов протеина, вместо одного вида протеина?

На самом деле, существует несколько высококачественных источников протеина, такие как яйца, казеин и сыворотка, как всегда не один из них настолько хорош в одиночку. Все эти источники протеина воздействуют на организм и рост мышечной массы, но каждый из них имеет свои слабости и преимущества. Например, яичный протеин — это золотой стандарт источника белка. Он не только прекрасно поддерживает рост мышечной массы, но также содержит массу полезных веществ и микроэлементов. Обратная сторона яичного протеина — это его дороговизна. Изолят сывороточного протеина показал себя как самый быстроусваиваемый источник протеина и имеет превосходные качества по поддержанию имунной системы. Казеин показал себя как медленноусваиваемый источник протеина, который превосходно снабжает мышечную ткань аминокислотами, в течение долгого периода времени. Таким образом, даже не смотря на то, что употребление каждого их этих протеинов имеет свои преимущества, лучшим решение будет употребление одновременно нескольких высококачественных источников белка, чтобы уменьшить недостаки и увеличить пользу каждого источника протеина.

4. Когда лучшее время для использования Matrix?

Так как Matrix содержит оба источника белка и быстроусваиваемый и медленноусваиваемый, он является идеальным для использованию в любое время дня. Некоторые используют, как быстроусваиваемый сыворотный протеин, сразу после тренировки, а некоторые, как медленноусваиваемый казеиновый протеин, перед сном. Из-за того, что Matrix содержит медленный (казеиновый), средний (яичный) и быстрый (сывороточный) протеины, он идеален для любой ситуации. Он может быстро снабдить ваши мускулы необходимыми аминокислотами, так же хорошо, как и сделать запас полезных элементов для вашего тела на длительный период.

5. Состав аминокислот находящихся в Matrix лучший на рынке!

Более того, так как в нем содержатся три вида разных изолятов, он хорош для строительства сухой мышечной массы, уменьшения жировых отложений, имеет антиоксидантные свойства, повышает иммунитет организма и т.д.

Рекомендации по применению

Смешайте одну мерную ложку Matrix с 240 мл. воды или молока. Для тех, кто нуждается в пониженной порции протеина, половина одной мерной ложки смешайте с 120 мл. воды или молока. Когда вы мешаете с молоком вы добаляете больше калорий. Принимайте Matrix два-три раза в день, чтобы удовлетворить ваши потребности в протеине. Помните, что наилучшее время приема протеина — это с утра после подъема, после интенсивных физических нагрузок, таких как тренировки с весом и прямо перед сном. Мы гарантируем, что Matrix размешивается даже ложкой и имеет превосходный вкус. Не превышайте рекомендуемую дозировку. Продукт не должен использоваться, как замена полноценного питания. Прекратите прием продукта, если почувствуете отклонения от нормального состояния здоровья.

Состав

Состав в	30 г
Энергетическая ценность	140 ккал
в жирах	20 ккал
Жиры	2.5 г
насыщенные жиры	1 г
транс жиры	0 г
Холестерин	40 мг
Натрий	130 мг
Калий	210 мг
Углеводы	6 г
пищевые волокна	0 г
сахара	3 г
Белки	23 г
Важные аминокислоты на 100г белка
Аргинин	2.5 г
Глютамин	8.4 г
Гистидин	2.1 г
Изолейцин	5.8 г
Лейцин	10.3 г
Метионин	2.2 г
Фенилаланин	З.б г
Треонин	6.4 г
Триптофан	1.9 г
Валин	6.0 г
Другие ингредиенты: протеиновая смесь из молока (ультрафильтрованный и неденатурированный концентрат сывороточного протеина (бренд ProminaTM), ультрафильтрованный и неденатурированный концентрат молочного протеина, включая мицеллярный казеин), протеиновая смесь (неденатурированный яичный белок, гидролизованная пшеничная клейковина (источник глютаминовых пептидов)), натуральные и искусственные ароматизаторы, соевый лецитин, соль, ацесульфам-К, сукралоза.

Не является лекарством. Перед началом приема любого продукта обязательно проконсультируйтесь у специалиста

Информация о характеристиках, внешнем виде носит справочный характер и основывается на последних доступных к моменту публикации сведениях

---

Matrix 5.0 2,27 кг от Syntrax

Отличительные особенности Syntrax Matrix
Технологи компании Syntrax при создании протеинового комплекса Matrix® полностью отказались от таких дешевых источников белка как денатурированные казеинаты кальция и натрия.
В состав Matrix® входят только протеины высочайшего качества: ультрафильтрованный сывороточный протеин, ультрафильтрованный молочный протеин, натуральный яичный альбумин и пептиды глютамина. Они стоят намного дороже, но качество является залогом эффективности данного продукта.
Matrix® не только обладает превосходным вкусом, но и положительно влияет на состояние здоровья.
Все источники белка имеют по отдельности свои сильные и слабые стороны. Например, яичный протеин идеально усваивается и содержит большое количество факторов роста, но при этом очень недешев.  Сывороточный протеин быстрее всего усваивается и улучшает иммунитет. Казеин долго усваивается и поэтому способен подпитывать мышцы аминокислотами длительный промежуток времени.
Соответственно, хотя каждый из источников белка имеет много преимуществ, но их комплекс будет работать лучше, сочетая в себе все их плюсы и минимизируя недостатки.
Благодаря сочетанию высококачественных источников белка Matrix® обладает одним из лучших аминокислотных профилей на рынке спортивного питания. Он способствует увеличению мышечной массы и уменьшению жировой, обладает антиоксидантным действием, улучшает состояние иммунной системы, не оказывает негативного воздействия на почки и многое др.
Так как в  состав Matrix® входят протеины с различной скоростью усвоения, его можно принимать в любое время: как после тренировки, так и перед сном.
Несмотря на высочайшее качество стоимость Matrix® 5.0 относительно невелика, благодаря использованию экономичной ламинированной упаковки, которая позволяет сохранить все качества продукта, не увеличивая его цену.

Применение Matrix® 5.0:
Разведите 1 мерную ложку продукта (32 грамма) в 200-300 мл воды, обезжиренного молока или сока по вашему вкусу. Принимайте в течение дня между приемами пищи. Общее количество порций  зависит от массы тела, интенсивности  тренировок, общего потребления белковой пищи и калорийности рациона. Общее дневное потребление белка для ведущих активный образ жизни людей,  рекомендуется от 1,5-2 грамм на 1 кг массы тела.

Matrix Nutrition — Дом лучших белков и пищевых добавок, произведенных в Великобритании

В НАЛИЧИИ

ОГРАНИЧЕННОЕ КОЛИЧЕСТВО ACT FAST

КУПИТЬ СЕЙЧАС Анаболический протеиновый порошок

Анаболический протеиновый порошок

Обычная цена

от 29 фунтов стерлингов.99

Цена продажи

от 29,99 £

Обычная цена

0,00 фунтов стерлингов

Цена за единицу

/ за

распродажа Распроданный

• Анаболический золотой протеиновый порошок

  Протеиновый порошок анаболического золота

  Обычная цена

  от 14 фунтов стерлингов.99

  Цена продажи

  от 14,99 фунтов стерлингов

  Обычная цена

  Цена за единицу

  / за

  распродажа Распроданный

• Порошок сывороточного протеина Matrix

  Сывороточный матричный протеиновый порошок

  Обычная цена

  от 12 фунтов стерлингов.99

  Цена продажи

  от 12,99 фунтов стерлингов

  Обычная цена

  Цена за единицу

  / за

  распродажа Распроданный

• Протеиновый порошок Diet Whey Matrix

  Протеиновый порошок Diet Whey Matrix

  Обычная цена

  от 12 фунтов стерлингов.99

  Цена продажи

  от 12,99 фунтов стерлингов

  Обычная цена

  0,00 фунтов стерлингов

  Цена за единицу

  / за

  распродажа Распроданный

• BCAA таблетки

  Таблетки BCAA

  Обычная цена

  от 8 фунтов стерлингов.99

  Цена продажи

  от 8,99 фунтов стерлингов

  Обычная цена

  9,99 фунтов стерлингов

  Цена за единицу

  / за

  распродажа Распроданный

---

Доставлено вовремя.Товар хорошо упакован. Получил именно то, что заказал. Без хлопот.

Надежный клиент

Очень хорошо, оперативно, быстро и просто. Я вернусь за белком.

Надежный клиент

Да, я буду покупать его снова, лучший диетический сывороточный протеин, который я пробовал.

Надежный клиент

Используйте стрелки влево / вправо для навигации по слайд-шоу или смахивайте влево / вправо при использовании мобильного устройства

Энтропийный переключатель регулирует экспозицию миристата в матричном белке ВИЧ-1

Аннотация

Миристоилированный матричный белок (myr-MA) ВИЧ функционирует как регулятор внутриклеточной локализации, направляя полипротеин-предшественник Gag на липидные рафты в плазматической мембране во время сборки вируса и отделяясь от мембраны во время инфекционности для ядерной нацеливания на прединтеграционный комплекс.Высвобождение мембраны запускается протеолитическим расщеплением Gag, и до сих пор считалось, что протеолиз вызывает конформационные изменения в myr-MA, которые секвестрируют миристильную группу. Приведенные здесь исследования ЯМР показывают, что мир-МА принимает состояния экспонированного миром [мир (е)] и -секвестрированного [мир (ы)], как и ожидалось. Неожиданно оказалось, что третичные структуры белка в обоих состояниях очень похожи, при этом секвестрированная миристильная группа занимает полость, которая требует лишь незначительных конформационных корректировок для вставки.Кроме того, воздействие миристата сочетается с тримеризацией, при этом миристильная группа секвестрируется в мономере и экспонируется в тримере ( K _assoc = 2,5 ± 0,6 × 10 ⁸ M ^–2 ). Константа равновесия смещена в ≈20 раз в сторону тримерных, подвергнутых воздействию миристата видов в Gag-подобной конструкции, которая включает в себя домен капсида, что указывает на то, что воздействие усиливается субдоменами Gag, которые способствуют самоассоциации. Наши результаты показывают, что переключение миристила ВИЧ-1 регулируется не механически индуцированными конформационными изменениями, как наблюдается для других переключателей миристила, а вместо этого путем энтропийной модуляции ранее существовавшего равновесия.

На поздней стадии цикла репликации ВИЧ несколько тысяч копий вирусного полипротеина Gag колокализуются в богатых жирными кислотами рафт-подобных участках плазматической мембраны, где они собираются и отрастают, образуя новую вирусную частицу (1). Целенаправленная сборка на этих сайтах обеспечивается N-концевой миристильной группой (myr) и консервативным основным участком на поверхности матричного домена (MA) Gag, которые действуют синергетически, способствуя прочному связыванию с мембраной (2, 3). Во время или вскоре после отпочкования Gag расщепляется вирусной протеазой, которая высвобождает зрелые белки MA, капсида (CA) и нуклеокапсида (NC), а также неструктурированные пептиды p2, p1 и p6 для созревания вируса (4).При попадании в новую клетку часть зрелых матричных белков отделяется от мембраны и включается в preintegration complex (PIC) (5), где они, по-видимому, помогают направлять ядерную локализацию PIC (6-9).

Имеются значительные доказательства того, что N-концевая миристильная группа MA играет роль в регуляции связывания с мембраной. Мутации, которые блокируют миристоилирование, приводят к аберрантному нацеливанию Gag на внутриклеточные мембраны in vivo и увеличению растворимой фракции Gag in vitro (10–14).Кроме того, сродство МА к мембранам существенно ниже, чем сродство предшественника Gag (15), а протеолиз мембраносвязанного Gag протеазой ВИЧ-1 приводит к высвобождению зрелого белка МА из мембраны (16). . Эти находки указывают на то, что протеаза ВИЧ является триггером миристильного переключателя, при котором миристат экспонируется в полипротеине Gag, чтобы способствовать связыванию с мембраной, но становится секвестрированным при протеолизе, чтобы способствовать цитозольному и ядерному нацеливанию (13, 15-18).Структурно охарактеризованы три миристильных переключателя: кальций-зависимый переключатель рецирелина (19, 20), гидролитический переключатель ARF1 GTPase (21) и аутоингибиторный переключатель тирозинкиназы c-Abl (22). Во всех случаях преобразование между состояниями, подвергающимися воздействию миристата и -секвестрированным, сопровождается значительными изменениями в структуре белка, и было высказано предположение, что переключение миристила ВИЧ-1 аналогичным образом запускается конформационными изменениями, вызванными протеолизом Gag (13, 15 –18).

Немиристоилированный матричный белок ВИЧ-1 [myr (-) — MA] является мономерным при концентрациях до 3 мМ и температуре 35 ° C (23, 24), но кристаллизуется в виде тримеров при пониженных температурах (25). Как в твердом состоянии, так и в состоянии раствора, N- и C-концевые остатки myr (-) — MA пространственно удалены, при этом дистальная спираль выступает от глобулярной части белка, а 12 C-концевых остатков находятся в неупорядоченный (23–25). Эти остатки также неупорядочены в Gag-подобной конструкции, которая включает независимо свернутый N-концевой домен капсида [myr (-) — MA – CA ^NTD ] (26).Основываясь на этих структурах, трудно понять, как N-концевая миристильная группа может быть чувствительной к расщеплению соединения MA-CA. Чтобы решить эти проблемы, мы приготовили миристоилированную форму матричного белка ВИЧ-1 (далее в документе называемую myr-MA), а также миристоилированную Gag-подобную конструкцию, которая включает капсидный домен (myr-MA –CA; остатки Myr-1 – Leu-362) для ЯМР в растворе и исследований равновесия.

Материалы и методы

Подготовка проб. N-концевая миристилтрансфераза дрожжей (yNMT) была амплифицирована из геномной ДНК дрожжей (Promega), и сайт рестрикции Nde I в гене yNMT был удален с помощью молчащей мутации (секвенирована в Лаборатории биотехнологических ресурсов WM Keck Foundation, Йельский университет). Университет, Нью-Хейвен, Коннектикут). Гены, кодирующие MA и MA – CA, были амплифицированы с помощью ПЦР из плазмиды pNL4–3 геномной кДНК ВИЧ-1 (27), и ДНК, кодирующая C-концевую метку His-6, была добавлена ​​к 3′-праймерам. Сегменты ДНК генов MA и MA – CA вставляли в вектор коэкспрессии (M.Реш, Мемориальный онкологический центр Слоуна – Кеттеринга, Нью-Йорк) и трансформировали в DH5α-компетентные клетки (Invitrogen), плазмиды экстрагировали (Qiagen, Валенсия, Калифорния) и секвенировали. Ген MA также субклонировали в вектор pET-11a (Novagen) для экспрессии myr (-) — MA. Плазмиды трансформировали в компетентные клетки с кодоном BL21 / DE3 плюс RIL (Stratagene) для экспрессии белка. К клеткам добавляли миристиновую кислоту (10 мг / л; Sigma) или U- ¹³ C-миристиновую кислоту (5 мг / л; Isotec) за 1 час до индукции изопропил-β-d-тиогалактозидом (1 мМ).Клетки лизировали (1 × Bugbuster, Novagen; затем French Press) и белки очищали с помощью кобальтовой аффинной хроматографии (Clontech). Следы немиристоилированных частиц впоследствии удаляли с помощью хроматографии гидрофобности бутил-сефарозы (Amersham Pharmacia). Образцы хранили при комнатной температуре с 1 × смесью ингибиторов протеаз Set I (Calbiochem). Молекулярные массы подтверждены масс-спектрометрией с ионизацией электрораспылением: myr (-) — MA, с C-концевой меткой His-6: Mr _calc = 15,534.4, Mr _изм. = 15 534,6 ± 0,9; myr-MA, Mr _calc = 14 921,8, Mr _изм = 14 922,20 ± 0,99; ¹⁵ N-мир-МА с C-концевой меткой His-6: Mr _calc = 15 953,6, Mr _изм = 15 953,9 ± 1,1; myr-MA – CA, Mr _calc = 41 329,1, Mr _изм = 41 329,7 ± 11.

ЯМР-спектроскопия. Данные ЯМР собирали с помощью приборов Bruker 600 МГц и 800 МГц с использованием образцов белка 30–200 мкМ, если не указано иное (35 ° C, 50 мМ фосфат натрия, pH 5.Смесь 5/100 мМ NaCl / 5 мМ DTT / 1 × ингибитор протеазы). Отнесения к остову для myr-MA были получены с помощью стандартных экспериментов с тройным резонансом (28), а отнесения боковых цепей и [ ¹ H– ¹ H] NOE (ядерные эффекты Оверхаузера) для структурных расчетов были получены из 3D ¹⁵ N -отредактированный NOE-SY – гетероядерная последовательная квантовая корреляция (HSQC), 3D ¹³ C-редактируемая гетероядерная множественная квантовая корреляция (HMQC) –NOESY и 4D ¹³ C / ¹⁵ N-редактированные спектры HMQC – NOESY – HSQC ( 29).Сигналы миристата ¹ H– ¹³ C были дифференцированы от сигналов белков путем сравнения 2D [ ¹ H– ¹³ C] спектров HMQC, полученных для конструкций, содержащих немеченый и ¹³ C-меченый миристат (рис. 5, который опубликован в качестве вспомогательной информации на веб-сайте PNAS). Миристатные сигналы были отнесены на основе химических сдвигов ¹³ C и последовательных связей, наблюдаемых в спектрах NOESY, и согласуются с предыдущими отнесениями (30).Сигналы метилена myr C ^5–11 были вырожденными, но оставшиеся сигналы корреляции ¹ H– ¹³ C разрешились. Конечная метильная группа myr-C ¹⁴ H ₃ демонстрирует необычный химический сдвиг в сильном поле (0,45 м.д.) из-за ее непосредственной близости к Trp-16 (подтверждено myr-C ¹⁴ H ₃ на Trp-ароматический протонные NOE). Данные ЯМР обрабатывали с помощью nmrpipe (31) и анализировали с помощью nmrview (32).

Расчет конструкций. Консервативные границы расстояния для [ ¹ H– ¹ H] NOE и ограничения двугранного угла позвоночника на основе ¹³ C ^α , ¹³ C ^β , ¹ H ^α , ¹³ C и ¹⁵ N химических сдвигов (33) были использованы для расчетов структуры с цианой (34), как описано (26). NOE, включающие вырожденные метилены myr-C ^5–11 , были обработаны поправкой псевдоатома 3,5 Å к центральному атому C8. Структуры оценивали с помощью procheck-ЯМР (35) и визуализировали с помощью пимола (36).Статистическая информация, связанная с расчетами конструкции, приведена в таблице 1.

Таблица 1. Структурная статистика

Аналитическое ультрацентрифугирование. Измерения седиментационного равновесия были выполнены с помощью системы Beckman XL-I Optima, оснащенной ротором Ан-60 с четырьмя отверстиями (Beckman Coulter). Ячейки были снабжены двухсекторными центральными элементами из эпона, заполненными древесным углем, с длиной пути 12 или 3 мм и кварцевыми окнами.Образцы белков готовили в 50 мМ натрий-фосфатном буфере при pH 5,5, содержащем 100 мМ NaCl и 2 мМ Трис (2-карбоксиэтил) -фосфин-HCl при загрузочных концентрациях 20–200 мкМ для myr-MA, 2,5–100 мкМ для myr. -MA – CA и 100–200 мкМ для myr (-) — MA. Скорость вращения ротора составляла от 18 000 до 40 000 об / мин для myr-MA и от 10 000 до 22 000 об / мин для myr-MA – CA, а температура составляла от 20 до 35 ° C. Сканы были получены с использованием системы абсорбционной оптики с размером шага 0,002 см и четырьмя средними значениями на точку и получены при длинах волн 295 нм [myr-MA и myr (-) — MA] или 280 нм (myr-MA – CA).Частичные удельные объемы (v-бар) и коэффициенты молярной экстинкции были рассчитаны с использованием программы sednterp (www.jphilo.mail-way.com), а плотности буфера измерены пикнометрически. Анализ данных проводился с использованием nonlin (37). Константы равновесной ассоциации были определены путем глобального анализа данных, полученных для образцов, приготовленных как минимум при четырех загрузочных концентрациях и центрифугированных как минимум при четырех скоростях ротора.

Результаты

Myr-MA существует как равновесная смесь мономерных (секвестрированных миром) и тримерных (экспонированных миром) разновидностей. Высококачественные 2D [ ¹ H– ¹⁵ N] HSQC-спектры были получены для myr-MA при концентрациях 200 мкМ или менее (рис. 5). Хотя большинство сигналов (> 80%) были нечувствительны к концентрации в используемых условиях, для двух подмножеств сигналов наблюдались зависящие от концентрации отклонения. Химические сдвиги для одной подгруппы значительно отклоняются от таковых для немиристоилированного белка (myr (-) — MA) при концентрациях <100 мкМ, но постепенно смещаются в сторону частот myr (-) - MA по мере увеличения концентрации (рис.1 А ; Δδ ¹ H> 0,2 частей на миллион или Δδ ¹⁵ N> 1,0 частей на миллион; остатки Ala-5 – Gly-11, Arg-39 и Gly-49). Вторая подгруппа демонстрирует химические сдвиги, которые соответствуют химическим сдвигам myr (-) — MA при концентрациях <100 мкМ, но постепенно расширяются и / или отклоняются (на меньшую величину) с увеличением концентрации (остатки Leu-41-Asn-47 и Gly-71 –Leu-75).

Инжир.1.

( A ) Наложение расширенных частей 2D [ ¹ H– ¹⁵ N] HSQC-спектров, полученных для myr-MA [25 мкМ (черный), 100 мкМ (синий), 400 мкМ (голубой), и 800 мкМ (зеленый)] и мир (-) — МА (500 мкМ, красный). Подмножество сигналов myr-MA значительно отличается от сигналов myr (-) — MA при низкой концентрации из-за секвестрации миристильной группы, но постепенно смещается в сторону частот myr (-) — MA по мере увеличения концентрации (обозначено стрелками ), что согласуется со сдвигом равновесия в сторону более высоких концентраций видов, подвергшихся воздействию миристата.( B ) Типичные данные седиментационного равновесия, полученные для myr-MA и myr (-) — MA при 20 ° C. Данные для myr-MA соответствуют равновесию момомер-тример с константой ассоциации ( K _assoc ) 2,5 ± 0,6 × 10 ⁸ M ^–2 (теоретическая кривая показана зеленым цветом), тогда как данные myr (-) — MA лучше всего подходят для гомогенных мономерных частиц (красный). Олигомеры myr-MA высшего порядка образуются при концентрациях> 100 мкМ при 20 ° C. При 35 ° C, где были получены оптимальные данные ЯМР, K _assoc для myr-MA сдвигается на 4.0 ± 0,8 × 10 ⁷ M ^–2 .

[ ¹ H– ¹ H] Данные NOE, полученные для myr-MA, показывают, что отклонения химического сдвига, наблюдаемые при низких концентрациях (150–200 мкМ, 35 ° C), вызваны взаимодействиями между миристильной группой и белком (см. ниже). Постепенное смещение этих сигналов в сторону значений немиристоилированного белка по мере увеличения концентрации указывает на сдвиг равновесия в сторону мультимерных, подвергшихся воздействию миристата видов.Измерения седиментационного равновесия (SE) подтверждают самоассоциацию myr-MA, а количественный анализ показывает, что белок тримеризуется с константами ассоциации ( K _assoc ) 2,5 ± 0,6 × 10 ⁸ M ^–2 и 4,0 ± 0,8 × 10 ⁷ M ^–2 при 20 ° C и 35 ° C соответственно (рис. 1 B ). Таким образом, объединенные данные ЯМР и SE показывают, что мир-МА существует как равновесие момомер-тример, при этом миристат изолирован [myr (s)] в мономере и экспонируется [myr (e)] в тримере.

Структура Myr-MA в мономерном, Myr (s) состоянии. Суперпозиция структур 20 млн-МА, полученных из данных ЯМР, собранных при концентрациях 150–200 мкМ и 35 ° C, показана на рис. 2 A . Для сравнения также показаны репрезентативные рентгеновские лучи и структуры ЯМР немиристоилированного белка. Атомы основной цепи Val-7 – Ile-104 хорошо определены (среднеквадратичное отклонение 0,45 ± 0,09 Å относительно средних положений атомов) и находятся в хорошем соответствии с координатами немиристоилированного белка [0.48 ± 0,10-Å и 0,96 ± 0,07-Å среднеквадратичное отклонение относительно ЯМР- и рентгеновской структур myr (-) — MA соответственно]. Миристильная группа принимает расширенную конформацию и проникает на ≈10 Å под поверхность белка (рис. 2 B ). Концевая метильная группа (C ¹⁴ H ₃ ) упаковывается в непосредственной близости от боковых цепей остатков ядра Trp-16, Ile-34 и Leu-85, а другие миристатные метиленовые группы взаимодействуют с боковыми цепями Ala- 5, Ser-6, Val-7, Ile-34, Ser-38, Pro-48, Val-35, Leu-51 и Glu-52 (рис.2 С ). Примечательно, что ≈40% миристильной группы остается подверженной действию растворителя в изолированной форме белка (рис. 2 B ), что может объяснить зависящее от концентрации соединение олигомеризации белка с воздействием миристата. Это контрастирует с изолированной формой реэкенина, в которой миристильная группа полностью скрыта под поверхностью белка, и воздействие сопровождается серьезными внутренними конформационными изменениями, вызванными связыванием кальция (20).

Рис. 2.

( A ) Стерео вид 20 наложенных структур ЯМР, определенных для мир (ы) -МА (атомы основной цепи Gly-2 – Ala-120 синим цветом и атомы углерода мир 1 красным). Для сравнения также показаны характерные структуры ЯМР (пурпурный) и рентгеновских лучей (зеленый) мир (-) — МА. ( B ) Изображение полупрозрачной поверхности мир (ы) -МА, показывающее частичное проникновение миристильной группы (красные сферы).( C ) Рисунок на ленте мир (ы) -МА, показывающий боковые цепи (зеленые), которые демонстрируют [ ¹ H– ¹ H] NOE с миристильной группой (красный). Оранжевый сегмент полностью неупорядочен в myr (-) — MA, а синий сегмент претерпевает незначительную конформационную корректировку (отраженную изменениями химического сдвига) при введении миристильной группы.

Данные

NOE, полученные в равновесных условиях, могут быть осложнены вкладом второстепенных видов.Во всех полученных спектрах наблюдались NOE для миристата, но не было обнаружено никаких новых внутрибелковых NOE, которые могли бы указывать на измененную конформацию белка. Кроме того, относительные интенсивности NOE и схемы кросс-пиков, которые были присвоены в данных 2D NOESY с низкой концентрацией (30 мкМ), совпадали с данными, полученными при более высоких концентрациях (100–200 мкМ). Таким образом, если тример вносит вклад в NOE, приписываемые мономеру, его структура не должна существенно отличаться от структуры мономера.Единственные спектральные различия, которые можно однозначно отнести к структурным нарушениям в основной цепи белка, касались [ ¹ H– ¹⁵ N] ЯМР химических сдвигов Ser-9 – Gly-11. Эти остатки удалены из сайта связывания миристата, но чувствительны к положению равновесия myr (s) / myr (e) (рис. 1 A ). [ ¹ H– ¹⁵ N] Данные релаксации ЯМР, полученные для мир (ы) -МА (не показаны), показывают, что Val-7, Ser-9 и Asp-14 участвуют в химическом обмене.Кроме того, двугранные углы Gly-10 и Gly-11 существенно различаются среди шести моделей рентгеновской структуры myr (-) — MA, а Val-7 – Lys-15 демонстрируют относительно высокие тепловые параметры (25). . Таким образом, структурные изменения, подразумеваемые данными химического сдвига, затрагивают только несколько остатков, расположенных около N-конца белка, которые имеют внутреннюю конформационную подвижность выше средней. Интересно, что эти остатки, по-видимому, являются критическими детерминантами равновесия myr (s) / myr (e), поскольку мутации этих или близлежащих остатков могут резко ингибировать связывание с мембраной, предположительно из-за усиленной секвестрации миристильной группы (17, 38).

Модель тримерного [Myr (e) -MA] ₃ видов. Структура тримерной формы myr-MA не может быть определена с атомным разрешением из-за тенденции белка к преципитации в течение нескольких часов при концентрациях> 400 мкМ. Однако изменения химического сдвига, зависящие от концентрации, согласуются с интерфейсом тримеров, аналогичным наблюдаемым в кристаллических структурах белков myr (-) — MA как ВИЧ-1, так и вируса иммунодефицита обезьян (SIV) (25, 39).В частности, подмножество сигналов myr-MA, которые соответствуют сигналам myr (-) — MA при низких концентрациях, но отклоняются с увеличением концентрации, соответствуют остаткам на границе раздела тримера кристаллической структуры myr (-) — MA или рядом с ним. Тот факт, что мир (-) — МА не образует тримеры в растворе при 20–35 ° C (рис. 1 B и исх. 23 и 24) указывает на то, что сборке способствуют в основном межмолекулярные взаимодействия myr-myr. Исследования по моделированию показывают, что такие взаимодействия могут быть легко приспособлены к тримерам без искажения третичной структуры или нарушения межмолекулярных контактов, наблюдаемых в кристаллической структуре мир (-) — МА (рис.3).

Рис 3.

Представление равновесия мир (s) -MA [myr (e) -MA] ₃ , показывающее экспериментально определенную структуру ЯМР мир (s) -MA и предлагаемую модель [myr (e) -MA] ₃ тример. Модель была создана путем наложения трех идентичных копий репрезентативной ЯМР-структуры myr-MA [созданной с использованием только ограничений myr (-) — MA ЯМР] на координаты рентгеновской структуры тримерного myr (-) — MA.Модель согласуется с изменениями химического сдвига ЯМР, наблюдаемыми для myr-MA при концентрациях белка, которые способствуют самоассоциации. Остатки лизина, которые важны для эффективной репликации вируса (67) и предположительно взаимодействуют с поверхностью мембраны (25), показаны синим цветом. Межмолекулярные взаимодействия мир-мир могут нарушаться при связывании с мембранами.

Капсидный домен усиливает воздействие миристата, способствуя самосборке. Чтобы получить представление о механизме, с помощью которого протеолиз Gag модулирует переключение миристила, мы подготовили Gag-подобную конструкцию, которая содержит домены myr-MA и CA (myr-MA-CA, остатки myr-1-Leu-362) . Домен CA расположен непосредственно на С-конце по отношению к домену myr-MA предшественника Gag и содержит С-концевой субдомен, который необходим для олигомеризации капсида и Gag (40–44) и для сборки вириона (45–49). Как наблюдается для myr-MA, данные седиментационного равновесия, полученные для myr-MA-CA, согласуются с равновесием мономер / тример (2.5–10 мкМ, 20 ° C) (рис. 4 A ). Примечательно, что константа равновесия ассоциации, измеренная для myr-MA – CA (4.6 ± 1.1 × 10 ⁹ M ^–2 ), почти в 20 раз больше, чем определенная для myr-MA. Таким образом, концентрации, при которых 50% белка является мономерным, составляют 73 мкМ для myr-MA и 14 мкМ для myr-MA-CA при 20 ° C.

Инжир.4.

( A ) Данные седиментационного равновесия, полученные для myr-MA – CA (3,3 мкМ, 20 ° C), и теоретическая кривая наилучшего соответствия (голубая) для равновесия мономер – тример ( K _assoc = 4,6 ± 1,1 × 10 ⁹ M ^–2 ). ( B ) Части 2D [ ¹ H– ¹⁵ N] HSQC спектров, полученных для myr-MA – CA (50 мкМ; розовые пунктирные линии), myr (-) — MA (500 мкМ, красный), и концентрационно-зависимые спектры, полученные для myr-MA (см. рис.1 подпись для определения цвета). Данные, полученные для myr-MA – CA, соответствуют тенденциям, наблюдаемым для myr-MA. ( C ) Схематическое изображение равновесия мономер-тример и мир (s) -мир (e) (мир, МА и СА показаны черными линиями и зелеными и красными сферами, соответственно). Домен CA способствует самоассоциации и тем самым смещает равновесие в сторону состояния myr (e). ( D ) Ожидается, что другие домены Gag (желтые сферы, p2; синие сферы, NC), которые способствуют сборке и связыванию с мембраной, также смещают равновесие в сторону состояния myr (e).Протеолитическое расщепление соединения MA-CA во время ранней фазы репликации устраняет эти эффекты, позволяя равновесию смещаться в сторону состояния myr (s).

Сигналы ЯМР

, наблюдаемые для домена myr-MA в myr-MA-CA, следуют тенденциям, наблюдаемым для изолированного белка myr-MA, и указывают на большее воздействие группы myr при более низких концентрациях белка по сравнению с myr-MA (рис. 4 ). B ). Кроме того, химические сдвиги ¹ H и ¹⁵ N и интенсивности сигналов для гибких остатков, которые соединяют глобулярные части доменов myr-MA и CA myr-MA-CA, соответствуют тем, которые наблюдались ранее для немиристоилированного MA-CA Конструкция С-концевого домена (26).Таким образом, индуцированное КА смещение равновесия в сторону тримера не связано с изменениями внутри- или межмолекулярных взаимодействий МА-КА, а является результатом синергетического эффекта, связанного с ковалентным связыванием двух умеренно самоассоциирующихся доменов (рис. 4). С ). Это в некотором смысле аналогично синергическому эффекту основного пластыря и myr-группы МА (и других миристоилированных белков) на связывание с мембраной (3). Ни один из элементов не связывает мембраны с достаточным сродством, чтобы служить функциональным якорем мембраны, но существенное связывание происходит, когда присутствуют обе группы (3).

Обсуждение

Предыдущие исследования мутагенеза выявили связь между связыванием мембран и самоассоциацией Gag (50). Мутации как в C-концевом домене CA, так и в доменах p2, которые ингибируют сборку Gag, нарушают связывание с мембраной (51-53), а последовательное увеличение C-концевых усечений Gag приводит к прогрессивному снижению мультимеризации Gag и сродства к мембране (54). Эти данные теперь можно объяснить с точки зрения наблюдаемой связи сборки Gag с воздействием миристата.Таким образом, взаимодействия субдоменов, которые способствуют сборке Gag, энтропийно сдвигают равновесие myr (s) / myr (e) в сторону состояния myr (e). Недавние исследования мутогенеза показывают, что домен NC также играет роль в обеспечении связывания Gag с мембранами (55-57). NC представляет собой базовый домен, который не самостоятельно самоассоциируется, но способствует сборке Gag путем совместного связывания с матрицами нуклеиновых кислот (58–61). РНК-промотированная сборка Gag, следовательно, также вероятно смещает равновесие myr (s) / myr (e) в сторону состояния, подверженного воздействию myr, тем самым повышая сродство Gag к мембранам.

Сочетание самоассоциации МА с воздействием миристата позволяет по крайней мере три биологически релевантных механизма модуляции миристильного переключателя ВИЧ-1: ( i ) изменения локальной концентрации белка (например, концентрация myr-MA высокая в вирионов, ≈14 мМ, но становится разбавленным при проникновении вируса, ссылка 62), ( ii ) связывание факторов с доменами Gag, которые способствуют взаимодействиям Gag-Gag (например, связывание РНК с доменом NC) и ( iii ) протеолитическое удаление доменов Gag, которые либо прямо (CA, p2), либо опосредованно (связывание NC с РНК) способствуют взаимодействиям Gag-Gag.Настоящие результаты предполагают, что высвобождение мембраны во время вирусной инфекционности регулируется последним механизмом, в котором синергические межмолекулярные взаимодействия между субдоменами Gag устраняются при протеолизе. Хотя ожидается, что высокая концентрация myr-MA в зрелых вирионах (≈14 мМ) (62) будет способствовать самоассоциации белка и связыванию с мембраной, равновесие смещается в сторону мономерных, myr (s) -MA видов в среде разбавления. инфицированной клетки, позволяя myr-MA диссоциировать от мембраны.Ожидается, что во время поздней фазы цикла репликации связывание домена NC с вирусным геномом будет способствовать сборке Gag и воздействию миристата, облегчая сборку вирусных частиц, содержащих нуклеиновую кислоту (рис. 4 D ). ).

Myr-MA домен Gag также содержит CRM1-зависимый сигнал ядерного экспорта (NES), и есть доказательства того, что Gag временно обращается к ядру во время поздней фазы цикла репликации (9). Функция NES может заключаться в простом противодействии сигналу ядерной локализации (NLS), поскольку накопление Gag в ядре может быть вредным для сборки вируса (9, 63).Однако Gag также может играть прямую роль в экспорте вирусного генома (63, 64). Мутации в myr-MA-домене Gag ВИЧ-1, которые блокируют NES, приводят к аберрантному накоплению как Gag, так и вирусного генома в ядре и к продукции РНК-дефицитных вирионов (9). Аналогичные результаты были недавно получены для вируса саркомы Рауса (RSV) (63, 65). Кроме того, мутации в МА RSV, которые блокируют ядерную локализацию Gag, приводят к образованию частиц, дефицитных по геномной РНК (63, 65).Белки Gag вируса лейкемии мышей также временно получают доступ к ядру и могут участвовать в ядерном экспорте вирусного генома (64). Был предложен механизм, согласующийся с этими наблюдениями, в котором NLS MA первоначально нацеливает Gag на ядро ​​для связывания генома, а затем NES направляет комплекс Gag – РНК в цитозоль, где дополнительные молекулы Gag собираются на РНК и нацелены на комплекс. к плазматической мембране (63). Хотя эта гипотеза остается спорной (65), наши результаты совместимы.Таким образом, после трансляции в цитозоле, вероятно, сосуществует равновесное распределение мономерных и мультимерных видов Gag. Популяция мономерного, секвестрированного миром Gag, вероятно, отображает NLS, направляя его транспорт к ядру. Совместная сборка Gag на вирусной РНК может затем способствовать экспозиции миристата, направляя миристоилированный полипротеин Gag ВИЧ-1 (myr-Gag) -RNA комплекс из ядра и на мембрану для дальнейшей сборки. В связи с этим мутации в myr-MA ВИЧ-1, которые приводят к аберрантному накоплению myr-Gag в ядре, находятся в сайтах, которые могут легко повлиять на равновесие myr (s) / myr (e).Действительно, мутации в соседних сайтах, как было показано, снижают сродство myr-Gag к мембранам, и это объясняется усилением секвестрации миристатной группы (17, 38).

Итак, мы показали, что переключатель миристила ВИЧ-1 связан со сборкой белка и регулируется не за счет основных конформационных изменений, а вместо этого за счет энтропийной модуляции ранее существовавшего равновесия. Регулируемое связывание с мембраной теперь объясняется синергическими межмолекулярными взаимодействиями между субдоменами Gag, которые кооперативно способствуют сборке, тем самым смещая равновесие в сторону состояния, подверженного воздействию myr.Последующий протеолиз Gag устраняет эти кооперативные эффекты, позволяя зрелому домену myr-MA диссоциировать и изолировать группу myr. Наши результаты объясняют чувствительность связывания мембраны к мутациям в доменах CA, p2 и NC Gag, обеспечивают механистическую основу связывания генома как триггера воздействия миристата и локализации на мембране, а также предполагают потенциальную роль переключателя миристила в модуляции Деятельность NES / NLS. Структурная информация должна способствовать усилиям по разработке терапевтических стратегий, нацеленных на миристильный сигнал ВИЧ-1 (66).

Благодарности

Мы благодарим М. Реша (Мемориальный онкологический центр Слоуна – Кеттеринга, Нью-Йорк) за вектор коэкспрессии и Д. Кинга (Калифорнийский университет, Беркли) за измерения масс-спектрометрии. Мы с благодарностью выражаем признательность за поддержку со стороны Национальных институтов здравоохранения (грант AI30917 для M.F.S.). Средства на покупку ультрацентрифуги были предоставлены Национальным институтом здравоохранения, грант S10-RR15899 (Д.Б.). E.L., P.L. и I.K. являются стипендиатами Университета Мэриленда при президенте округа Балтимор, Мейерхофф, и Медицинского института Говарда Хьюза / доступа меньшинств к исследовательской карьере / студентов бакалавриата Мейерхофф, соответственно.

Сноски

• ↵ ‡ Кому должна быть адресована корреспонденция. Электронная почта: summers {at} hhmi.umbc.edu.

• Этот документ был отправлен напрямую (Трек II) в офис PNAS.

• Сокращения: CA, капсидный белок; HSQC, гетероядерная одноквантовая когерентность; МА, матричный белок; мир-МА, миристоилированная МА ВИЧ-1; мир (-), немиристоилированный; myr (s), состояние секвестрирования миристата; myr (e), состояние экспонированного миристата; NC, нуклеокапсидный белок; NOE, ядерный эффект Оверхаузера; NES, ядерный экспортный сигнал; NLS, сигнал ядерной локализации.

• Размещение данных: Распределение химического сдвига ЯМР для myr-MA депонировано в BioMagResBank, http: // bmrb.wisc.edu (инвентарный номер 5960). Координаты для 20 конформеров миристоилированного матричного белка были депонированы в Protein Data Bank, www.rcsb.org (код PDB ID 1UPH).

• См. Комментарий на стр. 417.

  Abstract

  Для эффективной репликации вирусы разработали механизмы, позволяющие уклоняться от врожденных иммунных ответов, включая систему противовирусного интерферона I типа (IFN-I).Вирус Нипах (NiV), высокопатогенный член семейства Paramyxoviridae (род , Henipavirus ), как известно, кодирует четыре вирусных белка, полученных из гена P (P / C / W / V) с функциями антагониста IFN-I. . Здесь мы сообщаем, что матричный белок NiV (NiV-M), который важен для сборки и образования почки вируса, также может ингибировать ответы IFN-I. Продукция IFN-I требует активации множества сигнальных компонентов, включая киназу IκB эпсилон (IKKε). Ранее мы показали, что E3-убиквитинлигаза TRIM6 катализирует синтез неякоренных цепей полиубиквитина, связанных с K48, которые не связаны ковалентно с каким-либо белком, и активирует IKKε для индукции опосредованных IFN-I противовирусных ответов.Используя анализы коиммунопреципитации и конфокальную микроскопию, мы показываем здесь, что белок NiV-M взаимодействует с TRIM6 и способствует деградации TRIM6. Следовательно, экспрессия NiV-M приводит к снижению уровней неякоренных цепей полиубиквитина, связанных с K48, связанных с IKKε, что приводит к нарушению олигомеризации IKKε, аутофосфорилированию IKKε и снижению опосредованных IFN ответов. Эта функция антагониста IFN у NiV-M требует наличия консервативного остатка лизина (K258) в сигнале двудольной ядерной локализации, который обнаруживается в дивергентных вирусах генипавируса.В соответствии с этим матричные белки вирусов Ганы, Хендры и Кедра также были способны ингибировать индукцию IFNβ. Живая инфекция NiV, но не рекомбинантный NiV, лишенный белка М, снижает уровни экспрессии эндогенного белка TRIM6. Насколько нам известно, матричные белки парамиксовирусов никогда не участвовали в антагонизме врожденного иммунитета. Мы сообщаем здесь о новом механизме уклонения вирусного врожденного иммунитета путем нацеливания на TRIM6, IKKε и незакрепленные цепи полиубиквитина. Эти результаты расширяют спектр стратегий вирусного антагонизма IFN и представляют собой новую потенциальную цель для разработки терапевтических вмешательств против NiV-инфекций.

  Сведения об авторе

  Вирус Нипах (NiV) — зоонозный парамиксовирус, вызывающий тяжелые респираторные и энцефалитические заболевания с летальностью от 40 до 90%. Система интерферона типа I хозяина (IFN-I) защищает от вирусных инфекций; однако, чтобы установить продуктивную инфекцию, NiV разработал механизмы, позволяющие избежать этих противовирусных реакций хозяина. Важным компонентом системы IFN является киназа IKKε, которая непосредственно участвует в продукции IFN-I и передаче сигналов IFN-I. Активность киназы IKKε регулируется неякоренными цепями полиубиквитина, связанными с K48, новой формой убиквитина, которая не связана ковалентно с каким-либо белком и может индуцировать активацию киназ, способствуя олигомеризации белка.Эти незакрепленные цепи полиубиквитина, которые активируют IKKε, генерируются E3-убиквитинлигазой TRIM6. Здесь мы демонстрируем, что матричный структурный белок (M) NiV, который важен для сборки и образования почки вируса, также выполняет функции антагониста IFN-I и препятствует противовирусному ответу хозяина. Мы обнаружили, что NiV-M взаимодействует с TRIM6 и способствует его деградации. Следовательно, ассоциация незакрепленных цепей полиубиквитина с IKKε снижается, что приводит к нарушенной активации IKKε и неэффективным ответам IFN.Поскольку матричный белок присутствует в вирионах и высвобождается сразу после проникновения вируса в клетку, это обеспечивает эффективный механизм для избежания противовирусного ответа хозяина. Эти данные могут помочь объяснить высокопатогенный потенциал этих вирусов.

  Образец цитирования: Bharaj P, Wang YE, Dawes BE, Yun TE, Park A, Yen B, et al. (2016) Матричный белок вируса Нипах нацелен на E3-убиквитинлигазу TRIM6, чтобы ингибировать опосредованный IKKε-киназой антивирусный ответ IFN типа I.PLoS Pathog 12 (9): e1005880. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005880

  Редактор: Шон П.Дж. Уилан, Гарвардская медицинская школа, США

  Поступила: 18 апреля 2016 г .; Одобрена: 18 августа 2016 г .; Опубликован: 13 сентября 2016 г.

  Авторские права: © 2016 Bharaj et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

  Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в документе и его файлах с вспомогательной информацией.

  Финансирование: Эта работа была поддержана грантами Национального института аллергии и инфекционных заболеваний (NIAID) через Западный региональный центр передового опыта в области биозащиты и новых исследований инфекционных заболеваний при ANF (U54 AI057156). Для BL, R21AI115226, AI125536 и субпроектный грант от U54 AI065359, а также AI102267 для BL и ANF. К CFB, U19 AI109945.RR финансируется Институтом инфекций и иммунитета человека (IHII) и Медицинским отделением Техасского университета (UTMB). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

  Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

  Введение

  Врожденные иммунные ответы инициируются, когда консервативные свойства микробных патогенов, называемые патоген-ассоциированными молекулярными паттернами (PAMP), распознаются рецепторами распознавания паттернов хозяина (PRR), такими как Toll-подобные рецепторы (TLR) и ретиноевая кислота. -индуцибельные рецепторы (RLR), подобные гену I (RIG-I) [1, 2].Во время вирусных инфекций одно- или двухцепочечные РНК, генерируемые вирусами, могут распознаваться эндосомным TLR3 или цитоплазматическим геном 5, ассоциированным с дифференцировкой RIG-I / меланомой (MDA-5) [3, 4]. При активации TLR3 передает сигнал через адаптерный белок Toll-IL-1R (TIR), содержащий домен, индуцирующий адаптер IFNβ (TRIF). С другой стороны, RIG-I и MDA-5 используют адаптерный белок MAVS, локализованный в митохондриальной мембране. Передача сигналов TLR и RLR требует активации множества компонентов передачи сигналов, сходящихся на уровне серин / треониновых киназ TANK-связывающей киназы-1 (TBK1) и IκB-киназы-ε (IKKε) [5, 6], которые фосфорилируют факторы транскрипции, регулирующий фактор IFN. 3 (IRF3) и IRF7 [7, 8].Это способствует накоплению в ядре IRF3 и IRF7, запуская экспрессию IFN типа I (IFN-I) [3, 4, 6]. Распознавание патогенов TLR и RLR также приводит к активации ядерного фактора, энхансера легкой цепи каппа активированных В-клеток (NF-κB), который способствует индукции различных хемокинов и цитокинов, включая интерлейкин-6 (IL-6) и фактор некроза опухоли (TNFα) [9, 10]. NF-κB также важен для оптимального производства IFN-I [5–8]. Секретируемый IFN-I связывается с гетеродимерным рецептором IFN типа I (IFNAR), таким образом активируя киназы (Janus kinase) JAK1 и TYK2, которые фосфорилируют факторы транскрипции STAT1 (преобразователь сигнала и активатор транскрипции) и STAT2.Вместе STAT1 и STAT2 с IRF9 образуют фактор 3 стимулированного IFN гена (ISGF3), который перемещается в ядро ​​для индукции многочисленных генов, стимулированных IFN (ISG), вызывая антивирусное состояние [11]. Важно отметить, что образование комплекса ISGF3 и индукция полной ширины ISGs также требует фосфорилирования STAT1 с помощью IKKε, который играет неизбыточную роль в пути передачи сигналов IFN [12–14].

  Семейство белков Tripartite Motif (TRIM) состоит из более 70 белков, которые характеризуются наличием RING, B-бокса и домена спиральной спирали (вместе называемого RBCC), вовлечены в сигнальные пути врожденного иммунитета, действуя в виде лигаз E3-убиквитина [15–19].Недавно мы показали, что беспрецедентно большое количество TRIM положительно регулирует врожденные иммунные ответы [19, 20]. Углубленная молекулярная характеристика, сфокусированная на TRIM6, который, как мы показали, важен как для продукции IFN-I, так и для сигнальных путей IFN-I. В частности, TRIM6 вместе с E2-конъюгазой UbE2K синтезируют неякоренные цепи полиубиквитина, связанные с K48, которые активируют IKKε, достигая высшей точки в индукции подмножества ISG, необходимых для противовирусного ответа [13].

  Для успешной репликации в клетке-хозяине вирусы разработали механизмы, позволяющие уклоняться от ответа хозяина IFN путем ингибирования ключевых компонентов пути, ведущего либо к снижению продукции IFN, либо к снижению индукции ISG.Некоторые члены семейства Paramyxoviridae обладают механизмом редактирования РНК для продуцирования альтернативных белков из гена P, а именно V и W, которые, как было показано, обладают антагонистической активностью в отношении IFN [21]. Например, белки рубулавируса V нацелены на STAT для протеасом-опосредованной деградации [22, 23]; V-белки генипавирусов секвестрируют STAT1 и препятствуют их активации [24, 25]; а белок V вируса кори блокирует IFN-индуцированную ядерную транслокацию STAT1 / 2 по неизвестному механизму [26].

  Вирус Нипах (NiV) — это недавно появившийся высокопатогенный зоонозный парамиксовирус, вызывающий смертельные заболевания у людей [27, 28]. Было продемонстрировано, что белки NiV P, V и W блокируют передачу сигналов IFN-I и связывают STAT1 [24, 29]. Белок W NiV ингибирует IFN-ответ хозяина, секвестрируя STAT1 в ядре [30–32] и блокируя вирус и TLR3-зависимую индукцию ISG и TBK1 / IKKε-опосредованную активацию IRF3 [33]. Однако, хотя известно, что NiV ингибирует ответы на IFN во время инфекции, исследования показали, что мутации в NiV-P или его генных продуктах не могут устранить ингибирование активации STAT, а рекомбинантные вирусы, несущие эти мутации, не ослабляются в компетентных клетках IFN [34–37]. ].Следовательно, дополнительные белки NiV также могут быть способны ингибировать опосредованную RIG-I продукцию IFN.

  Здесь мы показываем, что матричный белок NiV (NiV-M) играет роль в антагонизме IFN и что консервативный остаток лизина (K258) в сигнале двусторонней ядерной локализации (NLS) NiV-M важен для этой активности. Интересно, что этот остаток участвует в регулируемом убиквитином нуклео-цитоплазматическом перемещении NiV-M на ранних стадиях инфекции Ni-V [38]. Мутация консервативного лизина либо в аланин (K258A), либо в аргинин вызывала дефекты ядерного импорта или экспорта соответственно; оба мутанта обладали пониженным уровнем убиквитинирования и дефектами почкования [38, 39].Мы показываем, что K258 необходим для NiV-M для противодействия ответам, опосредованным IFN-I, поскольку мутант K258A не смог ингибировать продукцию IFN-I и индукцию ISG через нарушение активации IKKε. Механически это достигается с помощью NiV-M-индуцированной деградации как эндогенного, так и сверхэкспрессированного TRIM6, который, как мы ранее сообщали, участвует в активации IKKε через эндогенные K48-связанные неякоренные цепи полиубиквитина [13].

  Результаты

  Матричный белок вируса Нипах ингибирует индукцию IFNβ на уровне киназ TBK1 / IKKε

  Вирус Nipah кодирует четыре вирусных белка (P, C, V, W) с функциями антагониста IFN при использовании в исследованиях сверхэкспрессии [34, 40].Хотя теперь ясно, что NiV способен подавлять ответы IFN во время вирусной инфекции, рекомбинантный NiV с мутациями в генах P, C, V или W не имеет значительного ослабления в IFN-компетентных клетках [34–37], что позволяет предположить, что NiV кодирует для дополнительных вирусных белков, способных противодействовать системе IFN. Было показано, что матричный белок NiV, который необходим для образования почки и сборки вируса, проходит через различные клеточные компартменты, прежде чем попасть на клеточную мембрану для сборки вируса [38, 39], что ставит вопрос о том, может ли он иметь неструктурную структуру. функции.Мы предположили, что NiV-M является вирусным продуктом с новыми функциями антагониста врожденного иммунитета. Чтобы проверить эту гипотезу, была исследована способность NiV-M ингибировать различные компоненты пути IFN типа I (рис. 1A). Экзогенная экспрессия NiV-M снижала индуцированную вирусом Сендай (SeV) активацию промотора IFNβ в репортерном анализе (рис. 1B). Напротив, белок NiV-V, который, как известно, ингибирует передачу сигналов IFN, но не продукцию IFN, не влияет на индукцию IFNβ (рис. 1B). В соответствии с этими результатами и ролью IFNβ в индукции противовирусных ответов, уровни репликации РНК SeV были увеличены в M-экспрессирующих клетках (S1 фиг.).NiV-M также блокировал индукцию IFNβ, опосредованную TRIF и MAVS (рис. 1C и 1D), хотя и с разной эффективностью. TRIF и MAVS действуют как адаптерные белки для путей TLR3 и RIG-I соответственно (см. Диаграмму на рис. 1A). Поскольку MAVS и TRIF-зависимые сигнальные пути сходятся ниже по течению на уровне киназ TBK1 / IKKε, эти результаты предполагают, что NiV-M может нацеливаться на общие сигнальные факторы ниже этих адаптерных белков. В соответствии с этой гипотезой, NiV-M также ингибировал TBK-1- и IKKε-зависимую индукцию IFN дозозависимым образом (рис. 1E и 1F).Напротив, NiV-M не ингибировал IRF3-индуцированную активацию репортера IFNβ (рис. 1G), что позволяет предположить, что NiV-M блокирует индукцию IFN, действуя на уровне киназ TBK-1 / IKKε.

  Рис. 1. Матричный белок вируса Нипах ингибирует индукцию IFNβ на уровне киназ TBK1 / IKKε.

  A) Схема исследуемых сигнальных путей. (BG) Клетки HEK293T трансфицировали репортерной плазмидой люциферазы под контролем промотора IFNβ и контрольной плазмидой Renilla, в присутствии или в отсутствие NiV-M и стимулировали SeV (B) или трансфицировали стимулирующими плазмидами TRIF (C ), MAVS (D), TBK-1 (E), IKKε (F) или IRF3 (G) с последующим анализом люциферазы.Данные сначала нормализовали по не стимулированному образцу для получения кратной индукции, а затем стимулированные образцы устанавливали на 100%, чтобы получить процент кратной индукции. Данные взяты из трех независимых экспериментов; каждое в трех экземплярах, и изображено среднее значение ± стандартное отклонение (n = 9). * р <0,05; ** р <0,01; *** p <0,001, **** p <0,0001, по критерию Стьюдента. Иммуноблоты с использованием лизатов трансфицированных образцов показаны в качестве контролей.

  https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005880.g001

  Для дальнейшей проверки этих результатов и обеспечения биологической функции NiV-M в соответствующих первичных клетках врожденного иммунитета были проведены эксперименты на первичных дендритных клетках, полученных из моноцитов человека (hMDDC), которые являются мишенями для инфекции NiV [41]. С этой целью лентивирусы, кодирующие белок NiV-M и хорошо охарактеризованный белок-антагонист IFN VP35 из вируса Эбола [42, 43], были созданы, как описано ранее [42, 44], и исследована их способность ингибировать ответы IFN.Моноциты здоровых доноров культивировали с GMCSF и IL-4 в течение 5 дней с последующей лентивирусной трансдукцией [42, 44]. Эффективность лентивирусной трансдукции контролировали с помощью проточной цитометрии (рис. 2А). Затем hMDDC заражали штаммом SeV Cantell, который активирует путь RIG-I за счет известной им продукции вирусно-дефектных интерферирующих частиц (DI), что приводит к индукции IFNβ и провоспалительных цитокинов. Экспрессия мРНК IFNβ достигла пика через 4 часа после инфицирования (p.i.) и индуцировалась примерно в 600 раз (фиг. 2B, левая панель).Клетки, экспрессирующие NiV-M, сильно ингибировали индукцию IFNβ по сравнению с пустым лентивирусным контрольным вектором (фиг. 2B, верхняя левая панель), тогда как репликация SeV РНК была увеличена (фиг. 2B, нижняя левая панель). В соответствии с ранее описанной ролью VP35 в функции RIG-I [45], индукция провоспалительных цитокинов TNFα и IL-12p40 снижалась в клетках, экспрессирующих VP35. Напротив, экспрессия NiV-M оказывала лишь незначительное влияние на уровни экспрессии TNFα и IL-12p40 по сравнению с контрольным лентивирусным вектором (фиг. 2B, верхняя и нижняя правые панели).Поскольку эти провоспалительные цитокины требуют активации фактора транскрипции NF-kB, и эти сигнальные пути расходятся ниже MAVS / TRIF (см. Диаграмму на рис. 1A), эти результаты согласуются с нашими репортерными анализами и подтверждают роль NiV-M ниже по течению. адаптерных белков и по направлению к сигнальной оси TBK-1 / IKKε. Кроме того, в соответствии со сниженной индукцией IFNβ в клетках, экспрессирующих NiV-M, индукция IFN-стимулированных генов ISG54 и MxA также была ослаблена по сравнению с контрольными клетками (фиг. 2C).

  Рис. 2. Белок NiV-M ингибирует IFNβ, но не провоспалительные цитокины TNFα и IL-12p40 в первичных MDDC человека.

  A) MDDC человека были либо ложно трансдуцированы, трансдуцированы только Vpx-VLP, либо котрансдуцированы лентивирусными (LV) векторами, экспрессирующими NiV-M или VP35 и Vpx-VLP вируса Эбола. hMDDC собирали на 5 день после трансдукции для анализа GFP с помощью проточной цитометрии. B) hMDDC, которые затем стимулировали SeV, и общую РНК выделяли и анализировали с помощью qRT-PCR для количественного определения уровней IFNβ, SeV NP РНК, TNFα и IL-12p40 или C) ISG54 и MxA.RPS11 использовали в качестве гена домашнего хозяйства, и уровни мРНК показаны в виде кратной индукции в образцах, обработанных имитацией. Планки погрешностей указывают стандартные отклонения. Образцы были собраны у трех независимых доноров. * р <0,05; ** р <0,01; *** p <0,001, **** p <0,0001, по критерию Стьюдента.

  https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005880.g002

  Взятые вместе эти данные показывают, что NiV-M специфически действует как мощный антагонист IFNβ и противовирусных реакций, но не играет значительной роли в ингибировании про — воспалительные цитокины в клеточных линиях и соответствующих клетках первичного врожденного иммунитета.

  Матричный белок NiV ингибирует активацию IKKε

  NiV-M перемещается к клеточной мембране, где он необходим для сборки вируса и отпочкования во время репликации вируса [38]. Однако белок NiV-M перемещается из цитоплазмы в ядро, прежде чем достигнет клеточной мембраны. Для транслокации в ядро ​​требуется консервативный остаток лизина (K258) в сигнале двусторонней ядерной локализации (NLSbp) белка NiV-M, а мутант лизина в аланин (K258A) приводит к удержанию NiV-M в немембранной цитоплазматической области. фракция [38].Чтобы лучше понять механизм, с помощью которого NiV-M ингибирует активность IKKε, мы проверили, обладает ли мутант NiV-M-K258A способностью ингибировать индукцию IFN. IKKε-опосредованная индукция IFN ослаблялась примерно на 50% в присутствии низких концентраций NiV-M-WT. Напротив, NiV-M-K258A не ингибировал индукцию IFN в этих условиях (фиг. 3A). Хотя высокие концентрации M-K258A незначительно ингибировали индукцию IFN, эти эффекты значительно ослаблены по сравнению с NiV-M-WT (рис. 3A).Подобные эффекты наблюдались, когда клетки были активированы TBK-1; однако TBK-1 оказался более чувствительным к ингибирующим эффектам M по сравнению с IKKε, и более высокие концентрации M-K258A были способны ингибировать индукцию IFN (фиг. 3B).

  Рис. 3. Лизин K258A на матричном белке NiV важен для ингибирования неякоренных цепей полиубиквитина, связанных с K48, которые связаны с IKKε и необходимы для активации IKKε.

  (A-B) NiV-M требует нацеливания на мембрану для ингибирования опосредованной IKKε / TBK-1 индукции IFNβ.Клетки HEK293T трансфицировали репортером люциферазы IFNβ в присутствии возрастающих концентраций NiV-M WT или мутанта K258A и стимулирующей плазмиды IKKε (A) или TBK-1 и слитых белков, нацеленных на мембрану M-K258A (S10-K258A или S15 -K258A) (В). C) NiV-M-WT ингибирует ассоциацию неякоренных цепей полиубиквитина, связанных с K48, с IKKε, что приводит к снижению фосфорилирования IKKε-T501 и снижению фосфорилирования IRF3. Клетки HEK293T трансфицировали мутантом NiV-M или NiV-M-K258A в присутствии или в отсутствие Flag-IKKε.Клетки собирали, и экстракты целых клеток (WCE) использовали для иммунопреципитации IKKε с использованием анти-Flag гранул. Показан представитель по крайней мере 3 независимых экспериментов. Обратите внимание, что блот WCE для K48-связанного убиквитина представляет уровни общего клеточного пула K48-связанного убиквитина (ковалентно убиквитинированные белки и незакрепленные), которые не изменяются в присутствии NiV-M. Только связанный с K48 убиквитин, который специфически связывается с IKKε, восстанавливается в присутствии NiV-M (показано на панели IP).D) Схема активации IKKε незафиксированными цепями полиубиквитина, связанными с K48, как описано [13]. E) NiV-M-WT, но не K258A, ингибирует олигомеризацию IKKε. Клетки HEK293T трансфицировали Flag-IKKε и Myc-IKKε в присутствии NiV-M, NiV-M-K258A или пустого векторного контроля. Олигомеризацию IKKε оценивали по способности IKKε взаимодействовать с самим собой путем иммунопреципитации. IKKε иммунопреципитировали из WCE с помощью гранул анти-Flag с последующим иммуноблоттингом с антителом Myc. Показаны представители как минимум 2 независимых экспериментов.* р <0,05; ** р <0,01; *** p <0,001, **** p <0,0001, по критерию Стьюдента.

  https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005880.g003

  Поскольку мутант NiV-M K258A сохраняется во фракции немембранной цитоплазмы [38], возможно, что он утратил функцию антагониста IFN. происходит из-за неспособности достичь компартментов цитоплазмы / мембраны, где локализуются компоненты передачи сигналов IFN-I (например, MAVS локализуется на митохондриальной мембране; [46]). Чтобы проверить эту возможность, мы использовали два разных слитых белка M-K258A, которые содержат нацеленные на мембрану сигналы (L10-K258A и S15-K258A) и, как было ранее показано, спасают транспортировку M-K258A в цитоплазматические мембранные фракции [38].Поразительно, что эктопическая экспрессия либо L10-K258A, либо S15-K258A спасла от потери ингибиторных эффектов NiV-M-K258A на вызванную TBK-1 экспрессию IFNβ, особенно при низких дозах экспрессирующих M векторов (фиг. 3B). Следует отметить, что все белки NiV-M экспрессировались на сходных уровнях, и на уровни TBK-1 не влияло присутствие NiV-M-WT или мутантных белков M (рис. 3B, нижняя панель). Эти результаты предполагают, что NiV-M требует доставки в цитоплазматические / мембранные фракции для антагонизма ответов IFN-I.

  Оказалось, что NiV-M-K258A оказывает более сильное ингибирующее действие на TBK-1 по сравнению с IKKε (сравните NiV-M-WT с NiV-M-K258A на фиг. 3A и 3B). Следовательно, мутант K258A представляет собой лучший инструмент для изучения механизма, с помощью которого NiV-M ингибирует индукцию IFN, опосредованную IKKε. Кроме того, мы недавно выяснили подробный молекулярный механизм, с помощью которого активируется IKKε [13]. Поэтому мы сосредоточили наше исследование на киназе IKKε.

  Мы показали, что NiV-M ингибирует IKKε, но не IRF3-опосредованную индукцию IFN (рис. 1F и 1G), предполагая, что M нацелен на киназу IKKε.В подтверждение этого исследования коиммунопреципитации (coIP) продемонстрировали, что как NiV-M-WT, так и мутант K258A эффективно взаимодействуют с IKKε при коэкспрессии в клетках HEK293T (рис. 3C). Хотя NiV-M не нарушал связывание IKKε с IRF3, IKKε-опосредованное фосфорилирование IRF3 снижалось в присутствии WT-NiV-M, тогда как в присутствии NiV-M-K258A наблюдались лишь незначительные эффекты (рис. 3C, pIRF3 row), предполагая, что NiV-M-WT ингибирует активность IKKε и что для этого эффекта необходим остаток K258.В соответствии с этим, аутофосфорилирование IKKε на T501 (маркер активации IKKε) было снижено в присутствии NiV-M-WT по сравнению с NiV-M-K258A или контролем с пустым вектором (Фиг.3C, количественная оценка показана на S2 Фиг.) .

  Мы недавно сообщили, что активность IKKε регулируется неякоренными цепями полиубиквитина, связанными с K48, которые не связаны ковалентно ни с одним белком [13]. Эти полиубиквитиновые цепи взаимодействуют с IKKε и способствуют его олигомеризации и аутофосфорилированию на IKKε-T501 (см. Диаграмму на рис. 3D; [13]).NiV-M-WT уменьшал ассоциацию IKKε с K48-связанными незакрепленными цепями полиубиквитина в большей степени, чем M-K258A (рис. 3C и 3E). В соответствии с этими результатами, олигомеризация IKKε также снижалась в присутствии NiV-M-WT по сравнению с пустым вектором или мутантом NiV-M-K258A (фиг. 3E). Важно отметить, что экспрессия NiV-M не снижает общий клеточный пул K48-связанных цепей полиубиквитина, которые включают ковалентно убиквитиновые белки и незащищенные полиубиквитиновые цепи (см. Рис. 3C, панель K48-связанный убиквитин, WCE).Вместе эти результаты показывают, что NiV-M-WT блокирует активацию IKKε путем подавления его специфической ассоциации с незащищенными цепями полиубиквитина, связанными с K48, что, в свою очередь, ингибирует нижестоящую олигомеризацию IKKε и фосфорилирование IRF3.

  Чтобы проверить, обладают ли другие белки матрикса вируса генипавируса также функциями антагониста IFN, мы исследовали способность белков матрикса вируса Хендра (HeV), вируса Ганы (GhV) и вируса кедра (CedV) ингибировать индукцию IFNβ в наших репортерных анализах. способность связывать IKKε в анализах coIP.GhV — это новый вирус генипавируса африканских летучих мышей, который отличается от NiV и HeV (~ 60% идентичности последовательностей в гене M по сравнению с ~ 90% идентичности между NiV-M и HeV-M) [47, 48]. CedV, который является самым последним представителем рода , Henipavirus , как сообщается, не является патогенным для хорьков и морских свинок и имеет пониженную способность ингибировать передачу сигналов IFN, предположительно из-за отсутствия продуктов его гена P [49, 50] . HeV-M, GhV-M и CedV-M значительно ингибировали IKKε-индуцированную активацию промотора IFN (фиг. 4A).Кроме того, матричные белки этих трех генипавирусов также взаимодействовали с IKKε (фиг. 4B). Эти результаты демонстрируют, что матричные белки генипавирусов обладают функциями антагониста IFN. Сохранение NLSbp в белках матрикса генипавируса предполагает, что область NLS потенциально важна для этой функции (Рис. 4C) [38].

  Рис. 4. Матричные белки из хенипавирусов с консервативным лизином K258A взаимодействуют с IKKε и ингибируют IKKε-опосредованную индукцию IFNβ.

  A) Матричные белки из генипавирусов ингибируют IKKε-опосредованную индукцию IFNβ.Клетки HEK293T трансфицировали репортером люциферазы IFNβ и контрольной плазмидой Renilla в присутствии или в отсутствие NiV-M, HeV-M, GhV-M или CedV-M и IKKε с последующим анализом люциферазы. Данные были нормализованы по не стимулированному образцу для получения кратной индукции. Изображено среднее значение ± стандартное отклонение (n = 3). Б) Матричные белки генипавирусов взаимодействуют с IKKε. Клетки HEK293T трансфицировали Flag-NiV-M, Flag-HeV-M, Flag-GhV-M или Flag-CedV-M в присутствии или в отсутствие Myc-IKKε. Клетки собирали и экстракты целых клеток (WCE) использовали для иммунопреципитации M с использованием анти-Flag гранул.C) Выравнивание белковой последовательности области, отображаемой в соответствии с сигналом ядерной локализации (NLS) вируса Нипах (NiV), вируса Хендра (HeV), вируса Ганы (GhV) и вируса кедра (CedV). * р <0,05; ** р <0,01; *** p <0,001, **** p <0,0001, по критерию Стьюдента.

  https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005880.g004

  Матричный белок NiV взаимодействует с E3-убиквитинлигазой TRIM6 и ингибирует TRIM6-опосредованные ответы IFN

  Мы показали, что экспрессия NiV-M приводит к пониженным уровням незакрепленных K48-связанных цепей полиубиквитина, которые специфически связываются с IKKε (рис. 3C).Этот эффект может быть вызван либо вмешательством связывания IKKε с незакрепленными цепями полиубиквитина, либо ингибированием фермента, который синтезирует эти цепи полиубиквитина.

  Мы недавно продемонстрировали, что TRIM6, член семейства белков TRIM E3-ubiquitin ligase, катализирует синтез незафиксированных K48-связанных цепей полиубиквитина, которые специфически связываются с IKKε, способствуя его олигомеризации и активации для передачи сигналов ниже по течению [13]. Мы предположили, что NiV-M блокирует активацию IKKε, ингибируя TRIM6-опосредованный синтез незакрепленных цепей полиубиквитина.С этой целью мы сначала проверили, взаимодействует ли NiV-M с TRIM6 в анализах coIP. В соответствии с нашей гипотезой, NiV-M эффективно взаимодействовал с TRIM6 (рис. 5A). Чтобы картировать область связывания TRIM6 с NiV-M, мы использовали делеционные мутанты TRIM6, экспрессирующие N-концевые RING (R), B-боксы и спиральные (CC) домены или C-концевой домен SPRY (диаграмма на рис. 5B). ) и проверил взаимодействие с NiV-M. C-концевой домен SPRY TRIM6 специфически взаимодействовал с NiV-M-WT, тогда как мутант, лишенный только домена SPRY, потерял способность взаимодействовать с NiV-M (рис. 5C), что указывает на то, что для этого взаимодействия требуется C-концевой домен SPRY. из TRIM6.Поскольку IKKε также взаимодействует с SPRY доменом TRIM6 [13], мы спросили, конкурирует ли NiV-M с IKKε за связывание TRIM6. В соответствии с этой возможностью, исследования CoIP показали, что взаимодействие между TRIM6 и IKKε снижается в присутствии как NiV-M-WT, так и NiV-M-K258A (S3 Фиг.), Предполагая, что ингибирование активности IKKε можно частично объяснить. за счет вмешательства в связывание TRIM6-IKKε посредством NiV-M, и что это вмешательство не зависит от аминокислоты NiV-M K258.

  Рис 5.NiV-M взаимодействует с TRIM6 и ингибирует опосредованную TRIM6 индукцию и передачу сигналов IFNβ.

  A) NiV-M взаимодействует с TRIM6. Клетки HEK293T трансфицировали NiV-M, пустым вектором или HA-TRIM6. Клетки собирали, и экстракты целых клеток (WCE) использовали для иммунопреципитации TRIM6 с использованием анти-НА-гранул. (B-C) C-концевой домен SPRY TRIM6 взаимодействует с NiV-M. B) Мутанты с делецией TRIM6, используемые для coIP (GST-tagged). C) Клетки HEK293T трансфицировали мутантами с делецией GST-TRIM6, указанными вместе с NiV-M.Клетки собирали и WCE использовали для иммунопреципитации TRIM6 с использованием гранул GST. D) NiV-M совместно с TRIM6 локализуется в цитоплазматических тельцах. Клетки HeLa трансфицировали HA-TRIM6 и NiV-M-WT или мутантами NiV-M K258A или K258R. Клетки фиксировали и окрашивали указанными антителами с последующей конфокальной микроскопией. Профили колокализации показаны справа. E) NiV-M ингибирует IFNβ, индуцированный RIG-I, воздействуя на TRIM6. HEK293T трансфицировали не нацеливающей siRNA контролем (siControl) или siRNA, нацеленной на aTRIM6 (siTRIM6).Через 24 часа клетки трансфецировали репортером люциферазы IFNβ и контрольной плазмидой Renilla в присутствии или в отсутствие NiV-M или восстановлением HA-TRIM6 с последующим анализом люциферазы. Данные были нормализованы по не стимулированному образцу для получения кратной индукции. Изображено среднее значение ± стандартное отклонение (n = 3). (F-G) NiV-M ингибирует TRIM6-опосредованную IFNβ-индуцированную ISG54, но не репортерную активность ISG15. Клетки HEK293T трансфицировали репортером люциферазы ISG54-ISRE (F) или репортером люциферазы ISG15 (G) и контрольной плазмидой Renilla и HA-TRIM6 в присутствии возрастающих концентраций NiV-M-WT или NiV-MK258A с последующим анализом люциферазы. .Данные были нормализованы по не стимулированному образцу для получения кратной индукции. Изображено среднее значение ± стандартное отклонение (n = 3). Показаны представители как минимум 2 независимых экспериментов. * р <0,05; ** р <0,01; *** p <0,001, **** p <0,0001, по критерию Стьюдента.

  https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005880.g005

  Чтобы дополнительно подтвердить связывание TRIM6 с NiV-M, мы провели исследования совместной локализации с помощью конфокальной микроскопии (рис. 5D). Как сообщалось ранее [13, 51], TRIM6 локализуется в точечных цитоплазматических телах.Напротив, NiV-M-WT показал мембранную локализацию, а также некоторую ядерную и цитоплазматическую локализацию (рис. 5D), как показано ранее [38]. Однако после коэкспрессии NiV-M и TRIM6 часть NiV-M колокализуется с TRIM6 в цитоплазматических тельцах. Мутант NiV-M K258A, который не перемещается в ядро, также, по-видимому, колокализуется с TRIM6 (рис. 5D). Важно отметить, что мутация K258R на NiV-M, которая перемещается в ядро, но не выходит из ядра [38], не колокализуется с TRIM6 (Рис. 5D).Важно отметить, что клетки, коэкспрессирующие NiV-M-WT и TRIM6, по-видимому, имеют более низкие уровни TRIM6 и во многих случаях было трудно наблюдать характерную точечную локализацию TRIM6 (Рис. 5D, см. Следующий раздел для более подробной информации).

  Чтобы проверить, имеет ли связывание NiV-M с TRIM6 функциональную значимость, мы исследовали способность NiV-M ингибировать активацию промотора IFNβ конститутивно активным доменом 2CARD RIG-I [RIG-I (2CARD)] [3, 4] в ячейках для нокдауна TRIM6. Как и ожидалось, NiV-M ингибировал индуцированную RIG-I (2CARD) активацию промотора IFNβ в контрольных клетках siRNA без нацеливания (фиг. 5E).Клетки миРНК, нацеленные на TRIM6, показали заметно сниженную активность промотора IFNβ после трансфекции RIG-I (2CARD) по сравнению с контрольными клетками, как мы ранее сообщали [13]; однако наблюдалась незначительная, но все же определяемая индукция IFNβ стимуляцией RIG-I (2CARD). На эту остаточную индукцию IFNβ не оказывала значительного влияния экзогенная экспрессия NiV-M (фиг. 5E). Восстановление TRIM6 спасало индуцированную RIG-I (2CARD) репортерную активность IFNβ в клетках с нокдауном TRIM6, и эта индукция почти полностью блокировалась в присутствии NiV-M (рис. 5E), демонстрируя, что M ингибирует индукцию IFN с помощью TRIM6-зависимого механизм.

  В дополнение к своей роли в фосфорилировании IRF3, киназа IKKε, как было показано, играет неизбыточную роль в сигнальном пути IFN типа I и необходима для экспрессии подмножества IKKε-зависимых ISG [14]. Как мы ранее сообщали [13], эктопическая экспрессия TRIM6 усиливает IFNβ-индуцированную репортерную активность ISG54 (ISG54 является IKKε-зависимым ISG) (рис. 5F). В поддержку роли NiV-M в ингибировании оси TRIM6-IKKε в сигнальном пути IFN, NiV-M-WT, но не M-K258A, был способен ингибировать TRIM6-опосредованную IFNβ-индуцированную репортерную активность ISG54 в дозе -зависимым образом (рис. 5F).Важно отметить, что уровни белка TRIM6 также снижались с помощью NiV-M-WT дозозависимым образом, тогда как уровни белка TRIM6 были меньше затронуты в присутствии NiV-M-K258A (рис. 5F, иммуноблот). Эти результаты предполагают, что NiV-M ингибирует ответы IFN за счет снижения экспрессии белка TRIM6. NiV-M не оказывал общего эффекта на ингибирование сигнального пути IFN, потому что, в отличие от эффектов, наблюдаемых на репортере ISG54, NiV-M не ингибировал IFNβ-индуцированную репортерную активность ISG15, поскольку ISG15 не является IKKε- зависимый ISG (рис. 5G, а также [13, 14].Белок NiV-V, который, как известно, нацелен на STAT1 для антагонизма передачи сигналов IFN [24, 25], снижал репортерную активность ISG15 и использовался в качестве положительного контроля для этого эксперимента (рис. 5G).

  Взятые вместе эти данные показывают, что NiV-M действует как антагонист как продукции IFN, так и сигнальных путей IFN, воздействуя на E3-убиквитинлигазу TRIM6 и, следовательно, блокируя активацию IKKε.

  NiV-M нацеливается на TRIM6 на деградацию

  Наши результаты показывают, что TRIM6 и NiV-M взаимодействуют в анализах coIP и совместно локализуются в цитоплазматических тельцах (Fig. 5A – 5D).При выполнении этих экспериментов мы заметили снижение уровней белка TRIM6 в присутствии NiV-M-WT (см. Рис. 5A, 5D и 5F), что позволяет предположить, что TRIM6 может быть мишенью для деградации. Доказательства включали очень небольшое количество клеток, в которых TRIM6 и NiV-M-WT были обнаружены вместе в исследованиях совместной локализации. В редком случае, когда NiV-M-WT и TRIM6 были обнаружены в одной и той же клетке, уровни TRIM6 оказывались ниже и не проявляли его характерной точечной локализации по сравнению с точками TRIM6, наблюдаемыми при экспрессии отдельно (рис. 5D).Эффект NiV-M на уровни экспрессии TRIM6 был подтвержден в биохимических анализах, в которых экспрессия NiV-M-WT явно снижала уровни эктопически экспрессируемого TRIM6 дозозависимым образом. Этот эффект на уровни TRIM6 был значительно ослаблен в присутствии мутанта NiV-M-K258A (см. Иммуноблот на фиг. 5F и интенсивность точек TRIM6 в 5D, M-K258A).

  Чтобы исключить возможные артефакты сверхэкспрессии TRIM6, уровни эндогенного TRIM6 определяли количественно в присутствии NiV-M-WT или NiV-M-K258A.В соответствии с нашими наблюдениями, уровни эндогенного белка TRIM6 также были снижены в клетках, экспрессирующих NiV-M-WT, тогда как мутант K258A не влиял на уровни белка TRIM6 (рис. 6A). Сходные результаты наблюдались в анализах coIP, и ингибирование протеасом с помощью MG132 не приводило к восстановлению белка TRIM6 (фиг. 6B), предполагая, что NiV-M способствует деградации TRIM6 по протеасомно-независимому механизму.

  Рис. 6. NiV-M нацеливается на TRIM6 на деградацию.

  A) Клетки HEK293T трансфицировали возрастающими концентрациями NiV-M WT или мутанта K258A, и уровни эндогенного TRIM6 определяли с помощью иммуноблоттинга (репрезентативно для 3 экспериментов).Для количественной оценки уровни TRIM6 были нормализованы по актину, которые были определены с помощью программного обеспечения ImageJ. Данные представляют собой комбинацию 3 независимых экспериментов. * р <0,05; ** р <0,01; *** p <0,001, **** p <0,0001, по критерию Стьюдента. B) Клетки HEK293T трансфицировали NiV-M-WT или NiV-M-K258A, пустым вектором и HA-TRIM6. Через 24 часа после трансфекции клетки обрабатывали ДМСО или ингибитором протеасом MG132 в течение 4 часов. Клетки собирали, и экстракты целых клеток (WCE) использовали для иммунопреципитации TRIM6 с использованием анти-НА-гранул.

  https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005880.g006

  Чтобы подтвердить эти наблюдения в контексте инфицирования живым вирусом Нипах, мы создали рекомбинантный NiV (rNiV), лишенный белка M (rNiV-ΔM), и сравнили уровни эндогенного TRIM6 при инфекциях rNiV-WT и rNiV-ΔM. Чтобы облегчить обнаружение инфицированных клеток с помощью иммунофлуоресценции, как WT, так и ΔM rNiV были сконструированы для экспрессии GFP. Поскольку белок М необходим для образования почки и сборки вируса, rNiV-ΔM первоначально был спасен в клетках HEK293, стабильно экспрессирующих белок М в транс- [38, 39].Однако rNiV-ΔM может быть пассирован на клетках Vero в отсутствие экзогенного M, хотя и с гораздо более замедленной кинетикой репликации по сравнению с WT rNiV-GFP (S4A рис.), Что согласуется с недавним исследованием [52]. В лизатах инфицированных rNiV-WT как нуклеокапсид, так и М-белки можно было обнаружить уже через 24 ч репликация вируса была очевидна по присутствию белка нуклеокапсида (S4B фиг.).Эти результаты также подтверждают, что наш вирус rNiV-ΔM действительно М-дефицитный.

  Затем мы сравнили эффекты этих rNiV на экспрессию эндогенного TRIM6. В соответствии с ролью М в деградации TRIM6, клетки, инфицированные rNiV-WT (клетки GFP +, фиг. 7A), экспрессировали более низкие уровни белка TRIM6 по сравнению с неинфицированными клетками (клетки GFP-, фиг. 7A). Напротив, клетки, инфицированные rNiV-ΔM, показали аналогичные уровни экспрессии белка TRIM6 по сравнению с неинфицированными клетками (фиг. 7A). Кроме того, количество и интенсивность цитоплазматических точек TRIM6 также, по-видимому, уменьшились по сравнению с неинфицированными клетками, в то время как не наблюдалось значительных различий в инфицированных rNiV-ΔM и неинфицированных клетках (фиг. 7B).В соответствии с этими результатами, экспрессия TRIM6 и образование точек были исключены в областях с высокими уровнями матриксного белка в клетках, инфицированных rNiV-WT (фиг. 7C). Эти данные демонстрируют, что NiV-M снижает уровень белка TRIM6 во время вирусной инфекции.

  Рис. 7. NiV-M нацелен на деградацию TRIM6 во время заражения NiV.

  A) Клетки HeLa были инфицированы NiV-WT или NiV, лишенными матричного белка (NiV-ΔM), экспрессирующего GFP, при MOI 0,1. Сорок восемь часов в день. клетки фиксировали и окрашивали антителом TRIM6 с последующей вторичной антикроличьей-555 (красный) и иммунофлуоресценцией.Профили интенсивности флуоресценции показаны справа. Средняя интенсивность флуоресценции (MFI) была определена количественно из трех разных изображений с использованием ImageJ, и графики показаны ниже. Значения TRIM6 MFI были получены из отдельных клеток GFP + или GFP-. Для этой количественной оценки отдельные клетки были отобраны с помощью инструмента выделения от руки в программе ImageJ, следуя границам каждой отдельной клетки, после окрашивания TRIM6. Для количественной оценки в программе ImageJ было отобрано более 50 клеток. Б) Конфокальная микроскопия эндогенного TRIM6 (красные точки) в клетках, инфицированных NiV-M-WT и NiV-ΔM.NiV-M-WT, клетки GFP +, имеют пониженные уровни TRIM6 (MFI) и количество точек TRIM6 по сравнению с неинфицированными GFP-клетками (количественная оценка справа). Клетки, инфицированные NiV-M-ΔM GFP +, не обнаруживают значительных различий в уровнях TRIM6 (MFI) или количестве точек TRIM6 по сравнению с неинфицированными GFP-клетками. Показан график поверхности, полученный с помощью ImageJ на основе пикселей конфокальных изображений. C) Образцы, инфицированные NiV-M, окрашивали антителом против M (красный) и антителом против TRIM6 (для представления TRIM6 показан зеленым).Область высокой и низкой экспрессии M была выбрана вручную с помощью инструмента от руки в ImageJ. Область высокой экспрессии М коррелирует с очень низким окрашиванием TRIM6, а также с отсутствием видимых точек TRIM6. Точки TRIM6 отчетливо видны в клеточных областях с низкой экспрессией М или без нее. Для количественной оценки значения интенсивности флуоресценции TRIM6 в областях с низким и высоким M, нормализованные по уровням MFI M. * p <0,05; ** р <0,01; *** p <0,001, **** p <0,0001, по критерию Стьюдента.

  https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005880.g007

  В совокупности наши данные показывают, что матричный белок NiV ингибирует ответы IFN, воздействуя на E3-убиквитинлигазу TRIM6 во время инфекции или эктопической экспрессии в клеточных линиях и первичных клетки врожденного иммунитета. Снижение экспрессии TRIM6 коррелирует с уменьшением неякоренных цепей полиубиквитина, которые специфически связываются с IKKε и, как было ранее показано, необходимы для активации IKKε, что в конечном итоге приводит к нарушению индукции IFN-опосредованных противовирусных ответов (фиг. 8).

  Рис. 8. Предлагаемая модель ингибирования NiV-M ответов IFN.

  A) При распознавании вируса в клетках, инфицированных вирусом Nipah, в которых отсутствует матричный белок, передача сигналов PRR способствует синтезу незакрепленных K48-связанных полиубиквитиновых цепей с помощью E3-убиквитинлигазы TRIM6. Эти полиубиквитиновые цепи взаимодействуют с IKKε и вызывают его олигомеризацию и аутофосфорилирование T501. Следовательно, активированный IKKε фосфорилирует IRF3, что приводит к индукции IFNβ и возникновению противовирусного ответа.Передача сигналов IFNβ через его рецептор также может приводить к активации TRIM6 и IKKε для индукции ISG. B) Присутствие NiV-M-WT способствует деградации TRIM6, что приводит к снижению синтеза связанных с K48 незакрепленных цепей полиубиквитина, снижению олигомеризации IKKε, аутофосфорилированию IKKε-T501 и снижению фосфорилирования IRF3 с нарушением противовирусных ответов.

  https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005880.g008

  Обсуждение

  В этом исследовании мы демонстрируем, что матричный белок NiV ингибирует противовирусную систему IFN, нацеливаясь на E3-убиквитинлигазу TRIM6, которая необходима для синтеза незакрепленных полиубиквитиновых цепей, которые активируют киназу IKKε для продукции IFN.Наши результаты показывают, что белок NiV-M играет роль в контексте репликации вируса и в первичных клетках врожденного иммунитета. Это подтверждается тремя линиями доказательств: i) лентивирусы, экспрессирующие NiV-M, сильно ингибируют SeV-индуцированную индукцию IFNβ, но не провоспалительные цитокины в hMDDC, ii) инфекции, вызванные WT NiV, снижают экспрессию белка TRIM6 и образование TRIM6-цитоплазматических клеток. тельцов, iii) инфекции рекомбинантным NiV, лишенным белка М, восстанавливают уровни белка TRIM6.

  Мы показали, что мутация K258A NiV-M, которая нарушена в цитоплазматическом ядерном перемещении ([38] и фиг. 5D), имеет пониженную способность ингибировать ответы IFN-I.Напротив, мутанты L10-K258A-M и S15-K258A-M, которые восстанавливают перенос к фракциям цитоплазматической мембраны [38], восстановили способность противодействовать ответам IFN-I (рис. 3B). Поскольку NiV-M-K258A все еще может взаимодействовать с TRIM6 в исследованиях coIP и колокализации и может конкурировать с IKKε за связывание TRIM6, наши данные предполагают, что сниженная способность M-K258A ингибировать IFN-I происходит из-за неправильной локализации клеток, в результате в случае неспособности нацелить TRIM6 на деградацию. Скорее всего, аминокислота K258 на NiV-M не требуется для взаимодействия с TRIM6, а вместо этого требуется для нацеливания белка M на цитоплазматический компартмент, где собирается «сигнаносома» TRIM6-IKKε, и NiV-M может задействовать другие необходимые факторы. для деградации TRIM6.Ранее мы показали, что TRIM6 рекрутирует IKKε в «богатые убиквитином» тельца в цитоплазме и что незакрепленный полиубиквитин важен для образования этих структур [13]. Хотя эти богатые TRIM6-ubiquitin структуры не были хорошо охарактеризованы, маловероятно, что они содержат мембранные структуры. Некоторые исследования TRIM5α, близкого родственника TRIM6, предполагают, что некоторые из этих цитоплазматических телец могут содержать компоненты агресомной системы [53, 54]. Альтернативная возможность состоит в том, что убиквитинирование NiV-M на аминокислоте K258, которое, как было показано, важно для транспортировки M [38], также может быть ответственно за рекрутирование др. Факторов, участвующих в деградации TRIM6.Эти возможности в настоящее время исследуются.

  Наши результаты показывают, что NiV-M нацелен на деградацию TRIM6. Однако мы до сих пор не смогли выяснить точный путь, участвующий в деградации TRIM6. Эксперименты с использованием ингибитора протеасом MG132 [55] и ингибитора лизосом хлорохина [56], по-видимому, не помогли восстановить эндогенные уровни белка TRIM6 в присутствии NiV-M (Рис. 6B и S8 Рис.), Что позволяет предположить, что NiV-M нацелен на TRIM6 для деградация по механизму, независимому от протеасом и лизосом.В настоящее время мы исследуем потенциальные пути деградации TRIM6 с использованием других ингибиторов, которые потенциально могут восстанавливать ответы IFN, блокируя деградацию TRIM6. В случае успеха ингибиторы, которые спасают экспрессию TRIM6 и ответы IFN, могут иметь потенциальное клиническое применение в качестве противовирусных средств против инфекций NiV.

  Важно отметить, что NiV-M не только нарушает TRIM6-опосредованную индукцию IFN при стимуляции пути RIG-I в первичных DC человека и в клеточных линиях, но также нарушает передачу сигналов IFNβ. Эти результаты согласуются с множеством ролей, описанных для IKKε и TRIM6 как в индукции IFN, так и в сигнальных путях [8, 13, 14].

  Наши данные показывают, что NiV-M может ингибировать IFN, индуцированный как TBK-1, так и IKKε, при эктопической экспрессии. Однако в наших предыдущих исследованиях мы не обнаружили взаимодействия TRIM6 с TBK-1 или эффектов на активацию TBK-1 в клетках с нокдауном TRIM6, предполагая, что механизмы, с помощью которых NiV-M ингибирует TBK-1 и IKKε, различны. Одна из возможностей заключается в том, что NiV-M способен ингибировать другие белки TRIM, ответственные за активацию TBK-1.

  Генипавирусы — это зоонозные патогены, которые были обнаружены у азиатских плодовых летучих мышей из рода Pteropus, но не вызывают явного заболевания.Сообщалось также, что генипавирусы ингибируют врожденные иммунные пути у летучих мышей, чтобы вызвать инфекции в их естественном резервуаре [35]. Интересно, что TRIM6 консервативен у всех видов млекопитающих, включая летучих мышей рода Pteropus (S5 Fig). Человеческий TRIM6 имеет относительно высокую гомологию с TRIM6 летучей мыши (80-84% аминокислотной идентичности, S6 Fig). Важно отметить, что остатки цистеина и гистидина в домене RING, которые важны для активности TRIM6 E3-ubiquitin ligase, сохраняются у разных видов, что позволяет предположить, что TRIM6 активен у летучих мышей.С-концевой домен SPRY человеческого TRIM6, который отвечает за М-взаимодействие, также имеет 80-84% гомологии. Хотя трудно предсказать, способен ли NiV-M по-прежнему взаимодействовать и ингибировать TRIM6-опосредованные противовирусные ответы у летучих мышей, есть соблазн предположить, что М-белки генипавирусов также могут быть способны противодействовать ответам IFN у летучих мышей, особенно потому, что другие факторы пути RIG-I и, в частности, TBK1 и IKKε (97% и 80% идентичности соответственно), также относительно консервативны у видов летучих мышей (S7 фиг.).Следовательно, TRIM6 и сигналосома IKKε могут иметь большое значение для противовирусных реакций в естественном резервуаре генипавирусов.

  Матричный белок — это структурный вирусный белок, выполняющий функции сборки и образования почки вируса. Наши результаты имеют важное значение для эффективности репликации NiV. Тот факт, что матричный белок содержится в вирионе и высвобождается сразу после проникновения вируса, дает вирусу инструмент для борьбы с антивирусным ответом хозяина на ранней стадии репликации вируса и до активации ответа IFN, что дает вирусу преимущество.Можно разработать фармакологические подходы для нацеливания на взаимодействия NiV-M с TRIM6 или использования ингибиторов для блокирования деградации TRIM6, вызванной M.

  .

  Таким образом, здесь мы сообщаем о дополнительном белке парамиксовируса с функцией антагониста IFN. Матричный белок вируса Nipah ингибирует как индукцию IFN, так и сигнальные пути IFN, способствуя деградации E3-убиквитинлигазы TRIM6, которая синтезирует незакрепленные полиубиквитиновые цепи, необходимые для активации IKKε и индукции эффективного противовирусного ответа (рис. 8).Это первый пример структурного белка генипавирусов с функциями антагониста IFN.

  Материалы и методы

  Клетки и вирусы

  Клетки

  HEK-293T, HeLa, A549, Vero E6 (CRL1586) и Vero (CCL-81) были приобретены из Американской коллекции типовых культур (ATCC). Все клетки поддерживали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глутамина и 1% пенициллин-стрептомицина (Gibco-BRL). Вирус Сендай (SeV; штамм Cantell) был получен от Charles River Laboratories и размножен в 10-дневных свободных от патогенов куриных яйцах (Charles River Laboratories; North Franklin, CT).Для инфицирования клетки 293T инкубировали с SeV в течение 2 часов при 37 ° C, а затем среду заменяли на полную среду для выращивания. Штамм вируса Nipah (NiV) Malaysia (любезно предоставленный отделением специальных патогенов, CDC, Атланта) размножали в клетках VeroE6. Титр исходного вируса определяли с помощью анализа бляшек в клетках Vero-CCL81. Для инфицирования конфлюэнтные монослои клеток 293T (засеянные в 24-луночные планшеты) инфицировали NiV (MOI от 0,01 до 1,0) в течение 1 часа при 37 ° C, а затем свежей средой, содержащей 2% FBS, 100 Ед / мл пенициллина и Добавляли 100 мкг / мл стрептомицина.Клетки собирали через 24 часа в сутки. в 100 мкл PBS, лизировали в 6x SDS-PAGE буфере Лэммли и инкубировали в течение 15 мин при 95 ° C. Вся работа с живым вирусом проводилась в условиях уровня биобезопасности 4 (BSL4) в лаборатории Robert E. Shope BSL4, UTMB.

  Плазмиды и реактивы

  Конструкции экспрессии NiV-M, NiV-K258A, K258R, 3XFlag-tagged NiV-M и мутантный K258A были описаны ранее [38]. Конструкцию экспрессии NiV-V получали с помощью ПЦР-амплификации открытой рамки считывания (ORF) NiV-V и вставки в pcDNA3.1 (+) вектор с N-концевым тегом HA. Экспрессионные конструкции TRIF, MAVS, TBK-1 и IKKε, а также репортеры pIFNβ_fLuc, ISRE_fLuc были любезно предоставлены доктором Genhong Cheng и описаны ранее. Конструкция экспрессии IRF3 была предоставлена ​​доктором Рен Саном. Репортерные плазмиды, экспрессирующие люциферазу светлячков под контролем ISG54-ISRE и промотора IFNβ, были описаны ранее [4, 57] и были щедрым подарком от доктора Гарсиа-Састре (Mount Sinai, NY). RIG-I с меткой FLAG (2CARD) был описан ранее [58].Репортерная плазмида, несущая ген люциферазы Renilla (REN-Luc / pRL-TK), была приобретена у Promega. Плазмида HA-TRIM6 любезно предоставлена ​​Андреа Баллабио [51]. Все последовательности были подтверждены анализом секвенирования (Genewiz, NJ) и в центре молекулярной геномики UTMB.

  Временные трансфекции выполняли с помощью TransIT-LT1 (Mirus), Lipofectamine 2000 или RNAiMax (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителей. Кроличьи антитела против NiV-M были описаны ранее [38].Кроличьи антитела против фосфо-IRF3 (Ser396) (4D4G) и мышиные антитела против IRF3 (3F10) были получены от Cell Signaling и Immuno-Biological Laboratories, соответственно. Кроличьи антитела против TRIM6 (N-термин), кроличьи и мышиные антитела против c-myc, мыши и кроличьи антитела против FLAG, кроличьи антитела против HA, мышиные антитела против β-тубулина и мышиные антитела против β-актина были от Sigma. Кроличьи антитела против фосфо IKKε (Т501) были приобретены в Novus Biologicals. Кроличьи моноклональные антитела к убиквитину лизин 48 (K48, клон Apu2) были приобретены у Millipore.Кроличьи антитела против GST (OTI4G1) были от Bethyl Laboratories. Флуоресцентно меченые вторичные антитела для визуализации: козьи антимыши Alexa Fluor 488, ослиные антимыши Alexa Fluor 488, козьи антимыши Alexa Fluor 555, ослиные антимыши Alexa Fluor 555, козьи антимышиные антимышки Alexa Fluor 633, были приобретены у ThermoScientific (Life Technologies) . Непосредственно конъюгированные антитела к кролику с меткой Flag / DYKDDDK (Alexa 555) и мыши с меткой HA (Alexa 488) были получены от ThermoScientific и Cell Signaling Technologies.

  Люциферазный репортерный анализ

  клеток HEK293T трансфицировали в 24 (50 × 10 ³ клеток на лунку) или 96-луночных планшетах (10 × 10 ³ клеток на лунку) (Falcon, Becton Dickinson, NJ) 10-50 нг репортерной плазмиды IFNβ / ISG54 ISRE. , 4–20 нг люциферазы Renilla и 2–50 нг плазмид с использованием TransIT-LT1 (Mirus) в соотношении 1: 3. Пустой вектор использовали для гарантии того, что концентрация плазмиды в каждой лунке была одинаковой. Через 24 часа клетки лизировали и проводили двойной анализ люциферазы в соответствии с инструкциями производителя (Promega, Madison, WI, США).Сначала рассчитывали процент ингибирования путем нормализации значений люциферазы по значениям Renilla (fLuc / rLuc). Затем на каждом графике положительный контроль, который имеет активатор (SeV, IFNβ, TRIF и т.д.), но не ингибитор (т.е. NiV-M или NiV-V), был установлен на 100%, а все остальное было нормализовано к этому контрольному образцу.

  Коиммунопреципитация и вестерн-блоттинг

  Трансфицированных клеток 293T собирали в буфере для лизиса RIPA, содержащем 50 мМ TRIS, pH 8,0, 280 мМ NaCl, 0,5% [об. / Об.] NP40, 10% глицерин, коктейль ингибиторов протеаз [Roche и с добавлением 5 мМ N-этилмалеимида ( NEM) и йодацетамид в качестве ингибиторов деубиквитиназы.Лизат клеток осветляли микроцентрифугированием при 14000 об / мин в течение 20 мин. Отбирали одну десятую аликвоты осветленного лизата и добавляли к 2x буферу Лэммли с β-ME и хранили при -20 ° C для вестерн-блоттинга (экстракты целых клеток, [WCE]). К остальному лизату добавляли мышиные антитела против FLAG или против HA, поперечно связанные с гранулами агарозы (EZ View Red Anti-FLAG M2 или EZ View Red Anti-HA Affinity Gel Sigma), и вращали на настольном шейкере в течение ночи. при 4 ° C. На следующий день шарики тщательно промывали и связанные белки элюировали кипячением в течение 10 мин в загрузочном буфере Лэммли.

  Для иммуноблоттинга белки разделяли электрофорезом в SDS-полиакриламидном геле (7,5% или 4-15% SDS-PAGE) и переносили на PVDF-мембрану (Immobilon-P Millipore или BioRad Laboratories). Были использованы следующие первичные антитела: анти-Ub-K48 (1: 1000), анти-Flag (1: 3,000) (Sigma), анти-HA (1: 5,000) (Sigma), анти-GST (1: 2,000). (Bethyl Laboratories), anti-myc (1: 2,000) (Sigma), anti-NiV M (1: 3000), anti-TRIM6 N term (1: 1000), pIKKε (1: 500), anti pIRF3 (1: 1000). ), анти-IRF3 (1: 3000), антиактин / тубулин (1: 5000).

  Иммуноблоты были разработаны со следующими вторичными антителами: цельное антитело осла, конъюгированное с пероксидазой хрена и IgG кролика, от овцы (GE Healthcare; Бакингемшир, Англия). Белки визуализировали с помощью реагента усиленной хемилюминесценции (Pierce).

  siRNA-опосредованный ген, нацеленный на

  Временный нокдаун эндогенного TRIM6 в человеческих клетках 293T, высеянных в 96-луночные планшеты, был достигнут, как описано ранее [13].Вкратце, трансфекцией 10 пмоль нецелевого контроля или siRNA, специфичной для TRIM6 (Life technologies, TRIM6-специфическая последовательность Sleath RNAi, нацеленная на 5′-UTR область варианта транскрипта 2; смысл: GCUGCUUCAAGUCCUUGGCUCUGAU и антисмысловой: AUCAGAGCCAAGCAGCUUGAGA), RNAiMAX (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя. Спасение от нокдауна достигалось трансфекцией плазмиды, кодирующей TRIM6, с использованием TransIT-LT1 (Mirus) через 24 часа после сайленсинга. Поскольку миРНК нацелена на нетранслируемую область TRIM6, эти последовательности миРНК не ослабляют экспрессию TRIM6 из вектора экспрессии при трансфекции.Нокдаун TRIM6 и эффективность восстановления определяли с помощью вестерн-блоттинга и ПЦР в реальном времени с использованием специфических праймеров, как описано ранее [13].

  Количественная ПЦР

  QPCR выполняли, как описано ранее [44]. Вкратце, тотальную РНК экстрагировали из hMDDC с помощью реагента TRIzol (Sigma). кДНК получали с использованием системы синтеза первой цепи SuperScript III (Invitrogen). Относительную экспрессию генов определяли с использованием PerfeCTa SYBR green FastMix (Quanta Biosciences, Inc.) с прибором Bio-Rad CFX96.Программное обеспечение CXF Manager (Bio-Rad) использовалось для анализа относительных уровней экспрессии мРНК по изменению порогового цикла (ΔCT), при этом ген RPS11 служил эталонной мРНК, к которой результаты были нормализованы. Число копий для RPS11 было основано на стандартной кривой, построенной с использованием плазмиды, содержащей RPS11.

  Иммунофлуоресцентная микроскопия и анализ изображений

  Для исследований колокализации TRIM6 и NiV-M или мутантов клетки HeLa высевали на 8-луночные предметные стекла Lab-Tek II (предметное стекло CC2, Nunc; Рочестер, Нью-Йорк).Через 12–16 ч 300-700 нг плазмид, содержащих NiV-M, NiV-K258A, NiV-K258R, HA-TRIM6 или пустой скелет вектора, трансфицировали липофектамином 2000 (Invitrogen) в соотношении 1: 1. Шесть часов спустя среду заменяли и через 16-24 часа клетки промывали PBS, фиксировали 4% параформальдегидом, повышали проницаемость 0,5% NP-40 (об. / Об.) В PBS и блокировали 0,5% BSA 0,2%. желатин в PBS в течение 1 ч (блокирующий раствор). Для NiV-M или его мутантов клетки окрашивали первичным кроличьим анти-M антителом (1: 1000) [38], а для HA-TRIM6 анти-HA антителом (1: 200) Alexa Fluor 488 (приготовленным в блокирующем растворе). в течение ночи при 4 ° C.На следующий день клетки промывали 3 раза блокирующим раствором и использовали вторичные ослиные антитела против кроличьего Alexa-Fluor 555 (Invitrogen), разведенные в блокирующем буфере вместе с DAPI (1: 2000), для визуализации белков. Слайды получали на конфокальном микроскопе Zeiss LSM 510 в оптическом ядре UTMB при увеличении 63 ×. Для неконфокальной визуализации наблюдали слайды и визуализацию проводили на планшет-ридере Bio-Tek Cytation5 с флуоресцентным микроскопом.

  Для экспериментов по заражению живыми вирусами клетки инфицировали рекомбинантным вирусом Nipah, экспрессирующим EGFP (rNiV-EGFP ^NP ) [59] (обозначено в тексте как NiV-WT) или rNiV-EGFP ^NP , не содержащим матриксного белка ( rNiV-EGFP ^NP delta M, обозначенный в тексте как NiV-ΔM) при MOI, равном 0.1. Через 24-48 часов после заражения клетки фиксировали 10% формалином в течение 24 часов и удаляли из BSL4. Клетки тщательно промывали PBS, повышали проницаемость с помощью 0,5% NP-40 (об. / Об.) В PBS и блокировали 0,5% BSA 0,2% рыбьего желатина в PBS в течение 1 часа (блокирующий раствор).

  Клетки, инфицированные rNiV-EGFP ^NP или rNiV-EGFP ^NP дельта M, окрашивали на TRIM6 с использованием кроличьих антител против TRIM6 N-term (Sigma) (1: 200) в течение ночи при 4 ° C, промывали 3 раза с блокированием. буфер на следующий день и окрашивание вторичным ослиным антителом против кролика Alexa Fluor 555 (1: 500) и контрастное окрашивание DAPI (1: 2000) в течение 1 часа (фиг. 7A и 7B).Альтернативно, клетки окрашивали на антитело против NiV-M [38] (1: 1000) вместе с мышиным антителом против TRIM6 (1: 100) в течение ночи при 4 ° C с последующими тремя промываниями на следующий день. Затем клетки окрашивали вторичным ослиным антителом против кроличьего Alexa Fluor 555 (1: 500) и козьим антителом против мыши Alexa Fluor 633 и контрастировали с помощью DAPI (1: 2000). После обширной промывки PBS клетки помещали, используя среду для крепления экрана Vecta, и отображали на конфокальном микроскопе Zeiss LSM 510 в оптическом ядре для визуализации UTMB и цитировании Bio-Tek5 (рис. 7C).

  Ячейки были подсчитаны вручную, включены или исключены путем проверки, чтобы убедиться, что для всех ячеек, включенных в окончательную оценку, правильно определена граница ячейки. Программное обеспечение ImageJ использовалось для расчета соотношения между средней интенсивностью флуоресценции (MFI) NiV-M и TRIM6. Для этой количественной оценки индивидуальные клетки были отобраны с помощью инструмента выделения от руки в программном обеспечении imageJ по границам каждой отдельной клетки на основе окрашивания TRIM6. Для количественной оценки в программе ImageJ было отобрано более 50 клеток.Применяли минимальный уровень интенсивности отсечки, чтобы гарантировать, что экспрессия NiV-M была достаточной.

  Спасение рекомбинантного NiV rNiV-EGFP

  ^NP дельта-M вируса (NiV-ΔM)

  Спасательная конструкция rNiV-ΔM, управляемая T7, была получена из rNiV с люциферазой светлячка между генами N и P [59]. Ген M был удален путем замены на EGFP. Клетки HEK293T трансфицировали вспомогательной плазмидой, кодирующей NiV-M (0,5 мкг), для облегчения отпочкования зрелых вирионов. Через четыре часа клетки трансфицировали вспомогательными плазмидами, кодирующими полимеразу Т7 с оптимизированными кодонами (1 мкг), NiV-N (1 мкг), NiV-P (0.8 мкг), NiV-L (0,2 мкг) и полноразмерный rNiV-ΔM (3,5 мкг) с использованием реагента TransIT-LT1. Супернатанты собирали на 5-й день, и затем спасенный вирус размножали через инфекции NiV-M-индуцибельных клеток 293-pTRE3G-M. Для создания этих клеток, кодон-оптимизированный NiV-M в pTRE3G (Clontech) был введен в клетки HEK293 Tet-On 3G (Clontech) и одиночная клетка клонирована для индуцируемой доксициклином экспрессии NiV-M. Размножение в G418 поддерживало трансактиватор Tet-on, а гигромицин поддерживал pTRE3G-NiV-M, который стабильно интегрировался вместе с линейным маркером гигромицина (посредством котрансфекции).Экспрессию М индуцировали добавлением 30 нг / мл доксициклина перед инфицированием спасенным rNiV-ΔM. Затем через 5 дней после инфицирования собирали супернатант. Титры вирусов определяли стандартными анализами бляшек в клетках Vero. Отсутствие экспрессии М было подтверждено вестерн-блоттингом. (S4 Рис).

  Выделение DC человеческих моноцитов (hMDDC) и лентивирусная трансдукция

  MDDC человека были получены из клеток CD14 ⁺ , очищенных из концентрированных лейкоцитов здоровых доноров-людей (Центр крови Нью-Йорка), как описано ранее [42, 44].Вкратце, мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) выделяли центрифугированием в градиенте плотности фиколла, а клетки CD14 ⁺ очищали с использованием микрогранул CD14. Клетки CD14 ⁺ инкубировали при 37 ° C в течение 5 дней в среде DC (RPMI, содержащий 4% сыворотки AB человека, 2 мМ L-глутамин, 1 мМ пируват натрия, 100 Ед / мл пенициллина — 100 мкг / мл стрептомицина, и 55 мкМ β-меркаптоэтанол) с добавлением 500 Ед / мл человеческого гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора и 500 Ед / мл человеческого интерлейкина-4 (hIL-4; PeproTech).MDDC трансдуцировали путем спинокуляции при 1850 об / мин лентивирусами и Vpx-VLP в течение 2,5 часов, а затем культивировали в свежей среде в течение 72 часов. Трансдуцированные MDDC собирали для оценки экспрессии с помощью проточной цитометрии и вестерн-блоттинга или использовали в последующих экспериментах.

  Заявление об этике

  Лейкоциты здоровых доноров были получены из Нью-Йоркского центра крови. Эти образцы являются образцами анонимных доноров банка крови. Это исследование является исключенным и не требует проверки IRB.

  Статистический анализ

  Статистический анализ выполняли с помощью Prism (версия 5.0, программное обеспечение GraphPad) с использованием парного t-критерия Стьюдента или в определенных случаях использовали двухфакторный дисперсионный анализ ANOVA с пост-тестом Бонферрони. * р <0,05; ** р <0,01; *** р <0,001, **** р <0,0001

  Дополнительная информация

  S1 Рис. Матричный белок вируса Нипах подавляет индукцию мРНК IFNβ в инфицированных SeV клетках и увеличивает репликацию SeV.

  клеток HEK293T трансфицировали NiV-M или пустым вектором в течение 30 часов с последующей инфекцией SeV.Клетки лизировали в разные моменты времени p.i. для выделения РНК и анализа КПЦР.

  https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005880.s001

  (TIFF)

  S3 Фиг. NiV-M-WT и K258A взаимодействуют с TRIM6 и конкурируют за взаимодействие TRIM6 с IKKε.

  A) Клетки HEK293T трансфицировали NiV-M-WT или NiV-M-K258A, пустым вектором или HA-TRIM6 и IKKε. Клетки собирали и экстракты целых клеток (WCE) использовали для иммунопреципитации TRIM6 с использованием анти-HA-гранул (A) или для обратного coIP для IKKε с использованием анти-Flag-гранул (B).

  https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005880.s003

  (TIFF)

  S4 Рис. Вирус NiV-ΔM имеет замедленную кинетику роста.

  A) Кинетика роста rNiV-WT и ΔM в клетках Vero при начальной MOI 0,01. B) rNiV-ΔM не экспрессирует матриксный белок. Образцы собирали в каждый момент времени для иммуноблоттинга.

  https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005880.s004

  (TIFF)

  S5 Рис. TRIM6 консервативен у всех видов млекопитающих.

  Филогенетический анализ TRIM6.Выравнивание множественных последовательностей белков проводили с использованием всех последовательностей TRIM6, представленных на сайте NCBI. Результаты выравнивания последовательностей были использованы для построения филогенетического дерева по соседству, используя веб-сайт NCBI.

  https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005880.s005

  (TIF)

  S7 Рис. Факторы пути RIG-I / MDA5 обладают высокой степенью гомологии между людьми и летучими мышами.

  Множественное выравнивание последовательностей белков было выполнено с использованием последовательностей белков человека и летучих мышей, представленных на веб-сайте NCBI, и показана идентичность аминокислот.

  https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005880.s007

  (TIFF)

  Благодарности

  Авторы также хотели бы поблагодарить членов Объединенной рабочей группы по иммунологии UTMB (докторов Эндсли, Сунг, Конг, Стивенс, Сан, Ху и Раджсбаум и их стажеров) за полезные обсуждения.

  Вклад авторов

  1. Концептуализация: PB YEW CFB ANF BL RR.
  2. Формальный анализ: PB YEW BED TEY AP BY CFB ANF BL RR.
  3. Получение финансирования: ANF BL RR.
  4. Исследование: PB YEW BED TEY AP BY RR.
  5. Методология: PB YEW CFB ANF BL RR.
  6. Администрация проекта: BL RR.
  7. Ресурсы: CFB ANF BL RR.
  8. Надзор: CFB ANF BL RR.
  9. Подтверждение: PB YEW BED TEY AP BY RR.
  10. Визуализация: PB TEY BED TEY AP BY RR.
  11. Написание — оригинальная черновик: PB ANF BL RR.
  12. Написание — просмотр и редактирование: PB YEW BED TEY AP BY CFB ANF BL RR.

  Ссылки

  1. 1. Меджитов Р., Престон-Херлбурт П., Джейнвей К.А. Младший. Человеческий гомолог белка Toll дрозофилы сигнализирует об активации адаптивного иммунитета. Природа. 1997. 388 (6640): 394–7.
  2. 2. Meylan E, Tschopp J, Karin M. Рецепторы распознавания внутриклеточных образов в ответе хозяина.Природа. 2006. 442 (7098): 39–44. pmid: 16823444.
  3. 3. Гитлин Л., Барчет В., Гилфиллан С., Селла М., Бейтлер Б., Флавелл Р.А. и др. Существенная роль mda-5 в ответах IFN типа I на полирибоинозиновые: полирибоцитидиловую кислоту и пикорнавирус энцефаломиокардита. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2006; 103 (22): 8459–64. pmid: 16714379; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC1464000.
  4. 4. Ёнеяма М., Кикучи М., Нацукава Т., Синобу Н., Имаидзуми Т., Миягиши М. и др. РНК-геликаза RIG-I выполняет важную функцию в индуцированных двухцепочечной РНК врожденных противовирусных реакциях.Nat Immunol. 2004. 5 (7): 730–7. pmid: 15208624.
  5. 5. Каваи Т., Такахаши К., Сато С., Кобан С., Кумар Х., Като Х. и др. IPS-1, адаптер, запускающий индукцию интерферона I типа, опосредованную RIG-I и Mda5. Nat Immunol. 2005. 6 (10): 981–8. pmid: 16127453.
  6. 6. Ямамото М., Сато С., Хемми Х, Хосино К., Кайсё Т., Сандзё Х и др. Роль адаптера TRIF в MyD88-независимом сигнальном пути толл-подобных рецепторов. Наука. 2003. 301 (5633): 640–3. pmid: 12855817.
  7. 7.Hemmi H, Takeuchi O, Sato S, Yamamoto M, Kaisho T, Sanjo H и др. Роль двух киназ, связанных с киназой IkappaB, в передаче сигналов липополисахаридом и двухцепочечной РНК и вирусной инфекции. J Exp Med. 2004; 199 (12): 1641–50. pmid: 15210742; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC2212809.
  8. 8. Sharma S, tenOever BR, Grandvaux N, Zhou GP, Lin R, Hiscott J. Запуск противовирусного ответа интерферона посредством IKK-связанного пути. Наука. 2003. 300 (5622): 1148–51. pmid: 12702806.
  9. 9. Рахман М.М., Макфадден Г. Модуляция передачи сигналов NF-kappaB микробными патогенами. Nat Rev Microbiol. 2011. 9 (4): 291–306. pmid: 21383764; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC3611960.
  10. 10. Валлабхапурапу С., Карин М. Регулирование и функция факторов транскрипции NF-kappaB в иммунной системе. Анну Рев Иммунол. 2009. 27: 693–733. pmid: 19302050.
  11. 11. Platanias LC. Механизмы передачи сигналов, опосредованной интерфероном типа I и типа II.Nat Rev Immunol. 2005. 5 (5): 375–86. pmid: 15864272.
  12. 12. Ng SL, Friedman BA, Schmid S, Gertz J, Myers RM, Tenoever BR и др. IkappaB киназа эпсилон (IKK (эпсилон)) регулирует баланс между интерфероновыми ответами типа I и типа II. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2011; 108 (52): 21170–5. pmid: 22171011; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC3248534.
  13. 13. Rajsbaum R, Versteeg GA, Schmid S, Maestre AM, Belicha-Villanueva A, Martinez-Romero C, et al. Незакрепленный K48-связанный полиубиквитин, синтезируемый E3-убиквитинлигазой TRIM6, стимулирует противовирусный ответ, опосредованный интерферон-IKKepsilon-киназой.Иммунитет. 2014; 40 (6): 880–95. pmid: 24882218; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC4114019.
  14. 14. Tenoever BR, Ng SL, Chua MA, McWhirter SM, Garcia-Sastre A, Maniatis T. Множественные функции IKK-связанной киназы IKKepsilon в опосредованном интерфероном противовирусном иммунитете. Наука. 2007. 315 (5816): 1274–8.
  15. 15. Раджсбаум Р., Гарсия-Састре А. Механизмы уклонения от вирусов ранних противовирусных реакций, включая регуляцию путей убиквитина. Trends Microbiol. 2013; 21 (8): 421–9.
  16. 16. Раджсбаум Р., Гарсия-Састре А., Верстег Г.А. TRIMmunity: роль семейства TRIM E3-убиквитинлигаз в врожденном противовирусном иммунитете. J Mol Biol. 2014. 426 (6): 1265–84. pmid: 24333484; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC3945521.
  17. 17. Rajsbaum R, Stoye JP, O’Garra A. Интерферон-зависимая и независимая экспрессия трехчастичных мотивных белков в иммунных клетках. Eur J Immunol. 2008. 38 (3): 619–30.
  18. 18. Uchil PD, Hinz A, Siegel S, Coenen-Stass A, Pertel T., Luban J, et al.TRIM-белок-опосредованная регуляция передачи сигналов воспалительного и врожденного иммунитета и ее связь с антиретровирусной активностью. J Virol. 2013. 87 (1): 257–72. pmid: 23077300; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC3536418.
  19. 19. Верстег Г.А., Бенке С., Гарсия-Састре А., Райсбаум Р. Внутренний иммунитет: положительная и отрицательная регуляция иммунной передачи сигналов с помощью белков трехчастных мотивов. Cytokine Growth Factor Rev.2014; 25 (5): 563–76. pmid: 25172371.
  20. 20. Versteeg GA, Rajsbaum R, Sanchez-Aparicio MT, Maestre AM, Valdiviezo J, Shi M, et al.Семейство белков TRIM с E3-лигазой регулирует сигнальные пути, запускаемые рецепторами распознавания паттернов врожденного иммунитета. Иммунитет. 2013; 38 (2): 384–98.
  21. 21. Колакофски Д., Ру Л., Гарсин Д., Руигрок Р.В. Редактирование мРНК парамиксовируса, «правило шести» и катастрофа ошибок: гипотеза. J Gen Virol. 2005; 86 (Pt 7): 1869–77.
  22. 22. Дидкок Л., Янг Д. Ф., Гудборн С., Рэндалл Р. Э.. Белок V обезьяньего вируса 5 ингибирует передачу сигналов интерферона, нацеливая STAT1 на протеасомную деградацию.J Virol. 1999. 73 (12): 9928–33. pmid: 10559305; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC113042.
  23. 23. Parisien JP, Lau JF, Rodriguez JJ, Sullivan BM, Moscona A, Parks GD, et al. Белок V вируса парагриппа 2 человека противодействует ответам интерферона I типа, дестабилизируя преобразователь сигнала и активатор транскрипции 2. Вирусология. 2001. 283 (2): 230–9. pmid: 11336548.
  24. 24. Родригес JJ, Parisien JP, Хорват CM. Белок вируса V Nipah уклоняется от альфа- и гамма-интерферонов, предотвращая активацию STAT1 и STAT2 и накопление в ядре.J Virol. 2002. 76 (22): 11476–83. pmid: 12388709; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC136769.
  25. 25. Родригес Дж. Дж., Ван Л. Ф., Хорват СМ. Белок вируса Хендры V подавляет передачу сигналов интерферона, предотвращая накопление STAT1 и STAT2 в ядре. J Virol. 2003. 77 (21): 11842–5. pmid: 14557668; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC229371.
  26. 26. Palosaari H, Parisien JP, Rodriguez JJ, Ulane CM, Horvath CM. Интерференция белка STAT и подавление передачи цитокинового сигнала белком V вируса кори.J Virol. 2003. 77 (13): 7635–44. pmid: 12805463; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC164804.
  27. 27. Итон БТ, Бродер С.К., Миддлтон Д., Ван Л.Ф. Вирусы Hendra и Nipah: разные и опасные. Nat Rev Microbiol. 2006. 4 (1): 23–35.
  28. 28. Филд Х, Янг П., Йоб Дж. М., Миллс Дж., Холл Л., Маккензи Дж. Естественная история вирусов Хендра и Нипах. Микробы заражают. 2001. 3 (4): 307–14. pmid: 11334748.
  29. 29. Шоу М.Л., Гарсия-Састре А., Палезе П., Basler CF.Белки V и W вируса Nipah имеют общий STAT1-связывающий домен, но ингибируют активацию STAT1 из цитоплазматического и ядерного компартментов, соответственно. J Virol. 2004. 78 (11): 5633–41.
  30. 30. Андреева Дж., Чайлдс К.С., Янг Д.Ф., Карлос Т.С., Сток Н., Гудборн С. и др. Белки V парамиксовирусов связывают IFN-индуцируемую РНК-геликазу, mda-5, и ингибируют ее активацию промотора IFN-бета. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2004; 101 (49): 17264–9. pmid: 15563593; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC535396.
  31. 31. Шредер М., Баран М., Боуи АГ. Вирусное нацеливание на DEAD-бокс-белок 3 показывает его роль в активации IRF, опосредованной TBK1 / IKKepsilon. EMBO J. 2008; 27 (15): 2147–57. pmid: 18636090; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC2516890.
  32. 32. Сен GC. Вирусы и интерфероны. Annu Rev Microbiol. 2001; 55: 255–81. pmid: 11544356.
  33. 33. Шоу М.Л., Карденас В.Б., Замарин Д., Палезе П., Basler CF. Ядерная локализация белка W вируса Нипах позволяет ингибировать сигнальные пути, запускаемые как вирусом, так и толл-подобным рецептором 3.J Virol. 2005 79: 6078–6088. pmid: 15857993; PubMed Central PMCID: PMC10
      .
  34. 34. Чианканелли М.Дж., Волчкова В.А., Шоу М.Л., Волчков В.Е., Basler CF. Вирус Nipah изолирует неактивный STAT1 в ядре посредством механизма, кодируемого геном P. J Virol. 2009. 83 (16): 7828–41. pmid: 19515782; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC2715789.
  35. 35. Добродетель ER, Марш Г.А., Бейкер М.Л., Ван Л.Ф. Во время инфицирования вирусом генипавируса клеточных линий плодовых летучих мышей происходит антагонизм с продуцированием интерферона и сигнальными путями.PLoS One. 2011; 6 (7): e22488. pmid: 21811620; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC3139658.
  36. 36. Йонеда М., Гийом В., Сато Х., Фуджита К., Жорж-Курбот М.С., Икеда Ф. и др. Неструктурные белки вируса Нипах играют ключевую роль в патогенности экспериментально инфицированных животных. PLoS One. 2010; 5 (9): e12709. pmid: 20856799; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC2939873.
  37. 37. Добродетель ER, Марш Г.А., Ван Л.Ф. Передача сигналов интерферона остается функциональной во время инфицирования генипавирусом клеточных линий человека.J Virol. 2011. 85 (8): 4031–4. pmid: 21289115; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC3126122.
  38. 38. Ван Ю.Е., Парк А, Озеро М, Пятидесятница М., Торрес Б., Юн Т.Э. и др. Регулируемый убиквитином ядерно-цитоплазматический перенос матричного белка вируса Nipah важен для образования почки вируса. PLoS Pathog. 2010; 6 (11): e1001186. pmid: 21085610; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC2978725.
  39. 39. Пятидесятница М., Вашишт А.А., Лестер Т., Ворос Т., Бити С.М., Парк А. и др. Доказательства регулируемого убиквитином ядерного и субядерного транспорта среди белков матрикса Paramyxovirinae.PLoS Pathog. 2015; 11 (3): e1004739. pmid: 25782006; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC4363627.
  40. 40. Парк М.С., Шоу М.Л., Муньос-Джордан Дж., Крос Дж. Ф., Накая Т., Бувье Н. и др. Анализ на основе вируса болезни Ньюкасла (NDV) демонстрирует антагонистическую активность интерферона в отношении белка V NDV и белков V, W и C вируса Нипах. J Virol. 2003. 77 (2): 1501–11. pmid: 12502864; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC140815.
  41. 41. Матье К., Поль С., Сечи Дж., Трайкович-Боденнек С., Девергнас С., Рауль Х. и др.Вирус Nipah использует лейкоциты для эффективного распространения в организме хозяина. J Virol. 2011. 85 (15): 7863–71. pmid: 21593145; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC3147937.
  42. 42. Basler CF, Wang X, Muhlberger E, Volchkov V, Paragas J, Klenk HD и др. Белок VP35 вируса Эбола действует как антагонист IFN типа I. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2000; 97 (22): 12289–94. pmid: 11027311; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC17334.
  43. 43. Раманан П., Шабман Р.С., Браун С.С., Амарасинге Г.К., Basler CF, Леунг Д.В.Филовирусные механизмы уклонения от иммунитета. Вирусы. 2011; 3 (9): 1634–49.
  44. 44. Йен Б., Малдер LC, Мартинес О., Basler CF. Молекулярная основа подавления эболавирусом VP35 созревания дендритных клеток человека. J Virol. 2014. 88 (21): 12500–10. pmid: 25142601; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC4248944.
  45. 45. Лутра П., Раманан П., Mire CE, Weisend C, Tsuda Y, Yen B и др. Взаимный антагонизм между белком VP35 вируса Эбола и активатором RIG-I PACT определяет исход инфекции.Клеточный микроб-хозяин. 2013. 14 (1): 74–84. pmid: 23870315; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC3875338.
  46. 46. Сет РБ, Сун Л., Эа СК, Чен З.Дж. Идентификация и характеристика MAVS, митохондриального антивирусного сигнального белка, который активирует NF-kappaB и IRF 3. Cell. 2005. 122 (5): 669–82.
  47. 47. Дрекслер Дж. Ф., Корман В. М., Глоза-Рауш Ф., Зеебенс А., Аннан А., Ипсен А. и др. РНК генипавируса африканских летучих мышей. PLoS One. 2009; 4 (7): e6367. pmid: 19636378; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC2712088.
  48. 48. Пернет О., Шнайдер Б.С., Бити С.М., ЛеБретон М., Юн Т.Э., Парк А. и др. Доказательства распространения вируса генипавируса на человеческое население в Африке. Nat Commun. 2014; 5: 5342. pmid: 25405640; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC4237230.
  49. 49. Лиу К.Г., Марш Г.А., Ван Л.Ф., Неттер Х.Дж. Непатогенный фосфопротеин парамиксовируса генипавируса кедра имеет скомпрометированную способность нацеливаться на STAT1 и STAT2. Antiviral Res. 2015; 124: 69–76. pmid: 26526590.
  50. 50. Марш Г.А., де Йонг С., Барр Дж. А., Тачеджиан М., Смит С., Миддлтон Д. и др.Кедровый вирус: новый генипавирус, выделенный от австралийских летучих мышей. PLoS Pathog. 2012; 8 (8): e1002836. pmid: 22879820; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC3410871.
  51. 51. Реймонд А., Мерони Дж., Фантоцци А., Мерла Дж., Каир С., Лузи Л. и др. Семейство трехчастных мотивов идентифицирует клеточные компартменты. EMBO J. 2001; 20 (9): 2140–51. pmid: 11331580; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC125245.
  52. 52. Дитцель Э., Колесникова Л., Саватски Б., Хайнер А., Вейс М., Кобингер Г.П. и др. Белок матрицы вируса Нипах влияет на фузогенность и имеет важное значение для инфицирования и стабильности частиц.J Virol. 2015; 90 (5): 2514–22. pmid: 26676785; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC4810686.
  53. 53. Диаз-Грифферо Ф., Ли Х, Джаванбахт Х., Сонг Б., Великала С., Стремлау М. и др. Быстрый оборот и полиубиквитилирование ретровирусного фактора рестрикции TRIM5. Вирусология. 2006. 349 (2): 300–15. pmid: 16472833.
  54. 54. Li X, Song B, Xiang SH, Sodroski J. Функциональное взаимодействие между доменами B-box 2 и B30.2 (SPRY) TRIM5alpha. Вирусология. 2007. 366 (2): 234–44. pmid: 17543365; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC2040257.
  55. 55. Хан YH, Moon HJ, You BR, Park WH. Влияние MG132, ингибитора протеасом на клетки HeLa в отношении роста клеток, активных форм кислорода и GSH. Oncol Rep. 2009; 22 (1): 215–21. pmid: 19513526.
  56. 56. Данмор Б.Дж., Дрейк К.М., Аптон П.Д., Тошнер М.Р., Олдред М.А., Моррелл Н.В. Лизосомный ингибитор, хлорохин, увеличивает уровни BMPR-II на клеточной поверхности и восстанавливает передачу сигналов BMP9 в эндотелиальных клетках, несущих мутации BMPR-II. Hum Mol Genet. 2013. 22 (18): 3667–79.pmid: 23669347; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC3749859.
  57. 57. Кохс Г., Гарсия-Састре А., Мартинес-Собридо Л. Множественные антиинтерфероновые действия белка NS1 вируса гриппа А. J Virol. 2007. 81 (13): 7011–21. pmid: 17442719; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC1933316.
  58. 58. Нистал-Виллан Э., Гак М.Ю., Мартинес-Дельгадо Г., Махарадж Н.П., Инн К.С., Ян Х. и др. Отрицательная роль фосфорилирования серина 8 RIG-I в регуляции продукции интерферона-бета. J Biol Chem.2010. 285 (26): 20252–61.
  59. 59. Юн Т., Пак А., Хилл Т. Е., Пернет О., Бити С. М., Джулич Т. Л. и др. Эффективная обратная генетика выявляет генетические детерминанты почкования и фузогенных различий между вирусами Nipah и Hendra и позволяет в режиме реального времени отслеживать распространение вируса на моделях хенипавирусной инфекции на мелких животных. J Virol. 2015; 89 (2): 1242–53. pmid: 25392218; Идентификатор PubMed Central PMCID: PMCPMC4300668.

  Протеин мышечной матрицы — измельченный Rx

  Muscle Matrix Pro

  Смесь изолята сыворотки и мицеллярного казеина, 2 фунта и 5 фунтов, NutraBio

  4-ЧАСОВАЯ ПОЛНАЯ БЕЛКОВАЯ МАТРИЦА

  КАК ЭТО РАБОТАЕТ?

  • Медленно перевариваемый антикатаболический белок длится до 4 часов
  • Содержит расширенный аминокислотный профиль полного спектра
  • 55% изолят сывороточного протеина — 45% мицеллярный казеин

  25 г белков | 115 калорий | 5 г BCAA

  Полная протеиновая матрица, обеспечивающая 4 часа доставки аминокислот в мышцы

  Muscle Matrix содержит 25 граммов чистого, полноценного белка, полученного из двух разных источников молока, которые перевариваются и усваиваются с разной скоростью, чтобы вызвать синтез мышечного белка и поддерживать высокий уровень аминокислот в системном кровотоке в течение нескольких часов; в свою очередь, обеспечивая идеальное анаболическое состояние для максимального роста и восстановления мышц.Изолят сыворотки в Muscle Matrix быстро переваривается и вызывает стойкую гипераминоацидемию (повышенный уровень аминокислот в крови), который остается повышенным через 1,5 часа и возвращается к исходному уровню примерно через 3-5 часов. Эти повышенные уровни увеличивают синтез белка и анаболизм. Напротив, мицеллярный казеин, содержащийся в Muscle Matrix , коагулирует в кишечнике и переваривается медленнее, чем изолят сывороточного протеина. Это приводит к медленному увеличению концентраций аминокислот в крови, которые остаются повышенными до 7 часов, тем самым увеличивая время синтеза мышечного белка.В сумме эти два белка, содержащиеся в белке Muscle Matrix , работают вместе в нужное время, чтобы помочь вам достичь результатов.

  Muscle Matrix в сочетании с правильными тренировками может привести к увеличению сухой мышечной массы, увеличению силы, уменьшению жировых отложений и сокращению времени, затрачиваемого на восстановление после тренировки, повреждающей мышцы. С Muscle Matrix вы также можете быть уверены, что в нем нет выбросов аминокислот, и то, что указано на этикетке, — ИМЕННО то, что вы получаете.

  Muscle Matrix не содержит концентрата сыворотки низкого качества или других низкокачественных белков, добавленных углеводов, мальтодекстрина, декстрозы, сливок или любых других наполнителей; только чистые, неденатурированные белки, прошедшие холодную обработку для сохранения целостности белковых фракций и защиты целостности аминокислотных профилей. Muscle Matrix также содержит мало жира, сахара, углеводов и калорий, поэтому вы можете больше беспокоиться о следующем подходе, а не о соблюдении своих макросов. Не обманывайте свои достижения, выбирая протеиновый порошок худшего качества или экономя на ежедневном потреблении протеина. Сделайте Muscle Matrix фундаментом вашего храма наращивания мышц.

  Что вы НАЙДЕТЕ в каждой порции NutraBio Muscle Matrix Protein:

  • Белок с полной этикеткой / раскрытием ингредиентов
  • 25 граммов полноценного высококачественного протеина, полученного из изолята сывороточного протеина и мицеллярного казеина
  • Расширенный аминокислотный профиль полного спектра для максимального синтеза белка, минимизации разрушения мышц и поддержки восстановления.
  • Холодная обработка, микро- и ультрафильтрованная неденатурированная сыворотка с перекрестным потоком. С полным балансом биоактивных фракций сывороточного протеина.
  • Белок с низким содержанием чистых углеводов, лактозы, жира, холестерина и не содержит глютена и BSE / TSE. Все, что вам нужно, и ничего лишнего.
  • Кошерный белок
  • Белок, который разработан на нашем собственном предприятии, сертифицированном GMP и прошедшем проверку FDA. 99,9% наших конкурентов не могут сделать этого. Мы полностью контролируем наш белковый изолят от начала до конца.

  Чего вы НЕ НАЙДЕТЕ в NutraBio Muscle Matrix Protein:

  • Запатентованные смеси или добавление аминокислот. Мы предоставляем полную информацию об ингредиентах и ​​этикетках нашего протеина Muscle Matrix. Никаких игр, никаких трюков … только самый чистый и свежий протеин.
  • Низкие источники белка, такие как концентраты сыворотки низкого качества.
  • Дополнительные добавленные аминокислоты, такие как таурин или глицин, используемые некоторыми брендами для повышения содержания азота и введения вас в заблуждение, заставляя думать, что вы получаете больше белка, чем есть на самом деле.
  • Ионный обмен или протеин, обработанный кислотой, который разрушает естественное неденатурированное состояние сыворотки, в результате чего она теряет свою противораковую и иммуностимулирующую активность.
  • Наполнители, вспомогательные вещества, мальтодекстрин или декстроза, добавленный сахар или углеводы, искусственные красители, ГМО или запрещенные вещества.
  • Запрещенные вещества

  Сравнительный анализ белков вирусного матрикса с использованием предикторов нарушения | Журнал вирусологии

• 1.

  Тернер Б.Г., Саммерс М.Ф .: Структурная биология ВИЧ. J Mol Biol 1999, 285: 1-32. 10.1006 / jmbi.1998.2354

  CAS Статья PubMed Google ученый

• 2.

  Cannon PM, Matthews S, Clark N, Byles ED, Iourin O, Hockley DJ, Kingsman SM, Kingsman AJ: Структурно-функциональные исследования матричного белка вируса иммунодефицита человека типа 1, стр. 17. J Virol 1997, 71: 3474-3483.

  PubMed Central CAS PubMed Google ученый

• 3.

  Dorfman T, Mammano F, Haseltine WA, Gottlinger HG: Роль матричного белка в ассоциации вирионов гликопротеина оболочки вируса иммунодефицита человека 1 типа. J Virol 1994, 68: 1689-1696.

  PubMed Central CAS PubMed Google ученый

• 4.

  Harris A, Sha B, Luo M: Структурное сходство между матричным белком M1 вируса гриппа и матриксом вируса иммунодефицита человека и белками капсида: эволюционная связь между вирусами с отрицательной цепью РНК и ретровирусами. J Gen Virol 1999, 80 (Pt 4): 863-869.

  CAS Статья PubMed Google ученый

• 5.

  Hearps AC, Jans DA: Регулирование функций матричного белка ВИЧ-1. Ретровирусы AIDS Res Hum 2007, 23: 341-346. 10.1089 / aid.2006.0108

  CAS Статья PubMed Google ученый

• 6.

  Lyles DS, McKenzie M, Parce JW: Взаимодействия субъединиц гликопротеина оболочки вируса везикулярного стоматита, стабилизированные связыванием с вирусным матриксным белком. J Virol 1992, 66: 349-358.

  PubMed Central CAS PubMed Google ученый

• 7.

  Clements JE, Zink MC: Молекулярная биология и патогенез лентивирусных инфекций животных. Clin Microbiol Rev 1996, 9: 100-117.

  PubMed Central CAS PubMed Google ученый

• 8.

  Гоудсмит J: Вирусный секс: природа СПИДа. Oxford University Press, Нью-Йорк; 1997.

  Google ученый

• 9.

  Leroux C, Cadore JL, Montelaro RC: Вирус инфекционной анемии лошадей (EIAV): что нам должен сказать деревенский родственник ВИЧ? Vet Res 2004, 35: 485-512.10.1051 / ветрес: 2004020

  CAS Статья PubMed Google ученый

• 10.

  Marx PA, Li Y, Lerche NW, Sutjipto S, Gettie A, Yee JA, Brotman BH, Prince AM, Hanson A, Webster RG, et al. .: Выделение вируса иммунодефицита обезьян, связанного с к вирусу иммунодефицита человека типа 2 от западноафриканского домашнего животного сажистого мангабея. J Virol 1991, 65: 4480-4485.

  PubMed Central CAS PubMed Google ученый

• 11.

  Jurriaans S, van Gemen B, Weverling GJ, van Strijp D, Nara P, Coutinho R, Koot M, Schuitemaker H, Goudsmit J: Естественная история инфекции ВИЧ-1: вирусная нагрузка и независимые от фенотипа вируса детерминанты клинического течения ? Virology 1994, 204: 223-233. 10.1006 / viro.1994.1526

  CAS Статья PubMed Google ученый

• 12.

  Морган Д., Маэ С., Майянджа Б., Уитворт Дж. А.: Прогрессирование симптоматического заболевания у людей, инфицированных ВИЧ-1, в сельских районах Уганды: проспективное когортное исследование. BMJ 2002, 324: 193-196. 10.1136 / bmj.324.7331.193

  PubMed Central Статья PubMed Google ученый

• 13.

  Chen Z, Telfer P, Reed P, Zhang L, Getti A, Ho DD, Marx PA: Выделение и характеристика первого вируса иммунодефицита обезьян из одичавшего сажистого мангабея (Cercocebus atys) в Западной Африке. J Med Primatol 1995, 24: 108-115.

  CAS Статья PubMed Google ученый

• 14.

  Apetrei C, Lerche NW, Pandrea I, Gormus B, Silvestri G, Kaur A, Robertson DL, Hardcastle J, Lackner AA, Marx PA: Эксперименты Куру вызвали появление патогенного вируса SIVmac. AIDS 2006, 20: 317-321.

  Артикул PubMed Google ученый

• 15.

  Бейрер C: Потребители инъекционных наркотиков и испытания вакцины против ВИЧ: что говорит наука? AIDScience 2002, 2: 1-6.

  Google ученый

• 16.

  Бертон Д.Р., Стэнфилд Р.Л., Уилсон И.А.: Антитело против ВИЧ в столкновении эволюционных титанов. Proc Natl Acad Sci USA 2005, 102: 14943-14948. 10.1073 / pnas.0505126102

  PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

• 17.

  МакМайкл А., Мвау М., Ханке Т: Разработка и тесты вакцины против ВИЧ. Br Med Bull 2002, 62: 87-98. 10.1093 / bmb / 62.1.87

  Артикул PubMed Google ученый

• 18.

  Burton DR: Антитела, вирусы и вакцины. Nat Rev Immunol 2002, 2: 706-713. 10.1038 / nri891

  CAS Статья PubMed Google ученый

• 19.

  Wright PE, Dyson HJ: Внутренне неструктурированные белки: переоценка парадигмы структура-функция белка. J Mol Biol 1999, 293: 321-331. 10.1006 / jmbi.1999.3110

  CAS Статья PubMed Google ученый

• 20.

  Tompa P: Внутренне неструктурированные белки. Trends Biochem Sci 2002, 27: 527-533. 10.1016 / S0968-0004 (02) 02169-2

  CAS Статья PubMed Google ученый

• 21.

  Уверский В.Н., Гиллеспи Дж. Р., Финк А.Л .: Почему «нативно развернутые» белки не структурируются в физиологических условиях? Белки 2000, 41: 415-427. 10.1002 / 1097-0134 (20001115) 41: 3 <415 :: AID-PROT130> 3.0.CO; 2-7

  CAS Статья PubMed Google ученый

• 22.

  Weinreb PH, Zhen W, Poon AW, Conway KA, Lansbury PT Jr: NACP, белок, участвующий в болезни Альцгеймера и обучении, является естественным. Биохимия 1996, 35: 13709-13715. 10.1021 / bi961799n

  CAS Статья PubMed Google ученый

• 23.

  Daughdrill GW, Pielak GJ, Uversky VN, Cortese MS, Dunker AK: Нативно неупорядоченные белки. В Справочнике по свертыванию белков . Под редакцией: Бюхнер Дж., Кифхабер Т. Вили-ВЧ, Verlag GmbH & Co. KGaA, Вайнхайм, Германия; 2005: 271-353.

  Google ученый

• 24.

  Dunker AK, Oldfield CJ, Meng J, Romero P, Yang JY, Cheng JW, Vacic V, Obradovic Z, Uversky VN: Десятилетие разворотовки: обновленная информация о внутренне неупорядоченных белках. BMC Genomics 2008, 9: S1. 10.1186 / 1471-2164-9-S2-S1

  Артикул Google ученый

• 25.

  Уверский В.Н., Олдфилд С.Дж., Дункер А.К.: Отображение вашего идентификатора: внутреннего расстройства в качестве идентификатора для распознавания, регуляции и передачи сигналов клеток. J Mol Recognit 2005, 18: 343-384. 10.1002 / jmr.747

  CAS Статья PubMed Google ученый

• 26.

  Xie H, Vucetic S, Iakoucheva LM, Oldfield CJ, Dunker AK, Obradovic Z, Uversky VN: Функциональная антология внутреннего расстройства. 3. Лиганды, посттрансляционные модификации и заболевания, связанные с внутренне неупорядоченными белками. J Proteome Res 2007, 6: 1917-1932.

  PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

• 27.

  Вукетич С., Се Х., Якучева Л.М., Олдфилд С.Дж., Дункер А.К., Обрадович З., Уверский В.Н.: Функциональная антология внутреннего расстройства. 2. Клеточные компоненты, домены, технические термины, процессы развития и разнообразие кодирующих последовательностей коррелировали с длинными неупорядоченными регионами. J Proteome Res 2007, 6: 1899-1916.

  PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

• 28.

  Xie H, Vucetic S, Iakoucheva LM, Oldfield CJ, Dunker AK, Uversky VN, Obradovic Z: Функциональная антология внутреннего расстройства. 1. Биологические процессы и функции белков с длинными неупорядоченными участками. J Proteome Res 2007, 6: 1882-1898.

  PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

• 29.

  Дункер А.К., Браун С.Дж., Лоусон Дж.Д., Якучева Л.М., Обрадович З .: Внутреннее нарушение и функция белка. Биохимия 2002, 41: 6573-6582. 10.1021 / bi012159 +

  CAS Статья PubMed Google ученый

• 30.

  Дункер А. К., Лоусон Дж. Д., Браун Си Джей, Уильямс Р. М., Ромеро П., О Дж. С., Олдфилд Си-Джей, Кэмпен А. М., Рэтлифф С. М., Хиппс К. В., Аусио Дж., Ниссен М. С., Ривз Р., Канг К., Киссинджер К. Р. , Бейли Р.В., Гризволд М.Д., Чиу В., Гарнер Е.К., Обрадович Z: Внутренне неупорядоченный белок. Модель J Mol Graph 2001, 19: 26-59. 10.1016 / S1093-3263 (00) 00138-8

  CAS Статья PubMed Google ученый

• 31.

  Dyson HJ, Wright PE: Внутренне неструктурированные белки и их функции. Nat Rev Mol Cell Biol 2005, 6: 197-208. 10.1038 / nrm1589

  CAS Статья PubMed Google ученый

• 32.

  Sickmeier M, Hamilton JA, LeGall T, Vacic V, Cortese MS, Tantos A, Szabo B, Tompa P, Chen J, Uversky VN, Obradovic Z, Dunker AK: DisProt: База данных неупорядоченных белков. Nucleic Acids Res 2007, 35: D786-793. 10.1093 / nar / gkl893

  PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

• 33.

  Ромеро П., Обрадович З., Ли Х, Гарнер Е.С., Браун С.Дж., Дункер А.К.: Сложность последовательности неупорядоченного белка. Белки 2001, 42: 38-48. 10.1002 / 1097-0134 (20010101) 42: 1 <38 :: AID-PROT50> 3.0.CO; 2-3

  CAS Статья PubMed Google ученый

• 34.

  Vucetic S, Brown CJ, Dunker AK, Obradovic Z: Вкус белкового расстройства. Белки 2003, 52: 573-584. 10.1002 / prot.10437

  CAS Статья PubMed Google ученый

• 35.

  Гарнер Е., Ромеро П., Дункер А. К., Браун С., Обрадович З .: Предсказание областей связывания в неупорядоченных белках. Genome Inform Ser Workshop Genome Inform 1999, 10: 41-50.

  CAS PubMed Google ученый

• 36.

  Obradovic Z, Peng K, Vucetic S, Radivojac P, Brown CJ, Dunker AK: Прогнозирование внутреннего нарушения на основе аминокислотной последовательности. Белки 2003, 53 (Дополнение 6): 566-572.10.1002 / prot.10532

  CAS Статья PubMed Google ученый

• 37.

  Дункер А.К., Гарнер Э., Гийо С., Ромеро П., Альбрехт К., Харт Дж., Обрадович З., Киссинджер С., Виллафранка Дж. Э .: Белковое расстройство и эволюция молекулярного распознавания: теория, прогнозы и наблюдения. Pac Symp Biocomput 1998, 473-484.

  Google ученый

• 38.

  Romero P, Obradovic Z, Kissinger CR, Villafranca JE, Garner E, Guilliot S, Dunker AK: Тысячи белков, вероятно, имеют давно неупорядоченные области. Pac Symp Biocomput 1998, 437-448.

  Google ученый

• 39.

  Oldfield CJ, Cheng Y, Cortese MS, Brown CJ, Uversky VN, Dunker AK: Сравнение и комбинирование предикторов наиболее неупорядоченных белков. Биохимия 2005, 44: 1989-2000.10.1021 / bi047993o

  CAS Статья PubMed Google ученый

• 40.

  Cheng Y, Oldfield CJ, Meng J, Romero P, Uversky VN, Dunker AK: Выявление признаков молекулярного распознавания, образующих альфа-спираль, с выравниванием последовательностей между видами. Биохимия 2007, 46: 13468-13477. 10.1021 / bi7012273

  PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

• 41.

  Goh GK-M, Dunker AK, Uversky VN: Набор инструментов для анализа внутренних нарушений белков для сравнительного анализа вирусных белков. BMC Genomics 2008, 9: S4. 10.1186 / 1471-2164-9-S2-S4

  PubMed Central Статья PubMed Google ученый

• 42.

  Radivojac P, Obradovic Z, Smith DK, Zhu G, Vucetic S, Brown CJ, Lawson JD, Dunker AK: Гибкость белка и внутреннее нарушение. Protein Sci 2004, 13: 71-80.10.1110 / пс. 03128904

  PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

• 43.

  Дункер А.К., Кортезе М.С., Ромеро П., Якучева Л.М., Уверский В.Н.: Сетки гибкие. Роль внутреннего расстройства в сетях взаимодействия белков. FEBS J 2005, 272: 5129-5148. 10.1111 / j.1742-4658.2005.04948.x

  CAS Статья PubMed Google ученый

• 44.

  Уверский ВН: Что значит быть изначально развернутым? Eur J Biochem 2002, 269: 2-12. 10.1046 / j.0014-2956.2001.02649.x

  CAS Статья PubMed Google ученый

• 45.

  Уверский В.Н.: Естественно развернутые белки: точка, в которой биология ждет физику. Protein Sci 2002, 11: 739-756. 10.1110 / пс 4210102

  PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

• 46.

  Уверский В.Н.: Возвращение к фолдингу белков. Полипептидная цепь на перекрестке складывания-неправильного складывания-несгибания: куда идти? Cell Mol Life Sci 2003, 60: 1852-1871. 10.1007 / s00018-003-3096-6

  CAS Статья PubMed Google ученый

• 47.

  Hulskotte EG, Geretti AM, Osterhaus AD: На пути к вакцине против ВИЧ-1: уроки исследований на моделях макак. Вакцина 1998, 16: 904-915.10.1016 / S0264-410X (97) 00292-2

  CAS Статья PubMed Google ученый

• 48.

  Vigerust DJ, Shepherd VL: Гликозилирование вируса: роль в вирулентности и иммунных взаимодействиях. Trends Microbiol 2007, 15: 211-218. 10.1016 / j.tim.2007.03.003

  CAS Статья PubMed Google ученый

• 49.

  Чакраварти Дж., Мехта Х., Парех А., Аттили С. В., Агравал Н. Р., Сингх С. П., Сундар С. Исследование клинико-эпидемиологического профиля пациентов с ВИЧ в восточной Индии. J Assoc Physitors India 2006, 54: 854-857.

  CAS PubMed Google ученый

• 50.

  Чернаевский Ю., Лейворд Л., Лемуан N: Борьба с раком с помощью онколитических вирусов. BMJ 2006, 332: 170-172. 10.1136 / bmj.332.7534.170

  PubMed Central Статья PubMed Google ученый

• 51.

  Берман Х.М., Вестбрук Дж., Фенг З., Гиллиланд Дж., Бхат Т.Н., Вайссиг Х., Шиндялов И.Н., Борн П.Е .: Банк данных по белкам. Nucleic Acids Res 2000, 28: 235-242. 10.1093 / nar / 28.1.235

  PubMed Central CAS Статья PubMed Google ученый

• 52.

  Пратт П.Дж., Адамски Дж.Дж.: Концепции управления базами данных . 4-е издание. Thomson Course Technology, Бостон, Массачусетс; 2002.

  Google ученый

• 53.

  Li X, Romero P, Rani M, Dunker AK, Obradovic Z: Прогнозирование нарушения белка для N-, C- и внутренних областей. Genome Inform Ser Workshop Genome Inform 1999, 10: 30-40.

  CAS PubMed Google ученый

• 54.

  Herráez A: Биомолекулы в компьютере: Jmol спешит на помощь. Биохимия и молекулярная биология Образование 2006, 34: 255-261.10.1002 / bmb.2006.494034042644

  Артикул PubMed Google ученый

Антиматричный белок [E10] | Абсолютное антитело

Инвентарный номер целевого белка UniProt: P03485; Бр05780

Альтернативное название цели: M; Матричный белок 1; Матричный белок 2; M1; M2; Белок протонного канала М2; M2-E10
Иммуноген: Это антитело было индуцировано иммунизацией мышей конъюгатом внеклеточного домена пептид матричного белка 2 (M2) и KLH.

Специфичность: Это антитело распознает белки M1 и M2 всех вирусов гриппа А. Белок M1 имеет решающее значение для сборки и образования почки, взаимодействуя с белками гемагглютинина (HA) и нейраминидазы (NA) гриппа. M2 — это трансмембранный белок, который, как было обнаружено, играет роль в репликации гриппа и сборке вирионных частиц. Было показано, что этот белок является активируемым кислотой ионным каналом для репликации вируса.

Замечания по применению: антитело E10 можно использовать как для обнаружения вирусов гриппа A, так и для идентификации белков M1 и M2. Это антитело использовали для сравнения количества белков M1 и M2 между вирусами гриппа дикого типа и рекомбинантными вирусами гриппа (Bourmakina and García-Sastre, 2005). Он также использовался в проточном цитометрическом анализе эффективности нокдауна белка M2 (Gannagé et al., 2009). Наконец, антитело E10 успешно иммуноокрашивало клетки MDCK в экспериментах по установлению титров вируса (Ramos et al., 2013).

Антитела, впервые опубликованные в: Бурмакина и Гарсия-Састре Низкие уровни белков M1 и M2 в инфицированных клетках не влияют на морфологию и состав частиц вируса гриппа A. J Virol. 2005 июнь; 79 (12): 7926-32. PMID: 15919950
Примечание к публикации: В этой статье описывается одно из первых идентифицированных применений антитела E10 для обнаружения белков M1 и M2.

рекомбинантный белок M1 | Матричный белок 1 (M) Рекомбинантный белок-NP_040978.1

NP_040978.1

[Другие продукты] NCBI GenBank Нуклеотид №

[Другие продукты] UniProt, первичный регистрационный номер

[Другие продукты] Вторичный регистрационный номер UniProt № UniProt Соответствующий номер доступа № NCBI Официальное полное имя матричный белок 1 Информация о белках NCBI M1 Название протеина UniProt Матричный белок 1 Синонимы UniProt Имена генов Комментарии UniProt для M1 Играет критически важную роль в репликации вируса, от проникновения вируса и удаления оболочки до сборки и отпочкования вирусной частицы.Связывание M1 с рибонуклеокапсидами (RNP) в ядре, по-видимому, ингибирует вирусную транскрипцию. Считается, что взаимодействие вирусного NEP с M1-RNP способствует ядерному экспорту комплекса, который нацелен на сайт сборки вириона на апикальной плазматической мембране в поляризованных эпителиальных клетках. Взаимодействие с NA и HA может привести к липидным рафтам M1, протеин, не связанный с рафтами. Образует непрерывную оболочку на внутренней стороне липидного бислоя вириона, где он связывает РНП. Во время проникновения вируса в клетку ионный канал M2 подкисляет внутреннее ядро ​​вириона, вызывая диссоциацию M1 от RNP.РНП без M1 транспортируются в ядро, где могут иметь место транскрипция и репликация вируса. Меры предосторожности Все продукты MyBioSource предназначены для научных лабораторных исследований и не предназначены для диагностического, терапевтического, профилактического или in vivo использования. Совершая покупку, вы прямо заявляете и гарантируете MyBioSource, что вы будете надлежащим образом тестировать и использовать любые Продукты, приобретенные у MyBioSource, в соответствии с отраслевыми стандартами. No related posts. Предыдущая запись На сколько хватит 1 кг протеина: 1 кг протеина: на сколько хватит, как рассчитать потребление протеина в сутки, его состав, плюсы и минусы использования и положительный результат Следующая запись Разновидность протеина: Виды протеинов и их различия в спортивном питании — интернет-магазин Чиф и Шериф Добавить комментарий Отменить ответ Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены * * * 2015-2019 © MULTI CROSS - интернет-магазин одежды для спорта и отдыха. РФ, г. Новосибирск Карта сайта Найти: