Matrix протеин: Matrix 5.0 от Syntrax — цена: от 1 692 руб. — купить протеин недорого в Москве

Рисунок эукариотической клетки в разрезе.

Молекулы клеток

Понять, как клеточные мембраны регулируют потребление пищи и отходы и как клеточные стенки обеспечивают защиту

Клетки поглощают молекулы через свои плазматические мембраны.

Клетки содержат особый набор молекул, которые заключены в мембрану. Эти молекулы дают клеткам возможность расти и воспроизводиться. Общий процесс клеточного воспроизводства происходит в два этапа: рост клеток и деление клеток. Во время роста клетки клетки поглощают определенные молекулы из своего окружения, избирательно перенося их через клеточную мембрану. Попав внутрь клетки, эти молекулы подвергаются действию узкоспециализированных, больших, тщательно свернутых молекул, называемых ферментами.Ферменты действуют как катализаторы, связываясь с проглоченными молекулами и регулируя скорость их химического изменения. Эти химические изменения делают молекулы более полезными для клетки. В отличие от проглоченных молекул, катализаторы сами химически не изменяются во время реакции, что позволяет одному катализатору регулировать конкретную химическую реакцию во многих молекулах.

Биологические катализаторы создают цепочки реакций. Другими словами, молекула, химически преобразованная одним катализатором, служит исходным материалом или субстратом для второго катализатора и так далее.Таким образом, катализаторы используют небольшие молекулы, принесенные в клетку из внешней среды, для создания все более сложных продуктов реакции. Эти продукты используются для роста клеток и воспроизведения генетического материала. После копирования генетического материала и наличия достаточного количества молекул для поддержки деления клетки клетка делится, образуя две дочерние клетки. Через множество таких циклов клеточного роста и деления каждая родительская клетка может дать начало миллионам дочерних клеток, в процессе преобразования больших количеств неодушевленного вещества в биологически активные молекулы.

Сравнительный анализ белков вирусного матрикса с использованием предикторов нарушения | Журнал вирусологии

Нативная структура собранного матричного белка 1 вируса гриппа A

Матричный белок рабдовируса растений опосредует исключение суперинфекции путем ингибирования вирусной транскрипции

РЕЗЮМЕ

Исключение суперинфекции (SIE) или феномен перекрестной защиты документированы для вирусов растений уже почти столетие и широко распространены среди таксономически разнообразных вирусов. но мало информации доступно о SIE вирусов РНК с отрицательной цепью растений.Здесь мы демонстрируем, что SIE вируса желтого нетто-нуклеорабдовируса сонха (SYNV) опосредуется белком вирусной матрицы (M), многофункциональным белком, участвующим в регуляции транскрипции, сборке вирионов и почковании вируса. Мы показываем, что варианты SYNV, меченные флуоресцентными белками, проявляют взаимное исключение / перекрестную защиту в растениях Nicotiana benthamiana. Временная экспрессия белка SYNV M, но не других вирусных белков, препятствовала локальным инфекциям SYNV. Кроме того, мутанты с делецией SYNV M не смогли исключить суперинфекцию SYNV дикого типа.Анализ экспрессии репортерного гена минирепликона SYNV показал, что белок М ингибирует вирусную транскрипцию. Однако мутанты М-белка с ослабленными сигналами ядерной локализации (NLS) и недостаточными ядерными взаимодействиями с нуклеокапсидным белком SYNV были неспособны подавлять транскрипцию. Более того, SYNV с мутациями M NLS обнаруживает скомпрометированный SIE против SYNV дикого типа. Исходя из этих данных, мы предполагаем, что М-белок, накапливающийся в ядрах с первичными инфекциями SYNV, либо скручивает, либо предотвращает раскручивание нуклеокапсидов, высвобождаемых суперинфицирующими вирионами SYNV, и подавляет транскрипцию суперинфицирующих геномов, тем самым предотвращая суперинфекцию.Наша модель предполагает, что белок рабдовируса М регулирует переход от репликации к сборке вирионов и делает инфицированные клетки непозволительными для вторичных инфекций.

ВАЖНОСТЬ Исключение суперинфекции (SIE) — широко распространенное явление, при котором установленная вирусная инфекция предотвращает повторное заражение близкородственными вирусами. Понимание механизмов, управляющих SIE, не только расширит наши базовые знания о циклах вирусной инфекции, но также может привести к улучшению разработки противовирусных мер.Несмотря на важность SIE, наши знания о вирусных детерминантах SIE и способах их действия остаются ограниченными. В этом исследовании мы показываем, что SIE вируса желтой сети сонха (SYNV) опосредуется белком вирусного матрикса (M). Во время первичных инфекций накопление белка М в инфицированных ядрах приводит к свертыванию геномных нуклеокапсидов и подавлению вирусной транскрипции. Следовательно, нуклеокапсиды, выделяемые потенциальными суперинфекторами, секвестрируются и не могут инициировать новые инфекции.Наши данные предполагают, что SYNV SIE вызывается опосредованным M-белком переходом от репликации к сборке вирионов и что этот процесс предотвращает вторичные инфекции.

ВВЕДЕНИЕ

Исключение суперинфекции (SIE) — это широко описанный феномен вирус-вирусного взаимодействия, при котором первичная вирусная инфекция (первичный захватчик) предотвращает последующее заражение инфицированных клеток тем же или родственным вирусом (вторичный захватчик). SIE широко задокументирован для вирусов, начиная от бактериофагов (1, 2) и заканчивая вирусными патогенами млекопитающих (3–6) и вирусами растений (см. Ссылки 7 и 8).С вирусами человека и животных эксперименты SIE часто проводились in vitro с культивированными клетками, а эффекты исключения изучались в первую очередь на клеточном уровне. Было показано, что процессы проникновения контрольных вирусов влияют на SIE в вирусе саркомы Рауса, вирусе вирусной диареи крупного рогатого скота, вирусе осповакцины, вирусе гриппа человека и вирусе иммунодефицита человека (9–13). Ингибирование репликации и / или транскрипции вируса также наблюдалось во время постентарных стадий с вирусом Синдбис, вирусом гепатита С и вирусом Западного Нила (14-18).Кроме того, первичный захватчик может вмешиваться в трансляцию белка или морфогенез вторичного вируса-захватчика (16, 19).

Феномен, механистически связанный с SIE, но проявляющийся на уровне всего растения, — это перекрестная защита у зараженных вирусом растений (7, 8). Во время перекрестной защиты растения, инокулированные мягкими изолятами или штаммами вируса, вызывают устойчивость к вторичным инфекциям у более тяжелых изолятов, существующих в природе (8, 20, 21). Перекрестная защита была первоначально описана для вируса табачной мозаики (TMV) в конце 1920-х годов (22) и с тех пор широко задокументирована для многих других видов вирусов растений (см. Ссылку 21).В сельскохозяйственной практике для борьбы с болезнями применялась перекрестная защита, обеспечиваемая мягкими штаммами вирусов, при этом заметные успехи были достигнуты в борьбе с вирусами, поражающими многолетние культурные растения. К ним относятся вирус опухших побегов какао на какао (23), вирус кольцевой пятнистости папайи на папайе (24) и вирус тристезы цитрусовых (CTV) на цитрусовых (7, 25). Однако, несмотря на обширные исследования, лежащие в основе механизмы, ведущие к перекрестной защите, еще предстоит должным образом изучить и могут включать вмешательство в вирусные взаимодействия, а также механизмы защиты хозяина, сдерживающие инфекцию на клеточном или тканеспецифическом уровне (пересмотрено в ссылках 8 и 21).

Ранние исследования перекрестной защиты включали последовательную инокуляцию мягкого штамма первичного вируса с последующей контрольной инокуляцией более тяжелым штаммом и последующей оценкой защиты путем обследования симптомов и / или молекулярного обнаружения вторичного захватчика. С появлением клонов инфекционных вирусов сконструированные рекомбинантные вирусы растений, экспрессирующие маркеры визуальной дискриминации, такие как зеленые и красные флуоресцентные белки (GFP и RFP, соответственно), оказались более элегантными инструментами для изучения пространственно-временных взаимодействий вирусов как в клетках, так и в тканях. уровни.Например, когда производные вируса оспы сливы, меченные GFP и RFP, были совмещены с растениями, флуоресцентные маркеры продемонстрировали, что два вируса сосуществовали в одних и тех же листьях растений, но показали, что они занимают в основном неперекрывающиеся кластеры клеток (26). Подобное пространственное разделение или взаимное исключение между вариантами одного и того же вируса наблюдалось для латентного сферического вируса яблони и вируса желтой мозаики фасоли (27, 28), TMV (29, 30), вируса мозаики пшеницы, передаваемого через почву (31), вируса мозаики полос пшеницы. (WSMV) и вирус мозаики Triticum (TriMV) (32) и вирус морщинки репы (TCV) (33).Однако, когда эти вирусы с разными метками были инокулированы последовательно, первичная вирусная инфекция полностью блокировала последующее заражение вторичным захватчиком на уровне всего растения (34–41). Эти наблюдения подтверждают идею о том, что взаимное исключение или SIE происходит на клеточном уровне, и предполагают, что перекрестная защита является проявлением SIE на уровне организма (8).

Несколько исследований показали, что белки, кодируемые растительным вирусом, могут в достаточной мере, если не исключительно, учитывать перекрестную защиту / SIE.Примеры вирусных детерминант включают белок оболочки (CP) TMV (42), протеиназу вспомогательного компонента (HC-Pro) и CP в вирусе A картофеля (43), протеазу CP и Nia (NIa-Pro) в WSMV и TriMV (32 ), p33 и лидерные протеазы L1 / LII в CTV (38, 44) и p28 в TCV (33). В сельскохозяйственном производстве осознание важности кодируемых вирусами факторов в перекрестной защите / SIE привело к разработке трансгенных противовирусных культур, которые могут защитить растения в поле (45, 46). Хотя подробные молекулярные механизмы, лежащие в основе SIE, не были определены в большинстве исследований, известно, что это явление тесно связано с жизненным циклом вируса.Однако недавнее исследование Zhang et al. (33) предоставило элегантную модель для объяснения TCV p28-опосредованного SIE. В этой модели белки p28 TCV, продуцируемые первичными инфекциями, образуют подвижные многомерные комплексы зависимым от концентрации образом, которые функционируют, чтобы изолировать вновь синтезированные белки p28 из суперинфектора, тем самым предотвращая репликацию последнего в тех же клетках. Последующее исследование, проведенное той же группой, показало, что продукт считывания p28 TCV p88, вирусная РНК-зависимая РНК-полимеризация, также демонстрирует зависимую от концентрации репрессию репликации вируса (47).

Хотя феномен SIE был изучен для нескольких РНК-вирусов растений с положительной цепью, для растений с РНК-вирусами с отрицательной цепью нет определенной информации. Вирус желтой сети Sonchus (SYNV) представляет собой широко изученный несегментированный вирус с отрицательной цепью РНК, принадлежащий к роду Nucleorhabdovirus , семейству Rhabdoviridae . Геном SYNV кодирует пять структурных белков, обозначаемых нуклеопротеином (N), фосфопротеином (P), матричным белком (M), гликопротеином (G), белком большой РНК-полимеразы (L) и белком движения, sc4, расположенных в заказать NP-sc4-MGL (48–51).В отличие от многих других рабдовирусов, поражающих позвоночных и растения, нуклеорабдовирусы, включая SYNV, подвергаются репликации и морфогенезу вирионов в ядрах инфицированных клеток. При попадании в клетку нуклеокапсиды (NC), высвобождаемые из вирусных частиц, нацелены на ядра, где инициируются первичные раунды транскрипции вирусной мРНК. Вирусные белки, транслируемые с этих мРНК, необходимы для инициации репликации генома для получения антигеномных РНК (агРНК), которые впоследствии используются в качестве матрицы для прямого синтеза геномных РНК (гРНК).И гРНК, и агРНК инкапсидируются во время репликации ядерными белками N, P и L с образованием потомства gNCs и agNCs. Поскольку происходят дополнительные раунды вторичной транскрипции и репликации генома, накопление NCs приводит к образованию больших вироплазм в ядрах (см. Ссылки 49 и 52). На более поздних стадиях репликации накапливающиеся М-белки предположительно функционируют, чтобы скручивать gNC и собираться в вирусные ядра. Благодаря взаимодействиям между карбоксиконцевым хвостом белков M и G, конденсированные ядра NC направляются на внутренние поверхности ядерных мембран, от которых они отталкиваются, чтобы сформировать обволакивающие пулевидные или палочковидные частицы, которые накапливаются в перинуклеарных пространствах (53, 54).

В этой статье мы использовали сконструированные GFP- и RFP-меченные рекомбинантные варианты SYNV (rSYNV), чтобы показать, что инфекции SYNV вызывают устойчивый SIE у экспериментального хозяина Nicotiana benthamiana. Мы также использовали эктопическую экспрессию белка М и мутантных производных, чтобы показать, что белок М является первичной детерминантой вирусного SIE и выполняет функцию ингибирования транскрипции NC. Эти результаты представляют собой модель, посредством которой белок М, накапливающийся в ядрах, инфицированных первичным вторгающимся производным SYNV, взаимодействует с поступающими вторичными вторгающимися NC SYNV, чтобы исключить суперинфекцию клеток.

РЕЗУЛЬТАТЫ

вариантов SYNV, меченных различными флуоресцентными белками, демонстрируют реципрокный SIE. Чтобы исследовать возможный SIE с помощью SYNV, мы использовали клоны rSYNV-GFP и rSYNV-RFP для экспрессии маркеров GFP и RFP (рис. 1A) для визуализации инфекции и движения. . Производные rSYNV отдельно спасали в растениях N. benthamiana после агроинфекции, как описано ранее (51). Равные объемы инфекционных соков из листьев, инфицированных rSYNV-GFP и rSYNV-RFP, смешивали и механически коокулировали на нижние листья здоровых N.растения бентамиана. Через 12 дней после инокуляции (dpi) флуоресценция как GFP, так и RFP была обнаружена с помощью флуоресцентной микроскопии в верхних неинокулированных листьях, что указывает на то, что оба вируса инфицировали растения системно. Однако rSYNV-GFP и rSYNV-RFP на этих листьях занимали отдельные тканевые «островки», которые демонстрировали четкие границы, при этом менее 2% соседних клеток в пограничных областях проявляли флуоресценцию как GFP, так и RFP (Рис. 1B). Чтобы отслеживать взаимодействия вариантов rSYNV в локально инфицированных листьях, мы провели отдельную серию экспериментов по коинфекции, в которых штаммы Agrobacterium tumefaciens, несущие плазмиды, необходимые для выделения rSYNV-GFP и rSYNV-RFP, совместно фильтровались в N.листья бентамианы. Оба варианта rSYNV были выделены в одних и тех же листьях, судя по экспрессии GFP и RFP при 8 dpi, и изолированные одноклеточные очаги начали распространяться на соседние клетки (см. Ссылку 51 и данные не показаны). При 15 dpi, когда происходило обширное перемещение от клетки к клетке, некоторые из расширяющихся фокусов GFP и RFP сходились, и отдельные вирусы на краях занимали смежные клетки, но клетки редко проявляли флуоресценцию обоих репортерных белков (рис. 1C). Эти наблюдения показывают, что варианты SYNV с разными метками обнаруживают взаимное исключение на клеточном уровне.

Взаимное исключение вариантов SYNV, помеченных GFP и RFP, у N. benthamiana. (A) Схематические диаграммы, показывающие антигеномы rSYNV, сконструированные для экспрессии GFP (rSYNV-GFP) и RFP (rSYNV-RFP). (B) Изображения z-стека конфокальной микроскопии, показывающие пространственное разделение флуоресцентных фокусов GFP и RFP в верхних системно инфицированных листьях растений N. benthamiana, снятых через 12 дней после инокуляции (dpi) экстрактом листьев, содержащим смеси rSYNV-GFP и rSYNV-RFP. На нижних панелях показаны области, выделенные рамкой, с большим увеличением.Пруток, 100 мкм. (C) Конфокальная микроскопия изображения z-стека смежных фокусов GFP и RFP в ткани листа N. benthamiana с разрешением 15 dpi с агробактериальными смесями, содержащими производные rSYNV-RFP и rSYNV-GFP. Правые панели показывают увеличенные изображения секторов в рамке слева, чтобы выделить границы исключения rSYNV-GFP и rSYNV-RFP в соседних ячейках двух фокусов. Пруток, 50 мкм. (D) Флуоресценция GFP и RFP в верхних листьях растений N. benthamiana после первоначальной инокуляции сока одним вариантом SYNV или имитационной инокуляции с последующей контрольной инокуляцией другим вариантом SYNV, указанной в левой части панелей, через 12 дней.Изображения получали с помощью стереофлуоресцентного микроскопа с каналами GFP или RFP через 20 дней после первичной инокуляции и снова через 20 дней после контрольной инокуляции. 1-й, первичный посевной материал; 2-й, контрольный посевной материал. Пруток, 2 мм. (E) Конфокальная микроскопия листьев N. benthamiana после первоначальной инокуляции сока с помощью rSYNV-RFP с последующей контрольной инокуляцией PVX-GFP через 6 дней. Изображения показывают перекрывающуюся флуоресценцию GFP и RFP в верхних инфицированных листьях, снятых через 6 дней после заражения PVX. Пруток, 100 мкм.

Затем мы провели вторую серию экспериментов по заражению, в которых нижние листья N. benthamiana были механически инокулированы, чтобы вызвать инфекции rSYNV-RFP, с последующей второй инокуляцией, проведенной через 12 дней в верхние листья, чтобы инициировать инфекции rSYNV-GFP. К 20 дню после второй инокуляции недавно разросшиеся верхние листья проявляли только флуоресценцию RFP (рис. 1D, верхний ряд). Напротив, первичная инфекция rSYNV-GFP полностью блокировала вторичную инфекцию rSYNV-RFP (рис.1Д, третий ряд). В контрольных экспериментах, в которых растения N. benthamiana сначала натирали соком из здоровых листьев, вторичные инокуляции через 12 дней либо rSYNV-GFP, либо rSYNV-RFP приводили к продуктивным инфекциям (рис. 1D, второй и нижний ряды). В другом контрольном эксперименте мы сначала инокулировали инфекционный сок rSYNV-RFP на нижние листья растений N. benthamiana и через 6 дней заражали верхние листья вирусом X (PVX) -GFP картофеля. При разрешении 12 dpi многочисленные клетки верхних листьев были коинфицированы rSYNV-RFP и PVX-GFP, что обозначено желтым цветом, наложенным на изображения GFP и RFP (рис.1E). Эти результаты ясно показывают, что первичное инфицирование вариантом rSYNV защищает растения от последующего вторичного заражения другим вариантом SYNV, но не предотвращает заражение неродственным PVX.

Сверхэкспрессия белка M ингибирует локальную инфекцию SYNV. Если SYNV SIE опосредуется одним или несколькими вирусными белками, мы предположили, что эктопическая экспрессия белков SYNV будет мешать инфекциям rSYNV. Чтобы проверить эту возможность, гены белков SYNV N, P, sc4, M и G были вставлены в вектор двойной экспрессии, pGD-X / GFP, который также содержит кассету экспрессии GFP, встроенную в ДНК-переносчик (T-ДНК). область, чтобы обеспечить коэкспрессию каждого белка SYNV и GFP после агроинфильтрации.Белок SYNV L не был включен в это исследование, потому что мы не смогли экспрессировать его до обнаруживаемых уровней из-за его большого размера (242 кДа). Чтобы определить, влияет ли коэкспрессия белков SYNV на локализованное распространение SYNV, мы проследили движение фокусов rSYNV-RFP в агроинфильтрованных листьях с помощью флуоресцентной микроскопии. Как наблюдалось ранее (51), одноклеточные фокусы RFP появлялись при 8 dpi, а затем распространялись на соседние клетки на 12 dpi (рис. 2A). Считалось, что в фокусах, экспрессирующих флуоресценцию GFP при 12 dpi, одновременно экспрессируются вирусные белки и GFP, что было дополнительно подтверждено вестерн-блоттингом тканевых экстрактов с использованием антител против вирусных белков и GFP (рис.2Б).

Ингибирование локализованных инфекций rSYNV-RFP путем эктопической экспрессии белков SYNV. (A) Наблюдение с помощью флуоресцентной микроскопии листьев N. benthamiana после агроинфильтрации для инициации локальных инфекций rSYNV и для экспрессии каждого из белков SYNV N, P, sc4, M и G или пустого векторного контроля. Обратите внимание, что каждый из вирусных белков был экспрессирован из двойной бинарной плазмиды, которая также содержит кассету экспрессии GFP для визуализации инфильтрированных участков листа. Инфильтрованные листья наблюдали под стереофлуоресцентным микроскопом при 8 dpi и снова при 12 dpi для оценки местных инфекций в течение 4-дневного периода движения.Две верхние панели показывают экспрессию RFP, а нижняя панель показывает объединенные изображения экспрессии RFP и GFP в клетках листа, окружающих фокусы RFP rSYNV. Пруток, 200 мкм. (B) Вестерн-блоттинг для определения уровней экспрессии GFP и присутствия вирусных белков с использованием поликлональных антител против вирионов SYNV (α: SYNV), sc4 (α: sc4) и GFP (α: GFP). Окрашенную большую субъединицу RuBisCO использовали в качестве контроля загрузки. (C) Расчет среднего количества клеток, экспрессирующих RFP, на очаг инфекции rSYNV-RFP при 12 dpi.Столбцы представляют собой стандартные отклонения. Звездочки обозначают статистическую значимость ингибирования белка М по критерию Стьюдента t ( P <0,001; n = 24). (D) Наблюдение за локальным движением PVX-GFP, кофильтрованного с SYNV M или пустым вектором при 60 hpi и 6 dpi, с помощью флуоресцентного микроскопа. Пруток, 200 мкм. (E) Вестерн-блоттинг уровней экспрессии GFP в тканях листа, инфильтрованных PVX-GFP с белком SYNV M или без него, при 6 dpi. Окрашенную большую субъединицу RuBisCO использовали в качестве контроля загрузки.(F) Расчет средних площадей очагов инфекции PVX-GFP при 6 dpi. NS: статистически недостоверно ( P > 0,05; n = 20) по результатам анализа с помощью теста Стьюдента t .

Коэкспрессия белка M привела к значительному уменьшению локализованного распространения rSYNV-RFP, тогда как коэкспрессия белков N, P, sc4 или G оказала незначительное влияние на распространение rSYNV-GFP (рис. 2A). Статистический анализ увеличения количества клеток, экспрессирующих RFP, между 8 и 12 днями показал, что эктопическая экспрессия белка M ингибировала транспорт SYNV от клетки к клетке примерно на 2.В 0–2,5 раза по сравнению с движением в ткани, содержащей эктопически экспрессируемый белок SYNV N, P, sc4 или G или отрицательный контроль (рис. 2С). Чтобы исключить возможность того, что эктопически экспрессируемый белок M ингибирует движение SYNV, неспецифически воздействуя на клетки-хозяева, например, ингибируя синтез белка, мы протестировали влияние белка M на локальное перемещение PVX-GFP, вируса, который не отображает SIE с SYNV. (Рис. 1E). В аналогичных условиях временной экспрессии белок SYNV M оказывал незначительное влияние на движение PVX-GFP (рис.2D). Этот вывод был дополнительно подтвержден анализом белкового гель-блоттинга уровней GFP (фиг. 2E) и количественным анализом средней площади очагов инфекции PVX-GFP (фиг. 2F) при 6 dpi. Таким образом, эти результаты предполагают, что эктопическая экспрессия белка М специфически ингибирует локальные инфекции SYNV.

делеционные мутанты SYNV M демонстрируют скомпрометированный SIE. Для дальнейшего изучения участия белка M в SYNV SIE мы проверили, влияет ли мутант rSYNV-RFP с делецией в гене M (rSYNV-RFP-ΔM) на SIE, анализируя способность мутантного вируса для предотвращения суперинфекции rSYNV-GFP.В качестве контроля в этот эксперимент был включен мутант с делецией SYNV G (rSYNV-RFP-ΔG), поскольку белки G и M играют совместную роль в почковании и созревании вирионов (54). Следовательно, листья N. benthamiana были инфильтрированы смесями агробактерий, несущих плазмиды, необходимые для одновременного восстановления rSYNV-GFP и либо rSYNV-RFP, rSYNV-RFP-ΔM, либо rSYNV-RFP-ΔG. Клетки, экспрессирующие GFP и / или RFP на границах сливающихся фокусов, визуализировали с помощью флуоресцентной микроскопии при 15 dpi для оценки взаимодействий SIE между производными SYNV.Как показано на фиг. 3, красные и зеленые флуоресцентные сигналы в листьях, коинфицированных rSYNV-GFP и rSYNV-RFP, всегда были пространственно разделены в соседних фокусах эпидермальных клеток листа. Подобные отдельные паттерны распределения флуоресценции наблюдались в соседних очагах листьев, коинфицированных rSYNV-GFP и rSYNV-RFP-ΔG. Напротив, значительная часть клеток, расположенных на границах фокусов rSYNV-GFP и rSYNV-RFP-ΔM, проявляла флуоресценцию как GFP, так и RFP (рис.3, белые стрелки), что позволяет предположить, что SIE был менее распространен в rSYNV-RFP. -ΔM инфекции.

Идентификация белка SYNV M как детерминанты исключения вирусной суперинфекции (SIE). Листья N. benthamiana были коинфицированы посредством агроинокуляции парой rSYNV-GFP и rSYNV-RFP, rSYNV-GFP и rSYNV-RFP-ΔM, rSYNV-GFP и rSYNV-RFP-ΔG или rSYNV-GFP и rSYNV11. UAA . Смежные фокусы GFP и RFP в инокулированных тканях листа с разрешением 15 dpi визуализировали с помощью конфокальной микроскопии, чтобы показать исключение флуоресценции между фокусами. Белые стрелки указывают граничные ячейки, экспрессирующие как GFP, так и RFP.Пруток, 100 мкм.

Для получения дополнительной аналитической информации количество клеток, коинфицированных rSYNV-GFP / rSYNV-RFP, и клеток, инфицированных rSYNV-GFP / rSYNV-RFP-ΔM или rSYNV-GFP / rSYNV-RFP-ΔG, сравнивали в трех независимых экспериментах. . Таблица 1 показывает, что средний процент граничных клеток, демонстрирующих флуоресценцию как GFP, так и RFP, увеличился до ~ 25% для инфекций rSYNV-GFP / rSYNV-RFP-ΔM, в отличие от ~ 1,5% для инфекций rSYNV-GFP / rSYNV-RFP и 1,9% для rSYNV-GFP / rSYNV-RFP-ΔG.Эти данные показывают, что делеция гена белка М приводит к значительному снижению активности SYNV SIE.

Процент граничных клеток, коинфицированных производными rSYNV-GFP и rSYNV-RFP в инокулированных листьях Nicotiana benthamiana

Чтобы определить, требуется ли последовательность РНК или белок, кодируемый геном M, в SIE, мы создали rSYNV-RFP -M _UAA , в котором кодон инициации AUG цистрона M был изменен на стоп-кодон UAA для исключения трансляции белка.При коинфекции rSYNV-GFP в листьях N. benthamiana мутант rSYNV-RFP-M _UAA также проявлял скомпрометированную способность к SIE, поскольку флуоресценция RFP и GFP была очевидна в одних и тех же клетках (рис. 3, нижний ряд). Количественный анализ показал, что около 21% пограничных клеток проявляли флуоресценцию как GFP, так и RFP в тканях, коинфицированных rSYNV-GFP / rSYNV-RFP-M _UAA (Таблица 1). Взятые вместе, эти данные указывают на то, что белок SYNV M, а не последовательность РНК, отвечает за активность SIE.

Белок SYNV M подавляет транскрипцию вирусных мРНК. Исследования рабдовирусов животных показали, что белок M этих вирусов подавляет транскрипцию вирусов как in vitro , так и in vivo (55–58). Чтобы оценить, может ли репрессия транскрипции учитывать M-опосредованный SIE при инфекциях SYNV, мы затем проверили, подавляет ли белок SYNV M транскрипцию геномной РНК SYNV, используя систему минирепликона (MR), которая, как было показано ранее, воспроизводит синтез аутентичной вирусной РНК (59). .В системе SYNV MR вирусные РНК-подобные транскрипты MR, кодирующие репортерные гены GFP и RFP, заменяют цистроны N и P (рис. 4A). Листья N. benthamiana подвергали агроинфильтрации смесями бактерий, несущих плазмиды, для экспрессии геномно-смысловых транскриптов MR [негативный MR, (-) MR] и ядерных белков N, P и L, а также трех вирусных супрессоров подавления РНК ( VSR), как описано ранее (59). При доставке конструкций, экспрессирующих вирусные компоненты, одноклеточные очаги, экспрессирующие как репортерные белки GFP, так и RFP, наблюдались во всех инфильтрированных областях листьев с разрешением 8 dpi (рис.4Б). Когда SYNV MR коэкспрессировался в комбинации с геном белка М, количество очагов, демонстрирующих оба репортерных белка, уменьшалось в 50 раз по сравнению с уровнем контроля с пустым вектором (фиг. 4B и C). В качестве дополнительных контролей совместная экспрессия SYNV MR либо с мутантом M _UAA , либо с белком sc4 оказала незначительное влияние на экспрессию репортерного гена из SYNV MR. Анализ протеинового гель-блоттинга показал, что ядерные белки N и P, которые необходимы для функций MR, были экспрессированы до аналогичных уровней в инфильтрированных тканях листа с эктопической экспрессией M-белка или без нее.Также были подтверждены pGD-опосредованная экспрессия белков M и sc4 и отсутствие трансляции белка M мутантом M _UAA (фиг. 4D). Белковые блоты также подтвердили, что уровни белков GFP и RFP в тканях листа, коэкспрессирующих белок М, были значительно снижены по сравнению с коэкспрессией sc4, M _UAA или пустого вектора (фиг. 4D). Поскольку gNC, собранные из (-) MR транскриптов и основных белков в инфильтрированных тканях листа, могут участвовать в синтезе вирусной РНК, образцы тотальной РНК, выделенные из инфильтрированных тканей, были гибридизированы с зондом GFP для обнаружения агРНК и мРНК GFP (рис.4E). Гель-блот РНК выявил полосу, размер которой аналогичен маркеру размера агРНК MR из 1791 нуклеотидов (нт) в тканях листа, экспрессирующих белок N, P и L, а также транскрипты (-) MR. Кроме того, также была обнаружена другая полоса, мигрирующая немного медленнее, чем 720-нуклеотидная маркерная РНК GFP. Эта полоса соответствует размеру мРНК MR GFP, которая, как ожидается, будет содержать 5′-нетранслируемую область и 3′-поли (A) последовательности. Экспрессия белка M, но не белка M _UAA или sc4, резко снизила агРНК MR и мРНК GPF до уровней, аналогичных уровням в образце отрицательного контроля, в котором три основных белка не экспрессировались (-NPL) .В качестве дополнительного контроля мы показали, что белок SYNV M, по-видимому, не влиял на экспрессию репортерного гена GFP из неродственного репликона PVX-GFPΔp25, в котором ген белка движения p25 был заменен геном GFP (рис. 4F и G), что позволяет предположить что ингибирующий эффект белка М вирусспецифичен. Вместе эти результаты предполагают, что эктопическая экспрессия белка М значительно подавляет синтез вирусной РНК из матриц gNC.

Подавление вирусной транскрипции белком М в системе минирепликона SYNV (MR).(A) Схематические диаграммы генома SYNV и кассеты MR отрицательного смысла. (-) MR содержит 3′-лидерные (le) и 5′-концевые (tr) последовательности, фланкирующие репортерные гены GFP и RFP, замещенные генами SYNV N и P. (B) Визуализация репортерных белков GFP и RFP в листьях N. benthamiana, подвергнутых агроинфильтрации с культурами Agrobacterium , несущими плазмиды для экспрессии SYNV MR и ядерных белков N, P и L. Дополнительные бактериальные культуры, содержащие пустой вектор (Vec), плазмиды pGD-M, pGD-M _{, UAA} и pGD-sc4, как указано в верхней части каждой панели, также были включены в смеси для проверки их влияния на экспрессию репортера. .Инфильтрованные листья фотографировали с разрешением 8 dpi с помощью флуоресцентного микроскопа. Пруток, 200 мкм. (C) Среднее количество клеток на поле, экспрессирующих GFP и RFP при 8 dpi при каждой обработке SYNV MR. Столбцы представляют собой стандартные отклонения. Звездочкой обозначена значимость теста Стьюдента t ингибирования транскрипции белком М ( P <0,001; NS, не значимо; n = 12). (D) Вестерн-блоттинг, подтверждающий экспрессию GFP и RFP в каждой группе. Экспрессию ядерных белков N и P или белка M или sc4 детектировали с помощью поликлональных антител против вириона SYNV или против белка sc4, соответственно.Большая субъединица RuBisCO, окрашенная кумасси синим, обеспечивает контроль загрузки. (E) Нозерн-блот-гибридизация, демонстрирующая ингибирующие эффекты белка М на синтез SYNV MR РНК. Тотальную РНК, экстрагированную из тканей листа N. benthamiana, показанную на панели B, подвергали блоттингу с помощью зонда GFP с отрицательным смыслом для обнаружения агРНК MR и мРНК GFP. РНК из тканей листа, инфильтрированных (-) MR в отсутствие белков N, P и L, использовали в качестве отрицательного контроля. In vitro транскриптов T7, соответствующих по размеру GFP и MR agRNA (agMR), использовали в качестве маркеров размера.25S рРНК окрашивали бромидом этидия, чтобы показать равную нагрузку РНК. (F и G) Отсутствие ингибирующих эффектов белка SYNV M на экспрессию репортерного гена GFP из репликона PVX. Листья N. benthamiana подвергали агроинфильтрации смесями штаммов Agrobacterium , несущих плазмиду PVX-GFPΔp25 вместе с pGD-M или пустым вектором. Одноклеточные фокусы GFP визуализировали с помощью флуоресцентного микроскопа с разрешением 3 dpi, рассчитывали среднее количество клеток на поле и анализировали статистическую значимость с помощью теста Стьюдента t .NS, статистически недостоверно ( P > 0,05; n = 12).

Мутанты SYNV M, дефектные по ядерной локализации, не могут ингибировать вирусную транскрипцию. Репликация SYNV и созревание вириона происходят в инфицированных ядрах, в которых также локализован M-белок (53, 54). Последовательность белка М ( ²²⁶ GKVVRKRKSRK ²³⁶ ) была постулирована Jackson et al. (49), чтобы служить сигналом ядерной локализации (NLS). Чтобы расширить эту гипотезу, мы использовали компьютерный алгоритм PSORT (https: // wolfpsort.hgc.jp/), чтобы идентифицировать четыре последовательные основные аминокислоты, ²³⁰ RKRK ²³³ , в качестве ключевых остатков NLS. Чтобы проверить NLS-функцию этих остатков, мы мутировали остатки ²³⁰ RKRK ²³³ в ²³⁰ RARA ²³³ и ²³⁰ AAAA ²³³ , чтобы получить мутанты M _RARA и M _AAAA . При слиянии с голубым флуоресцентным белком (CFP) и временной экспрессии в эпидермальных клетках N. benthamiana белок М дикого типа локализуется исключительно в ядрах, тогда как мутанты M _RARA и M _AAAA проявляют как цитоплазматическую, так и ядерную локализацию. (Рисунок.5А). Эти данные демонстрируют, что мотив RKRK играет важную роль в ядерном импорте М-белка. Затем мы использовали двухмолекулярную комплементацию флуоресценции (BiFC), чтобы определить, взаимодействуют ли белки М дикого типа и мутировавшие М белки с белком N и где эти взаимодействия расположены. Как и ожидалось, N-M взаимодействия были обнаружены только в ядрах, где они были связаны с крупными субядерными включениями. Напротив, сигналы взаимодействия N-M _RARA и N-M _AAAA присутствовали как в цитоплазме, так и в ядрах, а фокусы ядерного желтого флуоресцентного белка (YFP) были более многочисленными и намного меньше, чем фокусы взаимодействия N-M (рис.5B), предполагая, что они не могли слиться с образованием крупных фокусов. Более того, поскольку белок N также имеет сигналы ядерной локализации (60), появление цитоплазматических фокусов YFP предполагает, что взаимодействия между мутантами белка N и M происходят в основном в цитоплазме и что цитоплазматические комплексы N-M не могут быть импортированы в ядра. Эти данные указывают на то, что мутанты M NLS лишены ядерной локализации и взаимодействий с N-белком в ядрах.

Субклеточная локализация, взаимодействия с белком N и способность подавлять транскрипцию MR мутантами SYNV M с ядерной локализацией.(A) Конфокальные микрофотографии, показывающие репортерный белок RFP-гистон 2B (RFP-h3B) трансгенных эпидермальных клеток листьев N. benthamiana, экспрессирующих слияния CFP-M, CFP-M _{, RARA} и CFP-M _AAAA . Пруток, 20 мкм. (B) Анализы бимолекулярной флуоресцентной комплементации (BiFC) для определения взаимодействий белка N с М дикого типа или мутантным белком M _RARA или M _AAAA . Эпидермальные клетки листьев трансгенных растений RFP-h3B N. benthamiana подвергали агроинфильтрации для экспрессии N-концевого слияния YFP с N (YN-N) и С-концевого слияния YFP с производными M (YC-M).Показаны конфокальные микрофотографии YFP (BiFC), RFP-h3B (ядра) и объединенного канала. Пруток, 20 мкм. (C) Визуализация флуоресцентной микроскопии экспрессии репортерного гена SYNV (-) MR при 8 dpi в листьях N. benthamiana, коинфильтрованных для экспрессии либо пустого векторного контроля (Vec), либо белка M, M _RARA или M _AAAA . Пруток, 200 мкм. (D) Среднее количество клеток на поле, экспрессирующее GFP и RFP с разрешением 8 dpi при каждой обработке SYNV MR, показанной на панели C. Столбцы представляют собой стандартные отклонения.***, P <0,001; NS, не значимо (по критерию Стьюдента t ; n = 20). (E) Вестерн-блоттинг, показывающий экспрессию белка M, M _{, RARA} или M _AAAA с белками N и P в каждой группе. Большая субъединица RuBisCO, окрашенная кумасси синим, обеспечивает контроль загрузки.

Затем мы оценили способность мутантов M NLS подавлять транскрипцию мРНК репортера MR. Мутанты M NLS временно экспрессировались в листьях N. benthamiana вместе с компонентами, необходимыми для (-) MR активности, а уровни экспрессии GFP и RFP исследовали при 8 dpi с помощью флуоресцентной микроскопии.Несмотря на сохранение частичной ядерной локализации и взаимодействия с белком N, ни белок M _RARA , ни белок M _AAAA не оказали заметного ингибирующего действия на экспрессию MR-репортера, о чем свидетельствует визуализация флуоресценции (рис. 5C) и количественный анализ количество флуоресцентных фокусов (рис. 5D). В качестве положительного контроля белок М дикого типа заметно снижал экспрессию репортера (фиг. 5C и D). Вестерн-блот-анализ образцов белка, экстрагированных из инфильтрированных тканей листа, показал, что два мутанта M, особенно мутант M _AAAA , накапливались до более высоких уровней, чем белок M дикого типа (рис.5D). Следовательно, отсутствие ингибирующих функций у мутантов M NLS не было следствием сниженной экспрессии белка, но, вероятно, было связано с нарушением взаимодействий белка M с белком N в ядрах, которые влияют на свертывание NC.

rSYNV, несущие мутации M NLS, дефектны в отношении активности SIE. Продемонстрировав, что мутанты M NLS неспособны подавлять вирусную транскрипцию, мы затем ввели эти мутации в геном rSYNV-RFP и проверили способность мутантных вирусов ингибировать суперинфекция rSYNV-GFP.В этих тестах листья N. benthamiana подвергали агроинфильтрации, чтобы инициировать коинфекцию rSYNV-GFP и либо rSYNV-RFP, rSYNV-RFP-M _RARA , либо rSYNV-RFP M _AAAA . При всех комбинациях дискретные одноклеточные фокусы GFP и RFP наблюдались в инфильтрированных тканях листа при 8 dpi, и фокусы распространялись на окружающие клетки на 15 dpi. Как и ожидалось, клетки, коэкспрессирующие GFP и RFP, не наблюдались на краях смежных очагов родительской коинфекции rSYNV-GFP / rSYNV-RFP, что указывает на активность SIE.Напротив, суперинфекция была очевидна в значительном количестве соседних клеток сливающихся фокусов комбинаций rSYNV-GFP / rSYNV-RFP-M _RARA и rSYNV-GFP / rSYNV-RFP-M _AAAA , о чем свидетельствует желтая флуоресценция. в этих ячейках (белые стрелки на рис. 6). В трех независимых экспериментах ~ 14% и ~ 17% пограничных клеток соседних очагов были коинфицированы комбинациями rSYNV-GFP / rSYNV-RFP-M _RARA и rSYNV-GFP / rSYNV-RFP-M _AAAA , соответственно.Количество суперинфицированных клеток в этих комбинациях было лишь умеренно ниже, чем 25%, обнаруженных при инфекциях rSYNV-GFP / rSYNV-RFP-ΔM, но было намного больше, чем частота коинфекции 1,5% при инфекциях rSYNV-GFP / rSYNV-RFP (Таблица 1). Из этих данных мы заключаем, что способность белка М подавлять вирусную транскрипцию необходима для исключения суперинфекции родственными производными SYNV.

SIE-активности мутантов ядерной локализации rSYNV и rSYNV M. Листья N. benthamiana были коинфицированы посредством агроинокуляции вирусными парами rSYNV-GFP и rSYNV-RFP, rSYNV-GFP и rSYNV-RFP-M _RARA или rSYNV-GFP и rSYNV-RFP-M _AAAA .Смежные фокусы GFP и RFP в инокулированных тканях листа с разрешением 15 dpi визуализировали с помощью конфокальной микроскопии, чтобы показать исключение флуоресценции между фокусами. Белые стрелки указывают граничные ячейки, экспрессирующие как GFP, так и RFP. Пруток, 100 мкм.

ОБСУЖДЕНИЕ

Хотя феномен SIE был широко изучен на многих вирусах с положительной цепью РНК с использованием различных методов и, как известно, тесно связан с жизненным циклом вируса, лежащие в его основе механизмы только начинают проявляться (см. Ссылки 61 и 62).Однако наши знания о SIE, вызванном вирусами РНК с отрицательной цепью растений, особенно ограничены, и это частично связано с техническими трудностями, связанными с генной инженерией этой группы вирусов (52). В текущем исследовании мы использовали различные меченные флуорофором варианты rSYNV для изучения их взаимодействия в модельном хозяине N. benthamiana. Наши эксперименты с коинфекцией и последовательным заражением предоставляют убедительные доказательства, демонстрирующие, что SIE / перекрестная защита происходит во время инфекций SYNV как на клеточном, так и на уровне организма.Насколько нам известно, это исследование представляет собой первую демонстрацию SIE для вируса растений с РНК с отрицательной цепью.

SIE был задокументирован для модели рабдовируса животных, вируса везикулярного стоматита (VSV), 3 десятилетия назад, и результаты показали, что трансмембранный G-белок VSV необходим для SIE и влияет на процессы начального уровня (63). Дальнейшие исследования показали, что G-белок, экспрессируемый ранее существовавшими инфекциями VSV, блокирует рецепторно-опосредованный эндоцитоз вторичных инвазий штаммов VSV (64).Однако, в отличие от рабдовирусов человека / животных, вирусы растений, как известно, не проникают в клетки-хозяева через специфический процесс, опосредованный рецепторами мембранной поверхности, и этапы их проникновения, по-видимому, облегчаются кормлением насекомых или физическим повреждением клеточной стенки. Кроме того, белок SYNV G, по-видимому, незаменим для перемещения от клетки к клетке и проникновения в дистальные клетки (51). Следовательно, предлагаемый механизм VSV маловероятен для SIE, запускаемого SYNV, который, вероятно, происходит на постентарных уровнях.

Чтобы сузить возможные вирусные детерминанты SIE, каждый из белков SYNV эктопически экспрессировался в SYNV-инфицированных листьях, и эти эксперименты привели к идентификации белка M как специфического ингибитора локальных инфекций SYNV. Подход с потерей функции, использующий анализ мутантов rSYNV-RFP-ΔM и rSYNV-RFP-M _UAA , предоставил прямые доказательства участия белка M, а не мРНК M в выявлении SIE. Используя аналогичный подход, ранее было обнаружено, что p33, кодируемый CTV, является вирусной детерминантой SIE, поскольку мутант CTV с делецией в гене p33 (CTVΔp33) не смог защитить инфицированные растения от того же штамма на уровне всего растения ( 38, 39).В отличие от белка p33 CTV, который незаменим при системной инфекции и перемещении (65), мутант rSYNV-RFP-ΔM дефектен при системных инфекциях, но способен к локализованным инфекциям (51). Таким образом, мы проанализировали SIE между rSYNV-RFP-ΔM и rSYNV-GFP в локально инфицированных клетках, и результаты показали, что rSYNV-RFP-ΔM не содержал SIE на клеточном уровне. Параллельные эксперименты с мутантом rSYNV-RFP-ΔG не смогли продемонстрировать роль белка G в SIE; следовательно, механизм SYNV SIE отличается от этапа проникновения вируса, предложенного для VSV SIE.

В частицах рабдовируса матричный белок образует мост между спиральным ядром нуклеокапсида и трансмембранным G-белком (66–69). Исследования с VSV и другими рабдовирусами животных показали, что на поздних стадиях репликации белок M скручивает gNC в компактную структуру, аналогичную ядру в форме пули, наблюдаемому в вирионе рабдовируса (70, 71). Конденсированные gNC, по-видимому, неспособны функционировать в транскрипции мРНК, потому что активность транскриптазы подавляется в условиях in vitro и in vivo (55–58).Сходные функции, вероятно, разделяют белки М, кодируемые рабдовирусами растений, учитывая их консервативную структуру генома и стратегию репликации (49). Действительно, используя (-) MR систему, которая может собираться с коэкспрессируемыми коровыми белками в gNC in vivo , мы показали, что эктопическая экспрессия белка SYNV M значительно ингибирует экспрессию репортерного гена.

Мы обнаружили, что мутанты SYNV M NLS с ослабленной ядерной локализацией были неспособны подавлять экспрессию репортерного гена MR.Эти данные предполагают, что конденсация NC и ингибирование транскрипции требуют высоких уровней белка М в ядрах, в которых происходит репликация SYNV. Следовательно, rSYNV-RFP-M _{, RARA} и rSYNV-RFP-M _AAAA были дефектными в проявлении SIE, скорее всего, из-за того, что ядра клеток, инфицированные этими мутантами вируса, испытывают недостаток в достаточном количестве белка М, чтобы инициировать или поддерживать скручивание NC бросая вызов второстепенным захватчикам SYNV. Эта гипотеза подтверждается исследованием кинетики сборки / разборки in vitro VSV, которое показало, что высокие концентрации белка М способствуют образованию комплекса NC-M с константой диссоциации порядка 1 мкМ (72).Более раннее исследование динамики инфекции VSV показало, что сборка вирионов начинается примерно через 2 часа после инфицирования и достигает пика через примерно 4-6 часов после заражения (73). В течение этого периода времени концентрация внутриклеточного М-белка повышается примерно с 1 до 30 мкМ (73), уровня, достаточного для управления сборкой комплексов NC-M (72). После образования начального комплекса NC-M сборка ядра вириона дополнительно облегчается движущими силами, обеспечиваемыми совместными самовзаимодействиями М. Белок VSV M мультимеризуется при физиологических концентрациях NaCl (74) и образует большие агрегаты, которым помогают сайты нуклеации вблизи N-концевой области (75).Предыдущие тесты BiFC также показали, что белок SYNV M подвергается самоассоциациям, которые проявляются в виде крупных точечных субядерных очагов (76).

Объединив знания о циклах репликации рабдовирусов (49, 77) с данными, представленными в этом исследовании, мы предлагаем регуляторный механизм, связанный с фазой инфекции, для объяснения SYNV SIE (рис. 7). На ранних и промежуточных стадиях репликации после первичной инфекции белок М накапливается до относительно низких уровней из-за прогрессирующих сигналов ослабления транскрипции, присутствующих в каждой из последовательностей соединения генов (49, 77).Это приводит к более низким уровням транскрипции мРНК М по сравнению с уровнями 3′-генов N, P и sc4. На этих стадиях белок M может ассоциироваться с вновь образованными gNC, но, вероятно, не на достаточном уровне для полной конденсации NC, а инфицированные клетки допускают дополнительные циклы репликации и транскрипции и накопления NC. Однако на более поздних стадиях репликации SYNV, когда белок М накапливается в ядрах до уровней, достаточных для запуска конденсации NC, происходит переход от репликации к сборке вириона.На этой стадии ядра, инфицированные первичным заражающим штаммом SYNV, будут активно участвовать в свертывании нуклеокапсида, и входящие gNC, высвобождаемые из вторичного вторгающегося SYNV, не будут раскручиваться в достаточной степени, чтобы инициировать новые инфекции. Следовательно, клетки, поддерживающие более поздние стадии инфицирования первичного штамма заражающего вируса, больше не будут допускать продуктивную репликацию вторичным вторгающимся вирусом (рис. 7).

Рабочая модель для иллюстрации SIE, опосредованной белком SYNV M. После проникновения в клетки геномные нуклеокапсиды (gNC), освобожденные из вирионов первичного захватчика (показаны синим цветом), импортируются в ядра и инициируют первичную транскрипцию вирусных мРНК (этап 1).Транскрипты первичных мРНК экспортируются в цитоплазму для синтеза вирусных белков (этап 2). Вновь синтезированные ядерные белки N, P и L впоследствии импортируются в ядра, где они образуют вироплазмы и участвуют во вторичных раундах транскрипции мРНК и репликации антигеномной и геномной РНК потомства и инкапсидации с образованием NC потомства (этап 3). Белок М также импортируется в ядра, но накапливается до относительно низких уровней на ранних и промежуточных стадиях репликации из-за полярной транскрипции вирусной мРНК.Однако по мере прохождения циклических волн транскрипции и репликации (повторяющиеся шаги с 1 по 3) накапливающийся белок М начинает инициировать сворачивание gNC и тушение транскрипции вирусной мРНК. Впоследствии свернутые в спираль ядра gNC взаимодействуют с карбоксиконцевой областью трансмембранного G белка и зачатком через внутреннюю ядерную оболочку с образованием зрелых вирионов (стадия 4). Поступающие gNC, высвобождаемые вторичными захватчиками (показаны пурпурным цветом), проникающие в эти клетки, свертываются или предотвращаются от раскручивания из-за большого количества М-белков, которые накапливаются в ядрах на более поздних стадиях первичной инфекции (стадия 5).Этот процесс секвестрации NC отменяет транскрипцию мРНК вторичными захватчиками и приводит к SIE.

Динамика инфицирования клеток SYNV детально не охарактеризована, но если предположить, что они аналогичны динамикам VSV (73), временное окно от фазы разрешения суперинфекции до фазы исключения суперинфекции может составлять несколько часов. Учитывая несинхронный характер вирусных инфекций, два варианта SYNV, попавшие в одни и те же клетки, вряд ли вызовут инфекцию одновременно или даже в течение очень короткого интервала.Следовательно, клетки с установленной инфекцией более ранним вариантом SYNV не будут допускать повторного заражения более поздними вариантами SYNV, и коинфекции будут проявляться пространственным разделением двух вариантов в соседних очагах. Однако, если два варианта действительно инициируют инфекции в одних и тех же клетках в пределах разрешающего окна, возможны суперинфекции, о чем свидетельствует небольшой процент (~ 1,5%) клеток, экспрессирующих флуоресценцию как GFP, так и RFP после коокуляций rSYNV-GFP и rSYNV. -RFP (Таблица 1).

Наша модель напоминает модель TCV p28 в том, что обе модели постулируют, что фазовый переход инфекции, зависящий от концентрации вирусного белка, объясняет суперинфекцию по сравнению с SIE. В модели TCV накопление белка репликации p28, продуцируемого многочисленными геномами потомства, трансформирует цикл инфекции из активного состояния репликации в состояние репрессии репликации (фаза пострепликации). Этот переход инициируется зависимой от концентрации полимеризацией p28, приводящей к образованию крупных агрегатов, которые секвестрируют вновь синтезированные мономеры p28, в том числе транслируемые из вторичных инвазивных вирусных геномов (33).Другим хорошо изученным примером SIE у вирусов растений является CP-опосредованная перекрестная защита, описанная для TMV и некоторых других вирусов с положительной цепью РНК растений (32, 42, 43, 78). Было высказано предположение, что SIE, опосредованный CP TMV, включает несколько способов вмешательства, включая предотвращение расплетения и / или блокирование сборки репликазы вторичных инвазивных вирусных геномов (42, 79, 80). С TMV эта активность требует способности CP собираться в большие агрегаты посредством самоассоциации и связываться с вирусной РНК (81–83).И модель SIE TMV, и наша модель постулируют, что обильный фактор сборки вируса (TMV CP и SYNV M), продуцируемый на поздних стадиях первичных инфекций, отвечает за покрытие / секвестр вирусных инфекционных единиц (т. Е. GRNA TMV и gNC SYNV). вторичных захватчиков для предотвращения суперинфекции. Таким образом, похоже, что SIE различных вирусов может включать в себя разные функции конкретных вирусных белков, но все они проявляются как вмешательство в ранние стадии заражения вторичным инвазивным вирусом более продвинутыми стадиями, участвующими в синтезе первичного инвазивного вируса.Продуктивные вирусные инфекции требуют координации цепочки временных и последовательных событий, включая снятие оболочки, трансляцию, репликацию, перемещение от клетки к клетке и сборку вирионов. (Обратите внимание, что в случае вирусов с РНК с отрицательной цепью этап транскрипции предшествует трансляции.) Переход от одной фазы к другой часто включает конкуренцию за вирусные белки или РНК и может даже привести к прекращению ранних событий (84). Следовательно, вторичные захватчики, проникающие в ранее инфицированные клетки, сталкиваются с проблемой координации с существующими стадиями инфекции для установления суперинфекции.В этом смысле SIE можно рассматривать как побочный эффект, вызванный фазовыми переходами инфекции.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Плазмиды и рекомбинантные вирусы. Плазмиды, используемые для выделения rSYNV-GFP, rSYNV-RFP, rSYNV-RFPΔM и rSYNV-RFPΔG, были описаны в предыдущих исследованиях (51, 54). Плазмида PVX-GFP была сконструирована, как описано van Wezel et al. (85). Чтобы сконструировать варианты rSYNV-RFP с мутациями в гене M, кодон инициации AUG кодирующей области M был изменен на стоп-кодон UAA посредством сайт-направленного мутагенеза с образованием мутанта M _UAA .Аналогичным образом, ядерные импортируемые остатки M ²³⁰ RKRK ²³³ были мутированы в RARA или AAAA для получения мутантов M _RARA и M _AAAA . Чтобы ввести эти мутации M в геном rSYNV-RFP, фрагмент F1, содержащий часть гена P, был амплифицирован из плазмиды pSYNV-RFP с использованием пары праймеров SYNV / P / NheI / F (5′-AAGAGAAGGGGCTAGCATGTC-3 ‘ ) и SYNV / M _UAA / R (5′-GTATATACCTGCTTATCTGAAATACAATAGAGATAACCTTG-3 ′), а фрагмент F2, содержащий часть гена M, был амплифицирован с использованием пары праймеров SYNV / M _UAA / F (5′- TAAGCAGGTATATACGCAGTTTCAA-3 ‘) и SYNV / M / PmlI / R (5′-CATCACGACTGACACGTGACCT-3’).В два фрагмента вливали pSYNV-RFP, дважды расщепленный NheI и PmlI, с получением pSYNV-RFP-M _UAA . Аналогичная стратегия была использована для создания мутантов pSYNV-RFP-M _RARA и M _AAAA с праймерами SYNV / sc4 / BstZ17I / F (5′-GCAAGTACTTTGGTATACAAGAAAGG-3 ‘) и SYNV / G / BstZ17I / R ( 5’-TCTTGAATACTGGTATACTTATTCCCACA-3 ‘).

Геномно-смысловая плазмида SYNV MR [pSYNV-MR _GFP-RFP (-)] была получена из антигеномно-смыслового минирепликона [MR _GFP-RFP (+)], описанного Ganesan et al.(59). Вкратце, последовательность MR амплифицировали с помощью ПЦР с праймерами MR / трейлер / F (5′-CCGGTATCCCGGGTCAGAGACAAAAGCTCAGAACAATCC-3 ‘) и MR / лидер / R (5′-ATGCCATGCCGACCCAGAGACAGAAACTCAGAAAATACAATC-3′) последовательности рибозима «головка молотка» и рибозима вируса гепатита D амплифицировали с праймерами MR / backbone / F (5’-GGGTCGGCATGGCATCTCCACC-3 ‘) и MR / backbone / R (5′-GACCCGGGATACCGGGTTTCGG-3′). Два фрагмента были подвергнуты циркуляризации в присутствии смеси ферментов In-Fusion для создания MR с ориентацией отрицательной цепи.Этому способствовали гомологичные последовательности из 15 нуклеотидов, включенные в 5’-концы праймеров (подчеркнутые в последовательностях).

Для создания плазмид для временной экспрессии белка M, M _UAA , M _RARA и мутантных белков M _AAAA , а также белка sc4, последовательности кДНК этих генов были амплифицированы с помощью ПЦР. с использованием специфических праймеров (эти последовательности праймеров будут предоставлены по запросу). Затем полученные продукты ПЦР вставляли в бинарный вектор pGD (86) с помощью клонирования In-Fusion (Clontech).Плазмида pGD-CFP-M, используемая для временной экспрессии слияния CFP-M, была описана ранее (54) и использовалась для создания плазмид экспрессии pGD-CFP-M _RARA и pGD-CFP-M _AAAA .

Чтобы обеспечить временную коэкспрессию вирусных белков и GFP, мы сначала сконструировали вектор двойной экспрессии pGD-X / GFP. Для этого мы линеаризовали вектор pGD-GFP (86) рестрикционным расщеплением MluI. Затем область, охватывающую промотор 35S, множественные сайты клонирования и последовательность терминатора Nos в векторе pGD, амплифицировали с помощью pGD / MluI 15 н / F (5′-CGAATTAATTACGCGTCATGGTGGAGCACGACACTCTCGT-3 ‘) и pGD / MluI 15 нт / R (5’-CTCCACCATGACGCGTCCCGATCTAGTAACATAGATGACA-3 ‘) праймеры.Продукт ПЦР был разработан так, чтобы иметь гомологичную последовательность из 15 нуклеотидов (подчеркнута) с концами линеаризованного вектора. Смесь для клонирования In-Fusion (Clontech) использовали для сборки продукта ПЦР и линеаризованного вектора in vitro . Кодирующие последовательности генов SYNV N, P, sc4, M и G амплифицировали с помощью ПЦР и индивидуально вставляли в сайт рестрикции XbaI pGD-X / GFP для создания соответствующих плазмид с двойной экспрессией.

Для создания векторов BiFC кодирующие последовательности белка N, белка M дикого типа и мутантов M были слиты с N-концевым и C-концевым фрагментами усиленного гена YFP в векторах p2YN и p2YC. (87) с помощью процедуры, аналогичной процедуре Sun et al.(54).

Анализы агроинфильтрации и агроинфекции. Анализы минирепликонов SYNV проводили путем инфильтрации тканей листа N. benthamiana штаммами Agrobacterium tumefaciens для доставки плазмиды pSYNV MR _GFP-RFP , плазмиды pGD-NPL и плазмиды p19, γ Вирусные супрессоры P1 / HC-Pro экспрессионной плазмиды подавления РНК (VSR), как описано ранее (51, 88). Кроме того, штаммы агробактерий, содержащие отдельные плазмиды для экспрессии белков М дикого типа или мутировавших М или белка sc4, были смешаны с вышеупомянутыми смесями в соотношении 1: 6 (объем / объем) с общей оптической плотностью (OD ) А ₆₀₀ из 0.7. Инфильтрованные листья наблюдали под флуоресцентным микроскопом через 8 дней после инфильтрации (dpi), чтобы проверить их влияние на экспрессию репортерного гена. Анализы репликона PVX-GFPΔp25 проводили аналогичным образом, за исключением того, что штаммы A. tumefaciens, несущие PVX-GFPΔp25, разбавляли в 250 раз и смешивали в соотношении 1: 1: 1 с культурами Agrobacterium , содержащими три вирусные плазмиды VSR (p19, γb и P1 / HC-Pro) (OD A ₆₀₀ = 0,6) и белок SYNV M (OD A ₆₀₀ = 0.3).

SYNV проводили аналогично анализу агроинфильтрации минирепликонов (59), за исключением того, что штаммы агробактерий, несущие производные pSYNV-RFP или pSYNV-GFP, были заменены на штаммы, несущие плазмиду pSYNV MR _GFP-RFP . Для тестирования SIE в экспериментах по смешанной агроинфекции штаммы агробактерий, несущие производные pSYNV-RFP и pSYNV-GFP, были смешаны в равных объемах перед инфильтрацией. Инфильтрованные листья наблюдали с помощью флуоресцентного микроскопа при 15 dpi и подсчитывали количество клеток на границах очагов, показывающих как GFP, так и RFP.Чтобы оценить влияние сверхэкспрессированных белков SYNV на локализованное распространение rSYNV-RFP, штаммы A. tumefaciens, индивидуально несущие плазмиды pGD для экспрессии белка SYNV N, P, sc4, M или G, были добавлены к агроинфекционным смесям в соотношении 1: 9 (объем / объем) с общим OD A ₆₀₀ 0,7. Инфильтрованные листья наблюдали с помощью флуоресцентного микроскопа при 8 dpi, а затем при 12 dpi, и подсчитывали количество клеток в каждом фокусе RFP.

Чтобы оценить влияние белка SYNV M на локальное движение PVX-GFP, A.tumefaciens EHA 105, несущие PVX-GFP (OD A ₆₀₀ = 1,0), разводили в 1000 раз и смешивали в соотношении 1: 1: 1 с культурами Agrobacterium , содержащими три вирусные плазмиды VSR (p19, γb, и P1 / HC-Pro) (OD A ₆₀₀ = 0,6) и белок SYNV M (OD A ₆₀₀ = 0,3). Площади очагов инфекции PVX-GFP с разрешением 6 dpi измеряли с помощью программного обеспечения LSM Zen 2012 (Carl Zeiss, Германия).

Коробка передач механическая.Механическая передача SYNV осуществлялась, как описано ранее (89). Вкратце, молодые появляющиеся листья N. benthamiana (~ 2 г), системно инфицированные производными SYNV, измельчали ​​с 5 мл холодного (~ 4 ° C) инокуляционного буфера, содержащего 5% сульфита натрия (граммы / литр) и 2% целита ( граммов / литр), и полученный брей аккуратно втирали вручную в молодые разросшиеся листья 6-8-недельных растений N. benthamiana. Инокулированные растения помещали в камеры для выращивания в условиях окружающей среды, описанных выше.

Анализ белка. Все образцы белка, разделенные с помощью 12% SDS-PAGE, окрашивали кумасси синим или переносили на нитроцеллюлозные мембраны и выявляли поликлональными антителами, специфичными к разрушенным вирионам SYNV (90) или белку sc4 (50). В некоторых случаях мембраны удаляли и повторно зондировали моноклональными антителами GFP и RFP (Abcam, Кембридж, Великобритания).

BiFC.BiFC вводили индивидуально в штаммы A. tumefaciens EHA105 путем электропорации. Одинаковые объемы бактериальных культур ( А ₆₀₀ = 0.5), несущие плазмиды на основе p2YN- и p2YC, смешивали и инфильтрировали в листья трансгенных растений N. benthamiana, экспрессирующих репортерный белок RFP-гистона 2B (RFP-h3B) (91). Сигналы YFP и RFP визуализировали через 36–48 ч после инфильтрации в расширенные листья и регистрировали с помощью конфокальной микроскопии Zeiss 780 (Carl Zeiss, Германия).

Флуоресцентная микроскопия и конфокальная лазерная сканирующая микроскопия. Эпифлуоресцентный микроскоп (Zeiss SteREO Lumar V12) использовался для визуализации флуоресцентных фокусов SYNV MR и определения движения производных rSYNV и PVX-GFP в инфильтрированных тканях листа и системно инфицированных листьях.Флуоресценцию листьев N. benthamiana регистрировали с помощью набора фильтров Lumar 31 для обнаружения RFP (возбуждение, 565/30 нм; эмиссия, 620/60 нм) и набора фильтров Lumar 38 для обнаружения GFP (возбуждение, 470/40; излучение, 525/50). Визуализацию флуоресцентных белков с высоким разрешением выполняли с помощью конфокального микроскопа Zeiss 780. Флуоресценция GFP, RFP, YFP и CFP возбуждалась лазерными линиями с длиной волны 470, 545, 488 и 405 нм соответственно. Для экспериментов по коинфекции с использованием производных рекомбинантного вируса, экспрессирующих GFP или RFP, была получена серия от 7 до 11 z-стеков с использованием 20-кратного объектива (воздушный объектив NeoFluor; числовая апертура [NA], 0.50 [Zeiss]), охватывая примерно 18–30 мкм по оси z, с шагом 3 мкм. Все изображения обрабатывались с помощью программы LSM Zen 2012 (Carl Zeiss, Германия).

Нозерн-гибридизация. Суммарная РНК была выделена из инфильтрированных областей листьев N. benthamiana с использованием реагента TRIzol (TaKaRa, Далянь, Китай), разделена в 1,5% агарозо-формальдегидных гелях и исследована с помощью меченного дигоксином комплементарного олигонуклеотидного зонда GFP (5 ‘ -CCTCGAACTTCACCTCGGCGCGGGTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAAGAAGATGGTG-3 ‘) (Invitrogen, Шанхай, Китай).Блоты проявляли с использованием конъюгированных с пероксидазой хрена антител к дигоксину и хемилюминесцентных субстратов, доступных в стартовом наборе для метки и обнаружения ДНК DIG High Prime (Roche Diagnostics, Базель, Швейцария), и отображали их с помощью прибора для визуализации биомолекул ImageQuant LAS 4000 Mini (GE Здравоохранение, Литл-Чалфонт, Соединенное Королевство). Чтобы сгенерировать маркеры размера РНК для GFP и MR, мы амплифицировали кДНК с использованием пары праймеров T7GFPF (5’-TAATACGACTCACTATAGGGATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3 ‘) и GFPR (5′-TTACTTGTACAGCTCACGTCCATGAC-TAGACA-TCCATGAC-3) и пары ′) И MRR (5′-AGAGACAAAAGCTCAGAACAATCC-3 ′) соответственно.Прямые праймеры содержали промотор Т7, расположенный на 5’-конце (подчеркнут), и продукты ПЦР были транскрибированы in vitro с помощью РНК-полимеразы Т7, как описано ранее (88).

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы благодарим Майкла Гудина (Университет Кентукки, США) за предоставление RFP-h3B трансгенных семян N. benthamiana и Фей Яна (Университет Нинбо, Китай) за предоставление конструкции PVX-GFPΔp25.

Работа поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (гранты 31671996 и 31870142).

Мы заявляем, что у нас нет конфликта интересов.

СНОСКИ

• Получено 23 апреля 2019 г.
• Принято 16 июля 2019 г.
• Принятая рукопись размещена в Интернете 24 июля 2019 г.

• Авторские права © Американское общество микробиологии, 2019 г.

Рекомбинантный матричный белок 1 (His tag) (ab217650)

Описание

• Название продукта

  Рекомбинантный матричный белок 1 (His tag)

• Чистота

• Система выражений

  кишечная палочка

• Присоединение

• Длина белка

  Белок полной длины

• Без животных

  №

• Природа

  Рекомбинантный

• • Последовательность

    MSLLTEVETYVLSIIPSGPLKAEIAQRLESVFAGKNTDLEALMEWLKTRP ILSPLTKGILGFVFTLTVPSERGLQRRRFVQNALNGNGDPNNMDRAVKLY KKLKREITFHGAKEVSLSYSTGALASCMGLIYNRMGTVTTEAAFGLVCAT CEQIADSQHRSHRQMATTTNPLIRHENRMVLASTTAKAMEQMAGSSEQAA EAMEVANQTRQMVHAMRTIGTHPSSSAGLKDDLLENLQAYQKRMGVQMQR FK

  • Расчетная молекулярная масса

    28 кДа

  • Аминокислоты

    1 до 252

  • Теги

    Его тег C-Terminus

  • Дополнительная информация о последовательности

    Вирус гриппа A (A / California / 04/09) (h2N1).

Технические характеристики

Наша гарантия Abpromise распространяется на использование ab217650 в следующих протестированных приложениях.

Примечания по применению включают рекомендуемые начальные разведения; Оптимальные разведения / концентрации должны определяться конечным пользователем.

• Приложения

• Форма

  Жидкость

• Загрузка информации о концентрации…

Подготовка и хранение

• Стабильность и хранение

  Поставляется при 4 ° C. Хранить при -20 ° C. Избегайте цикла замораживания / оттаивания.

  Состав: 100% PBS

Общая информация

• Альтернативные названия

  • M1
  • Матричный белок 1
  • Матричный белок I
  • Белок мембранного матрикса M1

• Релевантность

  Матричный белок вируса гриппа типа A, также известный как M1, состоит из 252 аминокислотной последовательности и является типоспецифичным для вирусов гриппа.Он расположен внутри липидной оболочки вируса и играет ключевую роль в сборке и репликации вируса. M1 можно изолировать от частиц, удалив оболочку с помощью детергентов и снизив pH до 4,0. Вирусы гриппа — распространенный и широко распространенный инфекционный агент. Как и многие другие вирусы, вирус гриппа постоянно мутирует, избегая, таким образом, иммунной системы. Белки вируса гриппа A M образуют непрерывную оболочку на внутренней стороне липидного бислоя, поддерживая структурную целостность вирусной частицы за счет гидрофобных взаимодействий.

• Сотовая локализация

  Цитоплазматический

Изображения

• SDS-PAGE — Рекомбинантный матричный белок 1 (His tag) (ab217650)

  10% SDS-PAGE анализ ab217650.

Протоколы

Насколько нам известно, для этого продукта не требуются индивидуальные протоколы.