Протеинов: Протеин. Информация о протеине, его видах, эффекте и перечень продукции. Рекомендации о том, какой лучше всего купить протеин для роста мышц.

Загрузить особенности ИМ Загрузить особенности ЭК

белков и экспрессия генов | Изучайте науку в Scitable

Через призму клеточной биологии изучение экспрессии генов тесно связано с нашим пониманием белков. Начиная с ранних работ Кристиана Анфинсена в 1950-х годах, мы знаем, что последовательность аминокислот в белке определяет его окончательную трехмерную структуру. Исходя из этого, ученые неоднократно наблюдали, что структура белка определяет, где он будет действовать и что он будет делать.Нигде это не было так очевидно, как с функцией ферментов. Форма и структура белков — это важный аспект биологии экспрессии генов, который связывает наше понимание экспрессии генов с биологией клетки. Хотя в первую очередь речь идет о белковых молекулах, которые действуют на последовательности ДНК и РНК, таких как факторы транскрипции и гистоны, изучение экспрессии генов также сосредоточено на том, где в клетке модулируется экспрессия. Фактически, модуляция экспрессии генов может происходить в ядре, цитоплазме или даже на клеточной мембране из-за воздействия белков на РНК в этих клеточных субрегионах.

Как ученые изучают форму и функцию белка? Метод, называемый масс-спектрометрией, позволяет ученым определять последовательность аминокислот в белке. После того, как последовательность известна, сравнение ее аминокислотной последовательности с базами данных позволяет ученым определить, существуют ли связанные белки, функция которых уже известна. Часто аналогичные аминокислотные последовательности будут выполнять аналогичные функции в клетке. Аминокислотная последовательность также позволяет ученым предсказать заряд молекулы, ее размер и вероятную трехмерную структуру.Позже заряд и размер могут быть подтверждены экспериментально (с помощью SDS-PAGE и двухмерных гелей). Чтобы понять сложности трехмерной структуры, ученые попытаются кристаллизовать белок, чтобы подтвердить его молекулярную структуру с помощью рентгеновской кристаллографии и / или спектроскопии ядерного магнитного резонанса (pNMR).

Как ученые изучают влияние белков на гены или другие белки? Хороший способ изучить функцию белка — посмотреть, что происходит в клетке, когда белок отсутствует.Для этого ученые используют модельные системы, такие как культура клеток или целые организмы, в которых они могут тестировать функцию определенных белков или генов, модифицируя или мутируя их. Уровень экспрессии гена можно рассчитать путем измерения транскрибированной мРНК (нозерн-блот), экспрессированного белка (вестерн-блот) или путем прямого окрашивания белка или мРНК, когда они все еще находятся в клетке. Новые методы изменили способ изучения экспрессии генов — микроматрицы ДНК, последовательный анализ экспрессии генов (SAGE) и высокопроизводительное секвенирование позволяют проводить более широкий анализ нескольких молекул одновременно и открывают возможность для новых и более широких видов вопросов.Чтобы проанализировать большие наборы данных и увидеть, как взаимодействуют сети молекул, новая дисциплина, называемая системной биологией, обеспечивает основу для этого более широкого и интегрированного понимания регуляторных сетей.

Интересно, что белки — не единственные регуляторы генов. Регуляторные молекулы имеют форму РНК и действуют на другие нуклеиновые кислоты, изменяя или разрушая их. Одним из примеров является семейство рибопереключателей, молекул рибонуклеиновой кислоты, которые образуют трехмерные структуры, которые останавливают или препятствуют транскрипции при наличии надлежащего внешнего сигнала.Другой пример РНК, действующей на другие РНК, — это механизм РНК-интерференции (РНКи), при котором молекулы двухцепочечной РНК разлагают мРНК перед трансляцией, таким образом эффективно препятствуя экспрессии белка. Рассмотрение этого механизма и его последующее экспериментальное имитация было благом для тех, кто заинтересован в манипулировании функцией генов.

В конечном счете, результаты такого рода исследований имеют фундаментальное значение, от базового понимания нормальных функций клеток, таких как дифференциация, рост и деление клеток, до разработки принципиально новых подходов к лечению заболеваний.Фактически, некоторые заболевания человека могут возникать просто из-за дефекта трехмерной структуры белка. Изучая экспрессию генов и белков, легко увидеть, как мелкие изменения на молекулярном уровне имеют реверберирующий эффект.

Изображение: Библиотека биохимических алгоритмов.

Крио-ЭМ определение структуры малых белков с помощью связывающих нанотела каркасов (Legobodies)

Значимость

Определение структуры с помощью крио-ЭМ трудно или невозможно применить к белкам меньше ∼100 кДа, за исключением многих мембранных белков и белков фармацевтического производства. важность из анализа.Здесь мы сообщаем об общем методе, который позволяет определять структуру небольших белков. Метод основан на доступности нанотела для целевого белка. Затем нанотело жестко прикрепляют к двум каркасам: 1) Fab-фрагменту антитела, направленному против нанотела, и 2) фрагменту связывающего нанотело белка A, слитого с мальтозосвязывающим белком и Fab-связывающими доменами. Мы называем общий ансамбль Legobody. Метод продемонстрирован для двух небольших белков размером ~ 22 кДа.

Abstract

Мы описываем общий метод, который позволяет определять структуру небольших белков с помощью криоэлектронной микроскопии одиночных частиц (крио-ЭМ). Метод основан на доступности связывающего мишень нанотела, которое затем жестко прикрепляется к двум каркасам: 1) Fab-фрагменту антитела, направленному против нанотела, и 2) фрагменту связывающего нанотело белка A, слитого со связывающим мальтозу белком. и Fab-связывающие домены. Полный ансамбль ∼120 кДа, называемый Legobody, не нарушает взаимодействия нанотело-мишень, легко распознается на ЭМ-изображениях благодаря своей уникальной форме и облегчает выравнивание частиц при обработке крио-ЭМ изображений.Полезность метода продемонстрирована для рецептора KDEL, мембранного белка массой 23 кДа, в результате чего была получена карта с общим разрешением 3,2 Å с плотностью, достаточной для построения модели de novo, и для домена связывания рецептора массой 22 кДа (RBD ) спайкового белка SARS-CoV-2, в результате чего была получена карта с разрешением 3,6 Å, которая позволяет анализировать интерфейс связывания с нанотелом. Таким образом, подход Legobody преодолевает существующие ограничения размеров крио-ЭМ анализа.

Одночастичная электронная криомикроскопия (крио-ЭМ) стала предпочтительным методом определения структур белков.Крио-ЭМ анализ имеет несколько преимуществ перед рентгеновской кристаллографией или ЯМР (1), но этот метод становится все более сложным для более мелких белков. Большие молекулы относительно легко идентифицировать на зашумленных изображениях застеклованных образцов с низкой дозой, и они обладают достаточным контрастом и характеристиками, чтобы определить их ориентацию и положение для выравнивания и усреднения. Структурный анализ мелких частиц (~ 100 кДа и менее) намного сложнее. Маленькие цели часто не имеют узнаваемых форм, которые могут облегчить начальное выравнивание изображения при низком разрешении.Без симметрии мелким частицам требуются оптимальные условия, такие как высокогомогенный образец, жесткая конформация белка и случайное распределение частиц в тонком льду, условия, которые трудно достичь с большинством образцов (2). Однако определение структуры малых белков представляет большой интерес, так как большинство белков имеют размер менее 100 кДа и ∼50% меньше 50 кДа, включая многие мембранные белки и белки, имеющие медицинское значение. Таким образом, основная цель в данной области — расширить использование крио-ЭМ для рутинного анализа небольших белков.

Один из подходов к использованию крио-ЭМ для небольших белков основан на методах фазового контраста, таких как использование фазовых пластин Вольта. Этот метод был использован для определения структуры стрептавидина, белка 52 кДа, с разрешением 3,2 Å (3). Однако структуру этого белка можно было определить даже без фазовых пластин (4), вероятно, потому, что стрептавидин образует жесткие тетрамеры, а частицы демонстрируют почти идеальное распределение в очень тонком льду, что значительно облегчает структурный анализ.

Альтернативная стратегия состоит в увеличении размера целевого белка путем слияния его с другим белком или с помощью партнера по связыванию. В любом случае высокая жесткость самого добавленного каркаса и его жесткое соединение с целевым белком необходимы для облегчения выравнивания частиц и усреднения крио-ЭМ изображений.

Подход слияния был опробован с различными каркасами. Например, в недавнем исследовании домен BRIL был слит в петлю небольшого белка GPCR путем удлинения спиралей по обе стороны от точки слияния; размер каркаса был дополнительно увеличен с помощью Fab, направленного против домена BRIL (5).Однако этот подход ограничен белками, содержащими подходящие α-спирали; их расширение необходимо настраивать для каждой новой цели, чтобы создать жесткую связь, чего трудно достичь без предварительного знания целевой структуры.

Более многообещающим является использование партнера по связыванию, который может быть выбран с помощью платформы для скрининга, такого как модифицированные белки с анкириновыми повторами (DARPins), Fab-фрагменты антител или нанотела. В недавних исследованиях DARPins, выбранные против GFP, были привиты на большие каркасы и использованы для визуализации GFP с помощью крио-ЭМ (6, 7).Однако внутренняя конформационная гетерогенность DARPins ограничивает их потенциал для достижения структур с высоким разрешением малых белков (7), и до сих пор только несколько DARPin были отобраны против мембранных белков. Fab-фрагменты можно использовать в качестве реперных маркеров для облегчения совмещения изображений в крио-ЭМ-изображениях (8), но они в основном используются в рентгеновской кристаллографии. Сообщалось только о нескольких примерах их применения для крио-ЭМ анализа (9–11), отчасти потому, что выбор подходящих Fab не является тривиальным.Кроме того, размер Fab (~ 50 кДа) и наличие несколько гибкой шарнирной области между двумя субдоменами по-прежнему затрудняют структурный анализ.

Нанотела, полученные из одноцепочечных антител верблюдовых, также становятся популярными в качестве универсальных партнеров связывания белков-мишеней. У нанотел есть несколько привлекательных особенностей. Они образуют жесткие структуры, которые могут связываться с целевыми белками различной формы, такими как петли, выпуклые поверхности и полости (12). Они могут связываться с небольшими открытыми поверхностями, которые могут быть недоступны для Fab-фрагментов.Нанотела могут быть выбраны из иммунизированных верблюдов или из больших библиотек in vitro, представленных фагами, дрожжевыми клетками или рибосомами (12, 13), и могут быть получены в больших количествах за довольно короткое время. Они часто фиксируют белок в фиксированной конформации, особенно в случае мембранных белков, и широко используются для определения рентгеновских структур. Небольшой размер нанотел (от ~ 12 до 15 кДа) ограничивает их прямое применение в крио-ЭМ, но эту проблему можно было бы преодолеть, если бы можно было увеличить их размер с помощью жесткого крепления большого каркаса.Один из описанных подходов состоит в том, чтобы объединить каркас в петлю нанотела, создав «мегатело» (14). Однако линкер состоял из β-нитей между нанотелом и каркасом, что обусловливало некоторую гибкость и ограничивало использование каркаса для выравнивания частиц в крио-ЭМ анализе.

Здесь мы описываем универсальный метод, который позволяет крио-ЭМ-анализ даже самого маленького белка, когда имеется прочно связывающееся нанотело. Размер нанотела увеличивается до ~ 120 кДа за счет двух жестко прикрепленных каркасов.Общий дизайн напоминает конструкцию Lego, поэтому мы предлагаем назвать ансамбль каркасов / нанотело «Legobody». Полезность метода Legobody демонстрируется структурами двух небольших белков (22 кДа и 23 кДа), которые являются асимметричными мономерами и имеют размер значительно ниже расчетного предела для прямого крио-ЭМ анализа одиночных частиц (~ 40 кДа) (15 ). Подход Legobody может быть легко применен к любому целевому белку и должен значительно расширить использование крио-ЭМ анализа одиночных частиц, преодолев существующие ограничения по размеру.

Результаты

Получение Fab, связывающегося с нанотелами.

Наш первый каркас, взаимодействующий с нанотелами, представляет собой Fab-фрагмент антитела, который направлен против поверхности, присутствующей во многих нанотелах, и не участвует во взаимодействии с мишенью. Для создания такого Fab мы вырабатывали моноклональные антитела у мышей против нанотела (Nb_0), которое содержит каркасную последовательность, почти идентичную той, которая используется в двух библиотеках, используемых для быстрого скрининга in vitro (12, 13). Аминокислоты в антиген-взаимодействующих областях, определяющих комплементарность (CDR) Nb_0, были выбраны для минимизации иммуногенности антиген-взаимодействующей поверхности (последовательность см. В приложении SI , таблица S1).Для отбора моноклональных клеток, которые не нарушают взаимодействие нанотело-антиген, клоны гибридомы подвергали скринингу с комплексом нанотела против MBP (Nb_MBP) и его антигена MBP (12). После нескольких раундов отбора был получен клон гибридомы 8D3, который продуцировал моноклональные антитела, которые прочно связываются как с Nb_0, так и с комплексом Nb_MBP / MBP.

Хотя можно напрямую использовать антитела, секретируемые клоном 8D3, для генерации Fab-фрагментов, будущие применения значительно упростятся, если Fab можно получить рекомбинантно.С этой целью мы сначала определили последовательности ДНК областей, кодирующих вариабельные области легкой и тяжелой цепей клона 8D3. Затем эти последовательности объединяли с последовательностями, кодирующими константные области мышиного IgG1, и оба гена экспрессировали вместе в клетках HEK293. Поскольку выход Fab был довольно низким, константные области легкой и тяжелой цепей были заменены таковыми из человеческого IgG. Полученный Fab_8D3 экспрессировался в клетках HEK293 как секретируемый белок и очищался хроматографией на никель-нитрилотриуксусной кислоте (Ni-NTA) на основе His-метки, присоединенной к тяжелой цепи.Выход составляет от ~ 5 до 8 мг из 1 л культуры клеток. Рекомбинантно очищенный Fab_8D3 образует стабильный комплекс с нанотелом Nb_0, как показано путем миграции белков в эксклюзионной хроматографии (фиг. 1 A ).

Генерация двух каркасов, взаимодействующих с нанотелами. ( A ) Нанотело Nb_0 смешивали с Fab_8D3 и комплекс подвергали гель-фильтрации. Фракции анализировали электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) и окрашиванием кумасси синим.( B ) Кристаллическая структура комплекса Nb_0 / Fab_8D3 показана в мультипликационном представлении. Nb_0 окрашен в желтый цвет, а Fab_8D3 — в синий. ( C ) Схема нанотела с β-нитями, помеченными в соответствии с условными обозначениями. Петли CDR окрашены в красный цвет, а области, взаимодействующие с Fab, — в синий. ( D ) Схема взаимодействия нанотела (Nb; желтый) с доменом C белка A (PrAC; оранжевый), привитого на мальтозосвязывающий белок (MBP; фиолетовый). Взаимодействующие области между Nb и MBP_PrAC показаны оранжевым цветом с пунктирными линиями между ними.( E ) PrAC, слитый с MBP через гибкий линкер (MBP_L_PrAC) или привитый к MBP (MBP_PrAC), смешивали с Nb. Смесь инкубировали со смолой амилозы, взаимодействующей с МВР, и связанный материал анализировали с помощью SDS-PAGE и окрашивания кумасси синим. Ввод соответствует 50% материала, используемого для вытяжки.

Чтобы идентифицировать точную поверхность взаимодействия, мы определили кристаллическую структуру комплекса Fab_8D3 и Nb_0. Убедившись, что кристаллы содержат оба компонента ( SI Приложение , рис.S1 A ), структура комплекса была определена с разрешением 1,8 Å (рис. 1 B и SI Приложение , таблица S2). Как и ожидалось, Fab_8D3 связывается с поверхностью Nb_0, которая удалена от CDR и содержит консервативные аминокислоты, присутствующие во многих нанотелах (фиг. 1 C и SI, приложение , фиг. S1 B ). Fab-взаимодействующие аминокислоты Nb_0 расположены в петлях между β-цепями A и B, C и C ‘, E и F, а также в сегментах β-цепей A и G.Следует отметить, что четыре аминокислоты (LEHH), введенные путем клонирования метки His, также участвуют во взаимодействии (рис. 1 C ). Обширные взаимодействия между Fab и нанотелом создают жесткую границу раздела, вывод подтверждается профилем B-фактора рентгеновской структуры ( SI Приложение , рис. S1 C ).

Создание каркаса на основе MBP, взаимодействующего с нанотелами.

Второй каркас был разработан на основе сообщений о том, что белок А из Staphylococcus aureus может связываться с нанотелами (16).Белок A содержит пять повторов трехспиральных пучков (домены A – E). Все эти домены связаны с константной областью антител IgG, но также связываются с различной аффинностью с вариабельной областью тяжелой цепи некоторых антител (человеческое семейство V _H 3) (17), областью, которая по последовательности сходна с общий каркас многих нанотел. В соответствии с этой гомологией последовательности, белок А, как сообщается, взаимодействует с нанотелами таким же образом, как и с Fab (18). Чтобы идентифицировать домен A с наиболее сильным связыванием белка, мы слили домен D (PrAD) и наиболее расходящиеся домены C и E (PrAC и PrAE) через длинный гибкий линкер с MBP (MBP_L_PrAC, MBP_L_PrAD и MBP_L_PrAE) и протестировали эти слияния на их взаимодействие с нанотелом.Соэлюция белков при эксклюзионной хроматографии показала, что все три домена взаимодействуют с нанотелом, но домен C образует наиболее стабильный комплекс ( SI, приложение , рис. S2 A ).

Затем мы прививали домен C протеина A (PrAC; ∼6 кДа) к MBP для создания более крупного партнера по связыванию нанотел. MBP часто используется в качестве N-концевого партнера по слиянию, так как он может увеличивать растворимость своих партнеров по слиянию. Хотя слияния могут быть сконструированы как спиральные продолжения C-концевой спирали MBP и широко используются в рентгеновской кристаллографии (19), такие линкеры недостаточно жесткие для крио-ЭМ анализа.Чтобы создать более жесткую связь между PrAC и MBP, мы использовали подход «общей спирали» (20), применив его к спирали домена C, который не участвует во взаимодействии нанотел ( SI Приложение , рис. S2 B ). Остатки на одной стороне этой спирали были мутированы в остатки С-концевой спирали ОБМ, которые обращены к сердцевине ОБМ. Полученная конструкция MBP_PrAC (фиг. 1 D ) могла быть экспрессирована в Escherichia coli и очищена в больших количествах. Подобно слиянию MBP с PrAC, содержащим гибкий линкер (MBP_L_PrAC), MBP_PrAC взаимодействовал с нанотелом в экспериментах с методом pull-down (рис.1 E ).

Сборка Legobody.

Поверхности нанотел, взаимодействующие с Fab_8D3 и MBP_PrAC, не перекрываются (рис. 2 A и B ), что дает возможность использовать оба каркаса одновременно. Чтобы повысить стабильность ансамбля, мы слили два Fab-связывающих домена с С-концом MBP_PrAC. Одним из них является домен D протеина A (PrAD), который, как было показано, взаимодействует с вариабельной областью тяжелой цепи Fab (21). Другой — белок G (PrG), который, как известно, сильно взаимодействует с константной областью тяжелой цепи (22).Все домены были связаны короткими линкерами, образуя каркас, обозначенный MBP_PrA / G (фиг. 2 A и B ). Чтобы сделать возможным взаимодействие PrAD с Fab_8D3, некоторые остатки в вариабельной области тяжелой цепи были мутированы на основе кристаллической структуры комплекса Fab / PrAD (код PDB 1DEE), образуя Fab_8D3_2. Эффекты авидности увеличивают константы связывания каркасов MBP_PrAC и Fab для нанотела, делая сборку в целом очень стабильной.

Сборка и очистка Legobody. ( A ) Схема сборки Legobody. Fab_8D3-2, производное Fab_8D3, и MBP_PrAC связываются непосредственно с нанотелом (Nb). Взаимодействующий с Fab D-домен белка A (PrAD) и белка G (PrG) последовательно сливали с C-концом MBP_PrAC через короткие линкеры, образуя MBP_PrA / G. Взаимодействующие поверхности окрашены и выделены пунктирными линиями. ( B ) Модель собранного Legobody в мультипликационном представлении. Модель собрана из структур Nb_0 / Fab_8D3 (рис.1 B ), Fab / PrAD (код PDB 1DEE) и Fab / PrG (код PDB 1IGC), а также путем ручного построения модели для MBP_PrAC из структур MBP (код PDB 1ANF) и PrAC (код PDB 4NPD) . ( C ) Legobody, собранный из нанотела, подвергали гель-фильтрации. Фракции анализировали с помощью SDS-PAGE и окрашивания кумасси синим. ( D ) Очищенное тело Legobody анализировали с помощью EM с отрицательным окрашиванием. Показаны типичные средние значения 2D-класса с плотностью нанотела, выделенной стрелкой.

Комплекс между Fab_8D3_2 и MBP_PrA / G был собран перед добавлением нанотела. Все три компонента были объединены в эксклюзионной хроматографии (фиг. 2 C ). Негативное окрашивание EM показало сильные структурные особенности для различных частей Legobody (рис. 2 D ), предполагая общую жесткость сборки, предположение, подтвержденное последующим крио-EM-анализом (см. Ниже).

Пример I: рецептор KDEL (~ 23 кДа).

Чтобы проверить применимость метода Legobody, мы сначала выбрали небольшой мембранный белок, рецептор KDEL.Этот белок связывается с С-концевой последовательностью KDEL белков люминального эндоплазматического ретикулума (ER), которые вышли из ER, так что эти белки могут быть возвращены из Golgi в ​​ER посредством везикулярного транспорта (23). Рецептор KDEL имеет семь трансмембранных сегментов и молекулярную массу всего около 23 кДа. Сообщалось о кристаллической структуре рецептора KDEL в комплексе с прочно связывающимся нанотелом (24).

Чтобы получить образец, пригодный для крио-ЭМ анализа, мы разработали протокол, который должен быть применим ко многим другим сложным мембранным белкам (рис.3 А ). Солюбилизированный рецептор KDEL (KDELR), помеченный стрептавидин-связывающим пептидом, сначала иммобилизовали на стрептавидиновых гранулах. Мы использовали детергент децилмальтоза неопентилгликоль (DMNG), так как он привел к более гомогенному образцу, чем н-додецил-β-D-мальтозид (DDM), использованный для кристаллической структуры (24). Гранулы, содержащие KDELR, затем инкубировали с Legobody, содержащим указанное нанотело (Nb_KR) против KDELR (24). Наконец, чтобы уменьшить агрегацию во время очистки, комплекс был преобразован в нанодиск на шариках.После элюирования гранул биотином комплекс KDELR, Legobody и нанодиск дополнительно очищали эксклюзионной хроматографией (фиг. 3 B ). Негативное окрашивание EM показало особенности Legobody и нанодиска (рис. 3 C ).

Очистка комплекса KDELR / Legobody. ( A ) Схема очистки комплекса KDELR / Legobody. KDELR, растворенный в детергенте, иммобилизовали на гранулах стрептавидина. Смолу инкубировали с очищенным Legobody.Добавляли нанодисковый каркасный белок MSP1D1 и липиды, и восстановление нанодисков было инициировано добавлением BioBeads. После обширного удаления детергента комплекс был элюирован со смолы биотином. ( B ) Элюированный комплекс KDELR, Legobody и нанодиска подвергали гель-фильтрации и элюции белка с последующим поглощением при 280 нм ( верхний ). Фракции между указанными пунктирными линиями анализировали с помощью SDS-PAGE и окрашивания кумасси синим ( Нижний ).Фракции, отмеченные звездочкой, объединяли и использовали для анализа ЭМ. ( C ) Очищенный комплекс анализировали с помощью EM с отрицательным окрашиванием. Показаны типичные средние значения 2D-класса с плотностью нанодиска, выделенной стрелкой.

Далее мы проанализировали комплекс с помощью крио-ЭМ. При размещении непосредственно на электромагнитных решетках частицы демонстрировали сильную агрегацию и сильную предпочтительную ориентацию, вероятно, вызванную денатурацией молекул на границе раздела вода-воздух. Чтобы решить эту проблему, поверхностные остатки лизина были модифицированы низкомолекулярным полиэтиленгликолем (PEG), ранее внедренным методом, который делает поверхность белков более гидрофильной и снижает их денатурацию на сетках (25).Хотя частицы все еще демонстрировали некоторую агрегацию и предпочтительную ориентацию ( SI, приложение , рис. S3), крио-ЭМ-анализ был несложным, так как размер и уникальная форма Legobody значительно облегчили сбор частиц и двумерное (2D) и трехмерная (3D) классификация. Окончательное трехмерное уточнение выбранных частиц привело к трехмерной реконструкции с общим разрешением 3,2 Å и небольшими различиями в разрешении по направлению ( SI Приложение , рис.S3 и Таблица S3).

За исключением относительно гибкого домена PrAD, все части Legobody и KDELR имели хорошо разрешенные структурные особенности, что позволяло даже визуализировать молекулу мальтозы, связанную с MBP (Рис. 4 A и SI Приложение , Рис. S4 A ). Локальное разрешение варьировалось от 3,0 до ∼4,0 Å и показало, что взаимодействия между двумя каркасами и нанотелом, а также связь между PrAC и MBP являются жесткими (рис.4 В ). Поскольку нанотело тесно связано с KDELR, и поскольку центр выравнивания Legobody находится в положении нанотела, для KDELR была получена отличная карта (рис. 4 C ). Локальное разрешение этой части карты варьировалось от 3,0 до ∼3,5 Å, и все боковые цепи аминокислот KDELR были четко видны. Кроме того, можно легко идентифицировать несколько связанных молекул фосфолипидов. Крио-ЭМ структура комплекса KDEL / нанотело практически идентична структуре, полученной с помощью рентгеновской кристаллографии ( SI Приложение , рис.S4 B ) (24).

Крио-ЭМ структура комплекса KDELR / Legobody. ( A ) Крио-ЭМ карта комплекса KDELR / Legobody на нанодисках с разрешением 3,2 Å, показанная на двух изображениях. Область KDELR выделена розовым цветом, а связанные фосфолипиды — голубым. Области компонентов Legobody помечены и показаны разными оттенками желтого и оранжевого цветов. Плотность мальтозы, связанной с MBP, показана красным. Сплошная линия показывает контур крио-ЭМ карты, отфильтрованной до 10 Å, что позволяет визуализировать нанодиск и гибкий домен PrAD (, правый, ).( B ) Два вида окончательной карты, раскрашенные в соответствии с местным разрешением (масштаб справа ). ( C ) Карта и подобранная модель для различных сегментов KDELR и связанных фосфолипидов.

Пример из практики II: рецептор-связывающий домен белка-шипа SARS-CoV-2 (~ 22 кДа).

Нашим вторым тестовым белком для метода Legobody был рецептор-связывающий домен (RBD) шипового белка SARS-CoV-2. RBD позволяет SARS-CoV-2 связываться с рецептором ACE2 и инфицировать клетки человека (26).Это взаимодействие представляет большой медицинский интерес, особенно во время текущей пандемии, и поэтому было создано множество нейтрализующих RBD нанотел (27). RBD имеет молекулярную массу всего около 22 кДа.

RBD экспрессировался в клетках HEK293 как секретируемый белок и очищался с помощью Ni-NTA хроматографии на основе прикрепленной His-метки. Белок смешивали с предварительно собранным Legobody, содержащим зарегистрированное нанотело (Nb_RBD) против RBD (28). Комплекс дополнительно очищали эксклюзионной хроматографией (рис.5 A ) и проанализированы с помощью крио-ЭМ. После двухмерной и трехмерной классификации с последующим трехмерным уточнением была получена карта с общим разрешением 3,6 Å, опять же с небольшими различиями в разрешении по направлениям (Рис. 5 B и SI Приложение , Рис. S5 A – E и Таблица S3). Локальное разрешение варьировалось от ∼3,4 до ∼4,4 Å и показало хорошую плотность для центральных областей Legobody и белка-мишени (рис. 5 C ). В частности, область RBD показала хорошую плотность боковой цепи для аминокислот на границе с нанотелом (рис.5 D ). Крио-ЭМ структура комплекса RBD / нанотело практически идентична структуре, полученной с помощью рентгеновской кристаллографии ( SI Приложение , рис. S5 F ) (29). Некоторые полипептидные петли дистальнее интерфейса связывания были невидимы на крио-ЭМ карте ( SI, приложение , фиг. S5, F ). Смещенная ориентация частиц предполагает, что это может быть вызвано частичной денатурацией RBD на границе раздела вода / воздух, то есть проблемами, не связанными с методом Legobody.Умеренная предпочтительная ориентация частиц, наблюдаемая с KDELR, и несколько более сильное смещение, наблюдаемое с RBD, вероятно, не вызваны самим Legobody, так как заполненные углы были разными.

Крио-ЭМ структура комплекса домена RBD шипового белка SARS-CoV-2 и Legobody. ( A ) Очищенный RBD смешивали с Legobody, содержащим нанотело, направленное против RBD (Nb_RBD). Образец подвергали гель-фильтрации и фракции анализировали с помощью SDS-PAGE и окрашивания кумасси синим.Фракции, помеченные звездочкой, объединяли и использовали для анализа ЭМ. ( B ) Крио-ЭМ карта комплекса RBD / Legobody. Область RBD показана зеленым цветом. Области компонентов Legobody помечены и показаны разными оттенками желтого и оранжевого цветов. Плотность мальтозы, связанной с MBP, показана красным. ( C ) Два вида окончательной карты, раскрашенные в соответствии с местным разрешением (масштаб справа ). ( D ) Карта и подобранная модель для интерфейса между RBD и нанотелом.

Общая применимость метода Legobody.

Метод Legobody был разработан с использованием нанотел, которые имеют общую структуру, аналогичную той, которая используется в двух библиотеках in vitro (12, 13). Поверхности, взаимодействующие с Fab и MBP_PrAC, в этих библиотеках по существу идентичны, и поэтому все выбранные нанотела можно использовать непосредственно для метода Legobody. Однако нанотела, созданные у альпаки, часто имеют другой каркас. Например, нанотело, направленное против пептида ALFAtag, который часто используется для очистки или визуализации слитых белков (30), значительно отличается по своей каркасной последовательности (идентичность последовательностей ~ 75%) и поэтому не допускает взаимодействия с нашими каркасами.В частности, девять аминокислотных остатков в областях, взаимодействующих с Fab и PrAC, отличаются от остатков в общей структуре. Однако, когда эти остатки мутируют, полученные Nb_ALFA могут быть собраны в Legobody ( SI Приложение , рис. S6, A и B ). Эти мутации не влияют на связывание антигена, поскольку пептид ALFA, меченный GST, был способен разрушить предварительно собранное Legobody, содержащее модифицированное нанотело ( SI Приложение , рис. S6 B ).Поэтому мы считаем, что можно использовать все нанотела, независимо от того, получены ли они из библиотек in vitro или от видов животных.

Обсуждение

Здесь мы описываем общий метод, который позволяет определять крио-ЭМ структуры для небольших белков. Таким образом, наш подход Legobody преодолевает существующие ограничения крио-ЭМ анализа и значительно расширяет его возможности. Этот метод можно применять к любому целевому белку, когда доступно прочно связывающееся нанотело. Нанотело собирается в Legobody путем связывания двух каркасов, Fab-фрагмента и молекулы MBP, к которой был привит домен C домена протеина A (MBP_PrAC).Все взаимодействия были жесткими. Кроме того, Fab-взаимодействующие домены были слиты с MBP_PrAC для дальнейшего отверждения комплекса. Legobody имеет характерную форму, состоящую из двух боковых плеч, образованных двумя каркасами, и центрального лепестка, созданного нанотелом. Общий размер (~ 120 кДа) и форма Legobody, а также центр выравнивания в положении нанотела значительно облегчают все этапы крио-ЭМ-анализа, от отбора частиц, классификации до окончательного уточнения.Мы демонстрируем полезность метода Legobody на двух примерах небольших целевых белков (KDELR [23 кДа] и RBD [22 кДа] шипованного белка SARS-CoV-2).

Мембранный белок KDELR представляет особую проблему для крио-ЭМ-анализа, так как он мал, не имеет доменов вне мембраны и симметрии для облегчения выравнивания частиц на ЭМ-изображениях. Белок имеет тенденцию к агрегированию во время очистки и на крио-ЭМ решетках на границе раздела вода-воздух тонкого льда. Чтобы определить его структуру, мы не только использовали подход Legobody, но также применили два других приема, которые, вероятно, применимы к другим сложным мембранным белкам.Во-первых, мы использовали стратегию очистки, в которой комплекс KDELR / Legobody был включен в нанодиск, связанный с шариками (рис. 3 A ). Эта стратегия снижает агрегацию рецептора и увеличивает его стабильность в растворе. Во-вторых, перед нанесением образца на ЭМ-сетки мы модифицировали поверхностные лизины низкомолекулярным ПЭГ. Мы обычно использовали этот протокол для других белков (25, 31, 32), и он часто резко снижает агрегацию частиц и предпочтительную ориентацию частиц.Используя стандартный анализ крио-ЭМ данных, мы смогли получить высококачественную карту для KDELR с плотностью, видимой для всех боковых цепей аминокислот. Карта позволила бы легко построить модель de novo.

KDELR является представителем большой группы мембранных белков, которые имеют небольшой размер и создают аналогичные проблемы для крио-ЭМ анализа. Примеры включают рецепторы, связанные с G-белком, переносчики растворенных веществ и встроенные в мембраны ферменты, многие из которых представляют большой интерес для разработки лекарств.Теперь метод Legobody делает все эти белки доступными для крио-ЭМ-анализа. Конечно, целевые белки могут принимать несколько физиологически значимых конформаций, а нанотело может выбирать только одну из них.

RBD шипового белка SARS-CoV-2 также представляет проблему для крио-ЭМ-анализа, поскольку он небольшой и состоит в основном из β-цепей и протяженных полипептидных сегментов, которые сложнее смоделировать в карту, чем α -медицины. Карта, полученная с помощью подхода Legobody, была хорошего качества, особенно на интерфейсе RBD / нанотело, с плотностью боковых цепей для всех взаимодействующих аминокислот.Поскольку этот интерфейс представляет собой область медицинских интересов, наши результаты показывают, что крио-ЭМ можно использовать для оптимизации RBD-нейтрализующих нанотел, что может быть важно для быстрого реагирования на будущие вирусные пандемии. По сравнению с рентгеновской кристаллографией, крио-ЭМ требует лишь небольшого количества белка и может выполняться за значительно более короткий период времени.

Возможное ограничение метода Legobody могло возникнуть из-за стерических столкновений между каркасами и мишенями. Чтобы проверить, является ли это серьезной проблемой, кристаллические структуры комплексов нанотела с небольшими мономерными целевыми белками были выровнены со структурой Legobody на основе нанотела.Наблюдаемые стерические конфликты перечислены в приложении SI , таблица S4. Для растворимых белков было найдено только три примера, в которых Fab или MBP_PrAC будут конфликтовать с мишенью. Для мембранных белков, встроенных в мицеллы детергентов, нанодиски или кубическую фазу липидов, конфликты иногда могут быть вызваны доменом PrAD или каркасом MBP_PrAC. Для Fab конфликтов не наблюдалось, но количество доступных структур слишком мало, чтобы исключить их существование в других случаях. Конфликтов с доменом PrAD можно избежать, удалив этот домен и подключив MBP_PrAC напрямую к PrG через подходящий линкер.Фактически, этот домен только слабо связывается с предполагаемым сайтом связывания на Fab и, следовательно, должен быть незаменим даже в исходной конструкции. Тесты на совместимость каркасов с взаимодействием нанотело / мишень просты (аналогично экспериментам с понижением в SI Приложение , рис. S6 B ), которые также можно использовать для быстрого поиска совместимых нанотел. с обоими каркасами, избегая нанотел, которые могут вызвать стерические столкновения.

Из-за модульной конструкции Legobody только один из двух каркасов может быть прикреплен к нанотело.Например, для определенных целей может быть достаточно Fab-фрагмента. Если используется только каркас MBP_PrAC, мы рекомендуем сплавить нанотело с N-концом MBP_PrAC через гибкий линкер. Однако использование обоих каркасов вместе не только увеличивает размер мишени, но и обеспечивает уникальную форму, которая легко распознается на ЭМ-изображениях. Кроме того, оба каркаса могут увеличивать растворимость и монодисперсность целевого белка. Например, KDELR имеет тенденцию к агрегированию во время очистки, если либо Fab, либо каркас MBP_PrA / G опущены.

Legobody, использованный в этом исследовании, можно легко модифицировать для дальнейшего увеличения его молекулярной массы, стабильности и жесткости, что поможет еще больше улучшить разрешение крио-ЭМ карт. Например, трехспиральный пучок PrAC может быть сконструирован так, чтобы увеличить его сродство к связыванию с нанотелом, или он может быть трансплантирован на другие большие белки. Кроме того, слияния могут быть созданы с белком L (33) или модифицированной версией белка M (34), которые связываются с Fab в других сайтах, чем партнеры слияния, используемые в текущей конструкции Legobody.Мы полагаем, что современные Legobody и их возможные варианты сделают определение крио-ЭМ структуры малых белков рутинным методом.

Методы

Очистка нанотел.

Гены нанотел, меченных His или Strep II, клонировали в вектор pET 26b (Novagen). Экспрессия и очистка всех His-меченных нанотел были описаны ранее (13). Для иммунизации мышей His-метку удаляли обработкой очищенного нанотела Nb_0 карбоксипептидазой A (Sigma) и B (Roche) в течение ночи при 4 ° C.Обработанные нанотела пропускали через колонку Ni-NTA (Thermo Fisher), и проточную фракцию дополнительно очищали с помощью эксклюзионной хроматографии на колонке S75 с увеличением 10/300 GL (Cytiva) в 25 мМ Hepes pH 7,4, 150 мМ. NaCl, 5% глицерин. Нанотело против MBP (Nb_MBP) было получено из Sb_MBP # 1 (12). Нанотело Nb_MBP, меченное Strep II, очищали с использованием смолы StrepTactin (IBA). Гранулы промывали 25 мМ Hepes pH 7,4, 150 мМ NaCl и белок элюировали 25 мМ Hepes pH 7.4, 150 мМ NaCl, 2 мМ дестиобиотин. Для скрининга клонов гибридомных клеток использовали комплекс меченных Strep II нанотел Nb_MBP и MBP. Элюированный белок Nb_ MBP, меченный Strep II, смешивали с отдельно очищенным белком MBP в молярном соотношении 3: 1. Смесь подвергали эксклюзионной хроматографии на колонке S200 увеличение 10/300 GL (Cytiva) в 25 мМ Hepes pH 7,4, 150 мМ NaCl, 5% глицерине. Пиковые фракции комплекса были сохранены для будущего использования. Нанотела против рецептора KDEL (Nb_KR) и против домена RBD шипа SARS-CoV-2 (Nb_RBD) были получены из Syb37 (24) и Sb # 45 (28) соответственно.

Создание антител против нанотел.

Моноклональные антитела были получены путем иммунизации мышей очищенным нанотелом без метки Nb_0 в моноклональном ядре VGTI. Нанотело Nb_0, используемое для иммунизации и скрининга гибридом, также содержало две мутации в общей структуре (S7Y и S17Y), предназначенные для увеличения шансов выбора связывания Fab рядом с этой областью, но кристаллическая структура показала, что они не участвуют в связывании Fab. Клоны гибридом подвергали скринингу в неденатурирующих условиях с использованием очищенного комплекса, состоящего из меченых Strep II Nb_MBP и MBP.Антитела, секретируемые клоном 8D3, связывают как Nb_0, так и комплекс Nb_MBP / MBP с высокой аффинностью. Клон 8D3 был расширен для дальнейшей характеристики. Последовательности вариабельной легкой (V _L ) и тяжелой (V _H ) цепей моноклонального антитела были определены Syd Labs.

Рекомбинантная экспрессия Fab.

Для увеличения выхода рекомбинантной экспрессии Fab в клетках HEK293 константные области легкой и тяжелой цепей были заменены последовательностями из человеческих Fab (последовательности см. В приложении SI , таблица S1).Полученные химерные гены для легкой цепи и тяжелой цепи с His-меткой Fab были по отдельности клонированы в вектор pCAGEN (подарок Конни Сепко, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс) (плазмида Addgene № 11160) (35). Для котрансфекции 1-л культуры HEK293 ^freestyle (Thermo Fisher) 0,5 мг обеих плазмид инкубировали с 3 мг Linear PEI 25K (Polysciences) в 100 мл среды Opti-MEM (Thermo Fisher) при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем смесь по каплям добавляли в среду, содержащую клетки HEK293 ^freestyle , до достижения конечной плотности клеток 2 миллиона / мл.Клетки культивировали при 37 ° C в течение от ~ 12 до 16 ч перед добавлением 10 мМ бутирата натрия для усиления экспрессии. Среду, содержащую секретированные Fab, собирали через ~ 48–62 ч после трансфекции. Очистку Fab проводили следующим образом: к собранной среде, свободной от клеток, добавляли 50 мМ Трис pH 8,0, 200 мМ NaCl, 20 мМ имидазол и 1 мкМ NiSO ₄ . Fab-фрагменты, меченные His, очищали с помощью Ni-NTA хроматографии. Гранулы тщательно промывали 25 мМ Hepes pH 7,4, 200 мМ NaCl, 20 мМ имидазолом.Fab-фрагменты элюировали 25 мМ Hepes pH 7,4, 200 мМ NaCl, 300 мМ имидазолом. Элюированные Fab концентрировали и буфер заменяли на 25 мМ Hepes pH 7,4, 150 мМ NaCl, 5% глицерин. Аликвоты были мгновенно заморожены для использования в будущем.

На основании сообщений о том, что Fabs взаимодействуют преимущественно с доменом D белка A (17), и на кристаллической структуре комплекса Fab и этого домена (код PDB 1DEE), мы ввели несколько мутаций в вариабельную область тяжелой цепи частично гуманизированный Fab_8D3 (см. выше), приводящий к Fab_8D3_2 (мутации: G16K, R18L, K19R, I58K, F80Y и T84N; последовательность показана в SI Приложение , Таблица S1).Fab_8D3_2 очищали так же, как исходный Fab_8D3.

Определение кристаллической структуры комплекса Nb_0 / Fab_8D3.

Очищенный His-меченый Fab_8D3 смешивали с очищенным His-меченным нанотелом Nb_0 в молярном соотношении 1: 3. Смесь обрабатывали карбоксипептидазой A (Sigma) в течение ночи при 4 ° C для удаления меток His. Образец подвергали эксклюзионной хроматографии на колонке S200, увеличивающей 10/300 GL, в 25 мМ Hepes pH 7,4, 150 мМ NaCl. Пиковые фракции комплекса объединяли и концентрировали до 10 мг / мл и использовали для настройки кристаллических экранов.

Очищенный комплекс Nb_0 / Fab_8D3 (0,2 мкл раствора 10 мг / мл) смешивали с 0,2 мкл маточного раствора, содержащего 0,2 М формиат аммония, от 20 до 22% мас. / Об. PEG 3350 с использованием робота Mosquito (TTP LabTech). Кристаллы выращивали при 4 ° C методом висящей капли над резервуаром на 100 мкл маточного раствора и достигли полного размера примерно за 2 недели. Кристаллы перед сбором подвергали криозащите в растворе, содержащем маточный раствор с добавлением 25 мМ Hepes 7,5 и 18% этиленгликоля. Данные дифракции рентгеновских лучей были собраны на канале 24-ID-E в усовершенствованном источнике фотонов (APS).Начальные фазы были получены путем молекулярной замены с использованием кристаллических структур Fab и нанотел с аминокислотными последовательностями, аналогичными поисковым моделям. В обеих моделях поиска CDR были удалены.

Очистка сплавов MBP.

Последовательности всех слитых белков MBP приведены в приложении SI , таблица S1. Основываясь на кристаллических структурах и моделировании, мы предсказали, что остаток Ala405 MBP_PrA / G-His6 близок к Fab, и поэтому мутировали его на гистидин для усиления взаимодействия.Все варианты MBP очищали следующим образом: гены клонировали в вектор pET28b (Novagen) с N- или C-концевой меткой His6. Экспрессию индуцировали добавлением 1 мМ изопропилтио-β-галактозида (IPTG) в течение 4 часов при 37 ° C. Клетки лизировали ультразвуком в 25 мМ Hepes pH 7,4, 400 мМ NaCl, 20 мМ имидазоле. Белки очищали с помощью Ni-NTA хроматографии с использованием буфера для лизиса в качестве буфера для промывки. После элюирования имидазолом белки подвергали эксклюзионной хроматографии на колонке S200 с увеличением 10/300 GL в 25 мМ Hepes pH 7.4, 150 мМ NaCl, 5% глицерин. Пиковые фракции были сохранены для будущего использования.

Очистка GST-слитого пептида ALFA.

GST-слитый пептид ALFA очищали следующим образом. Ген пептида ALFA клонировали в вектор pGEX6p1 (Cytiva). Экспрессию индуцировали добавлением 1 мМ IPTG в течение 5 часов при 30 ° C. Клетки лизировали ультразвуком в 25 мМ Hepes pH 7,4, 400 мМ NaCl. Белки очищали смолами GST с использованием буфера для лизиса в качестве буфера для промывания. После элюирования восстановленным глутатионом (GSH) белки подвергали эксклюзионной хроматографии на колонке S200 с увеличением 10/300 GL в 25 мМ Hepes pH 7.4, 150 мМ NaCl, 5% глицерин. Пиковые фракции были сохранены для будущего использования.

Очистка Legobody.

Legobody собирали путем первой инкубации очищенного MBP_PrA / G с Fab_8D3_2 в молярном соотношении 1: 1,1 в 25 мМ Hepes pH 7,4, 150 мМ NaCl. Затем смесь инкубировали с выбранным нанотелом, добавленным в трехкратном молярном избытке по сравнению с MBP_PrA / G. Образец наносили на амилозную смолу, и комплекс элюировали 25 мМ Hepes pH 7,4, 150 мМ NaCl, 20 мМ мальтозой. Legobody дополнительно очищали эксклюзионной хроматографией на колонке S200 увеличивающей 10/300 GL в 25 мМ Hepes pH 7.4, 150 мМ NaCl, 5% глицерин, 2 мМ мальтоза. Пиковые фракции комплексов были сконцентрированы и сохранены для будущего использования.

Очистка комплекса KDELR и Legobody.

Кодон-оптимизированный ген для полноразмерного KDELR с меткой SBP на его С-конце был клонирован в вектор pRS425-Gal1 (ATCC 87331) (36). Экспрессию рецептора и приготовление мембранных фракций проводили, как описано ранее (25). Мембраны из 15 г клеток INVSc1 (Invitrogen), экспрессирующих рецептор, солюбилизировали в 30 мл 25 мМ Hepes pH 7.4, 400 мМ NaCl, 1% DMNG (Anatrace) в течение 1 часа. После удаления нерастворимого материала ультрацентрифугированием лизат инкубировали с 250 мкл стрептавидиновой смолы (Thermo Fisher) в течение 1,5 часов. Гранулы собирали и к связанному рецептору KDEL добавляли избыток очищенного Legobody, чтобы способствовать образованию комплекса на смоле. После 1 ч инкубации смолу промывали восемью объемами колонки 25 мМ Hepes pH 7,4, 150 мМ NaCl, 2 мМ мальтозы, 0,02% DMNG. Нанодиски были собраны на смоле добавлением 1.25 мМ липидов (POPC / DOPE [Avanti] в соотношении 4: 1 в DDM [Anatrace]) и 25 мкМ нанодисковый каркасный белок MSP1D1 в 700 мкл промывочного буфера. После 30 мин инкубации детергенты удаляли добавлением двух аликвот по 40 мг Bio-Beads и инкубацией в течение ночи. На следующий день стрептавидиновые смолы были отделены от Bio-Beads SM-2 (Bio-Rad), воспользовавшись их различной скоростью осаждения под действием силы тяжести. Смолы стрептавидина промывали 25 мМ Hepes pH 7,4, 150 мМ NaCl, 2 мМ мальтозой и связанный материал элюировали биотином.Комплекс рецептора KDEL / Legobody на нанодиске затем очищали эксклюзионной хроматографией на колонке S200 с увеличением 5/150 GL в 25 мМ Hepes pH 7,4, 150 мМ NaCl, 2 мМ мальтозе. Пиковые фракции комплекса концентрировали, мгновенно замораживали и хранили для крио-ЭМ анализа.

Очистка комплекса спайкового домена RBD SARS-CoV-2 и Legobody.

Кодон-оптимизированный ген для домена RBD (остатки от 334 до 526) шипового белка SARS-CoV-2 с N-концевой меткой Flag и C-концевой меткой His8 клонировали в вектор pCAGEN.RBD экспрессировали и очищали так же, как Fab. После элюирования из гранул Ni-NTA белок подвергали эксклюзионной хроматографии на колонке S75 с увеличением 10/300 GL в 25 мМ Hepes pH 7,4, 150 мМ NaCl. Пиковые фракции смешивали с Legobody в молярном соотношении 3: 1. Смесь подвергали эксклюзионной хроматографии на колонке S200 увеличение 5/150 GL в 25 мМ Hepes pH 7,4, 150 мМ NaCl, 2 мМ мальтозе. Пиковые фракции комплекса концентрировали, мгновенно замораживали и хранили для крио-ЭМ анализа.

Крио-ЭМ пробоподготовка и сбор данных.

Комплекс KDELR / Legobody в концентрации 0,8 мг / мл был ПЭГилирован путем инкубации с MS (PEG) 12 метил-PEG-NHS-эфир (Thermo Fisher) в молярном соотношении 1:40 в течение 2 часов на льду для уменьшения предпочтительной ориентации частиц. по сеткам. Выбранное соотношение позволяет модифицировать максимум 1/3 общего количества лизинов, что сводит к минимуму влияние модификации ПЭГ на стабильность комплекса. Затем ПЭГилированный образец наносили на золотую сетку Quantifoil с тлеющим разрядом (1.2 / 1.3, 400 меш). Сетки промокали от ~ 6 до 7 с при 100% влажности и погружали в замороженный жидкий этан с использованием прибора Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher). Комплекс RBD / Legobody в концентрации 2,5 мг / мл инкубировали с MS (PEG) 12-метил-PEG-N-гидроксисукцинимид (NHS) -эфиром (Thermo Fisher) при молярном соотношении от ~ 1:25 до 1:28 в течение 2 часов. лед. Непосредственно перед погружным замораживанием ПЭГилированные образцы разбавляли с использованием буферов для гель-фильтрации, дополненных детергентом IGEPAL CA-630 (Sigma), так, чтобы конечные концентрации белка и детергента были равны 1.2 мг / мл и 0,005% соответственно. Сетки замораживали так же, как описано для образца KDELR / Legobody.

Крио-ЭМ-данные для всех образцов были собраны на электронном микроскопе Titan Krios (FEI), работающем при 300 кВ и оборудованном прямым электронным детектором K3 (Gatan) в Гарвардском крио-ЭМ центре структурной биологии. Фильтр Gatan Imaging с шириной щели 25 эВ использовался для удаления неупруго рассеянных электронов. Все фильмы крио-ЭМ были записаны в режиме счета с использованием SerialEM.Для образца KDELR / Legobody номинальное увеличение 81000 × соответствует калиброванному размеру пикселя 1,06 Å на образце. Скорость экспонирования составляла 23,38 электрона / Å ² / с. Общее время экспозиции составляло 2,2 с, в результате чего общая электронная экспозиция составляла 51,44 электрона / Å ² , разделенных на 50 кадров (44 мс на кадр). Для образца RBD / Legobody размер калиброванного пикселя составлял 1,06 Å. Скорость воздействия составила 23,3 электрона / Å ² / с. Общее время экспозиции составило 2.164 с, в результате чего общая электронная экспозиция составляет 50,42 электрона / Å ² , разделенных на 50 кадров (44 мс на кадр). Диапазон расфокусировки для обоих образцов составлял от -1,0 до -2,6 мкм.

Крио-ЭМ обработка изображений.

Для комплекса KDELR / Legobody фракционированные по дозе фильмы подвергали коррекции движения с помощью программы MotionCor2 (37) с взвешиванием дозы. Программа CtfFind4 (38) использовалась для оценки значений расфокусировки суммированных изображений по всем кадрам фильма. Во время сбора данных частицы (около 1 миллиона), отобранные YOLO (39) путем анализа «на лету» с использованием автоматического рабочего процесса в Гарвардской медицинской школе.Затем частицы были подвергнуты двухмерной классификации (T2, 80 классов, 30 итераций) в Relion 3.1 (40). Для трехмерной классификации исходная модель была создана ab initio в Relion 3.1. После одного раунда трехмерной классификации (Т4, 5 классов, 50 итераций) остался только один класс с четкими особенностями вторичной структуры белка. Частицы этого класса были выбраны для трехмерного уточнения, что привело к первоначальной реконструкции с общим номинальным разрешением 3,8 Å. Эта первоначальная 3D-реконструкция использовалась в качестве 3D-шаблона для выполнения автозапуска в Relion 3.1 по всему набору данных, что привело к 2 532 161 частицам. После двухмерной классификации (T2, 100 классов, 30 итераций) повторно выбранные частицы были «засеяны» частицами, которые использовались в предыдущем трехмерном уточнении для трехмерной классификации. После трехмерной классификации (Т4, 5 классов, 35 итераций) был выбран только класс, демонстрирующий четкие особенности вторичной структуры белка всего комплекса. После удаления дубликатов частицы были подвергнуты 3D-обработке с последующей полировкой, уточнением функции передачи контраста (CTF) и еще одним раундом 3D-уточнения.Локальная 3D-классификация без совмещения изображений (T20, 5 классов, 25 итераций) выполнялась с использованием маски, включающей только нанотело и KDELR. В итоге 246 878 частиц были отобраны для трехмерного уточнения с использованием маски, исключая нанодиск и более гибкий домен D белка A.

Для комплекса RBD / Legobody анализ данных был выполнен аналогичным образом, за исключением того, что частицы из оперативный анализ не уточнялся. Расчет местного разрешения и повышение резкости карты были выполнены в Relion 3.1. Все указанные разрешения основаны на золотых стандартных процедурах уточнения и критерии корреляции Фурье-оболочки (FSC) = 0,143. Гистограммы направленных кривых FSC и значения сферичности рассчитывались с помощью сервера 3DFSC (41).

Модель здания.

Все модели построены в Coot. Для кристаллической структуры Nb_0 / Fab_8D3 исходные фазы были получены путем молекулярного замещения с использованием модуля Phaser в Phenix (42). Модели поиска содержали нанотело, а также вариабельные и константные области Fab с аналогичной каркасной последовательностью.После получения исходной карты плотности модель была уточнена с твердыми телами, а затем модифицирована вручную. Модель была дополнительно уточнена с использованием модуля Phenix.refine с моделированием отжига, XYZ, TLS и отдельными B-факторами. Для крио-ЭМ-структур исходные модели были основаны на кристаллической структуре комплекса Nb_0 / Fab_8D3, модифицированном для учета мутаций в Fab_8D3_2, и кристаллических структурах рецептора KDEL (6I6J), RBD (7KGJ), вручную привитый MBP_PrAC (1ANF и 4NPD), домен D белка A (1DEE) и белок G (1IGC).Эти структуры были прикреплены к картам и вручную изменены на основе карты плотности крио-ЭМ. Затем модели были уточнены с использованием модуля уточнения реального пространства Phenix с Minimization_global, local_grid_search и Atomic Displacement Parameters (ADP). Для всех усовершенствований использовались вторичные ограничения, модельные ограничения и ограничения Рамачандрана.

Доступность данных

Все данные исследования включены в статью и / или дополнительную информацию. Координаты атомных моделей Nb_0 / Fab_8D3, KDELR / Legobody и RBD / Legobody были депонированы в базе данных белков с кодами доступа 7R9D (43), 7RXC (44) и 7RXD (45) соответственно.Крио-ЭМ карты KDELR / Legobody и RBD / Legobody депонированы с кодами доступа EMD-24728 (46) и EMD-24729 (47) соответственно. Плазмиды для Legobody были депонированы в Addgene [176075 (48), 176076 (49), 176077 (50)].

Благодарности

Мы благодарим С. Стерлинга, Р. Уолша и М. Майера из Гарвардского крио-электромагнитного центра структурной биологии за помощь в работе микроскопа и сборе данных. Рентгеноструктурные исследования основаны на исследованиях, проводимых Северо-восточной группой совместного доступа, которые финансируются Национальным институтом общих медицинских наук (NIGMS) Национального института здоровья (P30 GM124165).Детектор Eiger 16M на 24-ID-E финансируется грантом NIH-Office of Research Infrastructure Programs High-End Instrumentation (S10OD021527). В этом исследовании использовались ресурсы Advanced Photon Source, Управления науки Министерства энергетики США (DOE), эксплуатируемого для Управления науки Министерства энергетики Аргоннской национальной лабораторией по контракту DE-AC02-06Ch21357. Мы благодарим C. Bahl за первоначальные усилия по использованию Rosetta для дизайна слияний между MBP и доменами протеина A, T-C. Ху за помощь в создании Fabs, команду SBGrid за поддержку программного обеспечения и рабочих станций, а также Маофу Ляо и Сьюзан Шао за комментарии к рукописи.Эта работа была поддержана стипендией Джейн Коффин Чайлд для X.W. и награду NIGMS T.A.R. (R01GM052586).

Сноски

• Принято 30 августа 2021 г.

• Вклад авторов: X.W. задумал идею; X.W. разработанное исследование с участием T.A.R .; X.W. проведенное исследование; X.W. проанализированные данные; X.W. и T.A.R. написал статью; и T.A.R. курировал проект.

• Рецензенты: Y.C., Медицинский центр Сан-Франциско Калифорнийского университета; ГРАММ.C.L., Исследовательский институт Скриппса

• Заявление о конкурирующем интересе: Гарвардский университет подал заявку на патент от имени авторов в отношении конструкций связывающего нанотела каркасного белка.

• Эта статья представляет собой прямое представление PNAS.

• Эта статья содержит вспомогательную информацию в Интернете по адресу https://www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.2115001118/-/DCSupplemental.

• Авторские права © 2021 Автор (ы).Опубликовано PNAS.

Алгоритм глубокого обучения нацелен на ускорение инженерии белков

Белки — это молекулярные машины всех живых клеток, которые используются во многих областях, включая терапию и промышленные катализаторы. Чтобы преодолеть ограничения встречающихся в природе белков, белковая инженерия используется для улучшения характеристик белка, таких как стабильность и функциональность.В новом исследовании исследователи демонстрируют алгоритм машинного обучения, который ускоряет процесс инженерии белка. Об исследовании сообщается в журнале Nature Communications .

Алгоритмы машинного обучения помогают в инженерии белков, уменьшая экспериментальную нагрузку на такие методы, как направленная эволюция, которая включает в себя несколько раундов мутагенеза и высокопроизводительный скрининг.Они работают, моделируя и предсказывая пригодность всех возможных последовательностей целевого белка после обучения работе с базами данных последовательностей белков.

Несмотря на то, что существует множество алгоритмов машинного обучения, некоторые из них учитывают историю эволюции целевого белка. Здесь на помощь приходит ECNet (эволюционная контекстно-интегрированная нейронная сеть), алгоритм глубокого обучения.

«С помощью ECNet мы можем посмотреть на целевой белок и все его гомологи, чтобы увидеть, какие остатки связаны вместе и, следовательно, важны для этого конкретного белка», — сказал Стивен Л.Миллера, профессор химической и биомолекулярной инженерии Хуйминь Чжао (руководитель BSD / CABBI / CGD / GSE / MMG), также директор Института лаборатории создания молекул, финансируемого Национальным научным фондом (NSF). «Затем мы объединяем эту информацию и используем структуру глубокого обучения, чтобы выяснить, какие мутации важны для функции целевого белка».

В ходе сравнительного исследования исследователи показали, что ECNet превосходит существующие методы по нескольким наборам данных глубокого мутагенеза. В качестве последующего наблюдения, ECNet была использована для создания β-лактамазы ТЕМ-1 — фермента, придающего устойчивость к β-лактамным антибиотикам — и выявления вариантов, которые улучшили приспособленность и, следовательно, были более устойчивы к ампициллину.

Кроме того, ECNet уделяет первоочередное внимание мутантам более высокого порядка и новым мутантам в анализе. По словам Чжао, наличие вычислительного инструмента, который может успешно предсказывать взаимодействия более высокого порядка, может сократить экспериментальные усилия.

«Мы объединяем все белки в базе данных с конкретной историей эволюции целевого белка, чтобы повысить эффективность прогнозирования», — сказал Чжао. «Затем мы можем использовать мутанты, полученные в результате наших экспериментов, для дальнейшего улучшения и обучения модели.Работа над этим алгоритмом все еще продолжается, но это общее улучшение того, что уже известно в литературе ».

Чжао сказал, что исследователи в настоящее время используют ECNet для разработки ферментов-катализаторов с улучшенной селективностью.

Это исследование было совместным усилием профессора информатики Цзянь Пэн (CABBI). Среди других авторов исследования Юнань Луо, Гуандэ Цзян, Тяньхао Ю, Ян Лю, Лам Во, Ханьтянь Дин, Юфэн Су и Уэсли Вэй Цянь.

Ссылка : Алгоритм глубокого обучения нацелен на ускорение инженерии белков (2021 г., 8 октября) получено 8 октября 2021 г. с https: // физ.org / news / 2021-10-Deep-Learning-Algorithm-Target-Protein.html

Этот документ защищен авторским правом. За исключением честных сделок с целью частного изучения или исследования, никакие часть может быть воспроизведена без письменного разрешения. Контент предоставляется только в информационных целях.

Исследования подтверждают лучший источник белка для стартового корма для бройлеров

Пищеварительные и пищевые потребности цыплят

Молодые цыплята имеют слаборазвитую пищеварительную систему и в то же время имеют более высокие потребности в питательных веществах, чем бройлеры старшего возраста.Цыплята растут и развиваются более быстрыми темпами в течение первых двух недель вылупления, достигая веса в 4-4,5 раза больше их суточного веса. Каждый цыпленок в несколько раз увеличивается в весе, так как сердце, печень и пищеварительный тракт еще не набрали необходимых размеров для поддержки развития мышц и костей. Для обеспечения правильного роста необходимы точные питательные вещества, но способность усваивать питательные вещества ухудшается из-за неразвитости пищеварительного тракта цыпленка. В результате цыпленок черпает энергию из иммуноглобулинов и ненасыщенных жирных кислот в желточном мешке вместо того, чтобы использовать их для роста и иммунитета.

Чтобы преодолеть ограничения незрелого пищеварительного тракта, необходима особая рецептура корма, в которой потребление питательных веществ может быть увеличено в течение первых нескольких дней выращивания, чтобы улучшить общую продуктивность вплоть до убоя.

Источник легкоусвояемого протеина

HP AviStart — это уникальный источник легкоусвояемого белка, полученный в результате совместной ферментативной обработки соевых бобов и дрожжей. По сравнению со стандартными соевыми белками, он содержит очень низкий уровень антипитательных факторов, которые ограничивают усвоение питательных веществ корма.Это означает, что незрелый кишечник только что вылупившихся цыплят может легко впитывать питательные вещества, содержащиеся в продукте HP AviStart, тем самым стимулируя их здоровый рост и развитие с первого дня.

Высокая усвояемость HP AviStart в первую очередь обусловлена ​​очень низким содержанием небелкового азота (NPN), что является прямым отражением содержания аминокислот. При замене существующего источника белка, такого как соевый шрот, на HP AviStart, который имеет более высокую усвояемость белков и аминокислот, рацион должен быть изменен.Это обеспечит необходимый уровень белка и энергии в стартовом корме. В толстом кишечнике старых птиц микрофлора кишечника может оставаться в равновесии. Однако у только что вылупившегося цыпленка микрофлора еще не полностью сформировалась, и приток непереваренных питательных веществ может вызвать размножение вредных бактерий.

HP AviStart с его высокой усвояемостью, как было доказано, способствует развитию кишечника молодых цыплят. Это не только обеспечивает сбалансированную микрофлору, но и влияет на общую продуктивность цыплят старшего возраста.Отчеты об испытаниях показывают, что общая усвояемость белка в рационе улучшилась, когда в рацион был включен
HP AviStart (рис. 1).

Испытание тайского кормления

В ходе 42-дневного исследования в Университете Кхон Каен, Таиланд, только что вылупившимся бройлерам Cobb давали стартовый корм, содержащий по 5% рыбной муки, ферментированной сои, гидролизованного протеина свиней и HP AviStart в течение первых семи дней выращивания. Контрольная группа получала стартовую диету на основе кукурузного и соевого шрота.Бройлеры получали идентичный рацион в оставшиеся дни испытания.

В 42-й день убоя бройлеры, получавшие 5% HP AviStart, имели значительно большую массу тела, чем другие опытные группы, а также имели самый низкий коэффициент конверсии корма. Группа, получавшая корм HP AviStart, имела грудку лучшего качества с точки зрения содержания белка и влаги (данные не показаны) и самого низкого коэффициента конверсии корма (FCR) (Рисунок 2).

Исследователи пришли к выводу, что производители цыплят-бройлеров могут заработать дополнительно 5.74 тайских бата (0,166 долларов США) за птицу (май 2017 г.), что эквивалентно окупаемости инвестиций 34: 1 при использовании HP AviStart в качестве стартового корма.

Эффект переноса

Специальный соевый протеин продолжает оказывать положительное влияние даже после начальной фазы, что подтверждено последним испытанием в Таиланде. Объяснение улучшения заключается в соотношении высоты ворсинок бройлера к глубине крипты, которое также известно как индикатор здоровья кишечника.

Исследования показали, что соотношение между высотой ворсинок и глубиной крипт связано с использованием белка. Высокий коэффициент также связан с низким FCR. Это один из механизмов пожизненного переходящего эффекта HP AviStart.

Некоторые исследования показали сильную корреляцию между хорошо развитым кишечником и улучшенным FCR, когда усвояемость белка высока, а количество непереваренных питательных веществ, доступных для вредных бактерий в заднем кишечнике, снижено.

У бройлеров, получавших десятидневный стартовый рацион, содержащий кукурузу или пшеницу с HP AviStart, было замечено увеличение отношения высоты ворсинок к глубине крипты (VH: CD) и было максимальным при уровне включения 5% (Рисунок 3).

Другое исследование показало значительную корреляцию между более высоким соотношением VH: CD и более низким FCR, предположительно из-за лучшего развития кишечника.Эффект от раннего 10-дневного кормления HP AviStart по сравнению с отказом от HP AviStart был перенесен и все еще измерялся на 60-й день, даже после того, как птицы перешли на другую диету (Рисунок 4).

Глобальный мета-анализ

Выводы Университета Кхон Каен подтверждают результаты недавнего метаанализа 16 других испытаний кормления (2012–2016 гг.), Проведенного университетами, исследовательскими институтами и коммерческими производителями бройлеров примерно в десяти странах, в результате чего было получено 73 включенных наблюдения.

Сводка испытаний кормления

• В ходе метаанализа оценивалась разница между контрольной группой, продуктами конкурентов и группой HP AviStart в испытаниях кормления. В исследованиях использовалось от двух до шести диет.
• Во всех испытаниях, включенных в метаанализ, стартовые рационы содержали одинаковое количество усвояемых аминокислот и одинаковую метаболическую энергию.
• Различия в содержании аминокислот и энергии между испытаниями имели место с учетом региональных различий в рекомендациях и местной практике.Кроме того, использовались различные системы оценки кормов для ME.
• Исследования выполнены сторонними организациями.
• HP AviStart был добавлен к стартовому корму в дозах от 0% до 10% и протестирован в сравнении с контрольным соевым шротом и стартовыми кормами, дополненными «другими» дорогостоящими ингредиентами, такими как рыбная мука, картофельный белок, кукурузный глютен или плазма крови во время кормления. стартовый период.
• Одинаковая диета (и) применялась (и) до завершения экспериментального периода (день убоя) всех испытаний.
• В контрольной группе единственным источником белка был соевый шрот.
• В большинстве (74%) испытаний кукуруза использовалась только как злак; в остальных рационах использовались как пшеница, так и кукуруза или пшеница как только злаки.
• В двух испытаниях начальный период составлял 28 дней из общего 60-дневного экспериментального периода.
• Большинство испытаний длилось от 35 до 42 дней.
• В большинстве исследований стартовая диета использовалась в виде крошки, а остальные — в виде сусла.

Основные выводы

Конечный вес и коэффициент конверсии корма улучшились при включении 5% и 10% HP AviStart в стартовый корм для бройлеров по сравнению с контролем и другими более дорогостоящими белковыми ингредиентами.

Был обнаружен значительный (P <0,05) эффект диетического лечения на конечный вес (убой) и FCR (Таблица 1). Было обнаружено, что бройлеры, получавшие HP AviStart во время фазы закваски, имели значительно более высокий конечный вес и более низкий FCR, чем бройлеры, получавшие контрольные рационы. Бройлеры, получавшие другие рационы, имели промежуточные результаты.

Значительно более низкий FCR с HP AviStart был обусловлен более высоким приростом массы тела (P <0,05), поскольку не было обнаружено различий в потреблении корма (P> 0.05).

Обнаружена значимая (P <0,05) разница в конечной массе (убой) и FCR при разных уровнях включения HP AviStart (Таблица 2). Дозозависимый ответ HP AviStart оказался значимым линейным ответом
(P <0,05).

Заключение

Мета-анализ 16 исследований пришел к выводу, что HP AviStart в стартовом корме значительно улучшает продуктивность бройлеров по сравнению с контролем и другими более дорогими белковыми ингредиентами. Самый высокий конечный вес и самый низкий FCR были обнаружены при уровне включения 10% HP AviStart, который также был самым высоким протестированным уровнем включения.Положительное влияние на производительность линейно в испытанных дозах: 0-10% HP AviStart. Результаты всех испытаний показывают, что 5% — лучшая отправная точка для получения максимальной отдачи при составлении стартового корма с помощью HP AviStart.

Могут ли эволюционировать новые белки? | Новости эволюции

Примечание редактора : Этот отрывок взят из главы Дугласа Экса в недавно выпущенной книге Всеобъемлющее руководство по науке и вере: изучение основных вопросов о жизни и космосе .

Что позволяет длинной цепочке связанных аминокислот выполнять высокоспецифические молекулярные функции с машинной точностью? Ответ — машинная структура . На рис. 2 показан один из тысяч примеров этих замечательных сооружений. Изображенная составная машина представляет собой АТФ-синтазу — совокупность из 22 белковых молекул, производящих энергетическую молекулу АТФ. Биохимики называют это ферментом, потому что он выполняет химическое преобразование (превращение АТФ из АДФ).Но можно без преувеличения назвать это и молекулярной машиной. Работая как сложный наногенератор, АТФ-синтаза имеет ротор (состоящий из частей, обозначенных с-кольцом, y и E), который вращается со скоростью 8000 об / мин!

Но как длинные цепочки связанных аминокислот образуют стабильные части для создания таких машин? Короткий ответ заключается в том, что существует возможных различных аминокислот, которые могут быть расположены вдоль цепи таким образом, чтобы все это зафиксировалось в определенной трехмерной форме.Этот процесс называется сворачиванием белка, а термин «сворачивание» относится к общей форме. Рисунок 3 иллюстрирует основы.

Я не зря выделил здесь слово «возможно». Случайный ген будет определять случайную последовательность аминокислот, которая будет вращаться без сворачивания. Подобные цепи быстро распадаются на аминокислоты, чтобы они не мешали клеточным процессам. Чтобы белковые цепи складывались в стабильные структуры, необходимы особые аминокислотные последовательности.

Измерение замечательного

Можно измерить, насколько особенными должны быть эти последовательности. Поскольку случайные гены безнадежны, лучший способ сделать это — начать с естественного гена, который определяет выбираемый признак, производя белок, передающий этот признак. Существуют лабораторные методы внесения случайных мутаций в выбранный ген. Это можно сделать контролируемым образом, ограничив количество происходящих изменений или ограничив мутации небольшой частью гена.Начав с гена, который определяет рабочий белок, и контролируя таким образом степень мутации гена, экспериментаторы могут создать большое количество мутантных версий гена, некоторые из которых почти наверняка будут работать.

Основываясь на более ранних работах такого рода, я применил этот метод к естественному гену, который позволяет бактериям инактивировать пенициллиноподобные антибиотики. Признак в этом случае — устойчивость к антибиотикам, которую очень легко выбрать в лаборатории.Во-первых, бактерии просто помещают в чашки Петри с небольшим количеством пенициллина. Клетки, несущие мутантную версию гена, определяющего фермент, который все еще способен расщеплять пенициллин, образуют видимые колонии на чашках Петри, тогда как клетки с неактивными генами погибают. Для своих экспериментов я выбрал четыре кластера аминокислот, по десять в каждом. В каждом эксперименте я сильно мутировал местоположения генов для одного кластера, в результате чего получалось множество мутантных генов, каждый из которых определял мутантную версию фермента с беспорядочным набором аминокислот в этих десяти местоположениях.Из примерно 100 000 мутантных генов, протестированных на кластер, некоторые из них работали в трех кластерах. Нет в четвертом. По-видимому, тестирование большего количества мутантов могло бы выявить некоторые из них, которые работали бы в этом четвертом кластере. В любом случае, я смог оценить на основе этих результатов долю мутантов, которые работают для каждого кластера, хотя эта доля на самом деле является верхней оценкой для четвертого кластера.

На основе этих экспериментально основанных оценок я вычислил долю мутантов, которые, как ожидается, будут работать, если бы весь ген был мутирован аналогичным образом. Эта фракция тесно связана с другой фракцией, которая имеет большое значение для эволюции белка.Но прежде чем мы поговорим о том, чем оказалась эта важная фракция, давайте займемся временем, чтобы понять эволюционное мышление достаточно хорошо, чтобы поместить эту фракцию в надлежащий контекст …

Назад к белкам

Возвращаясь к белкам, что они добавляют к картине? Ответ заключается в том, что они иллюстрируют принципы здравого смысла, согласно которым мы справедливо отвергаем беспредметные представления о жизни. Мы можем полностью понять и подтвердить эти принципы, не обращаясь к теме белков (или любой другой технической теме), но в белках мы находим изящное подтверждение.

Важная часть, о которой я упоминал выше, — это вероятность того, что случайная цепочка аминокислот будет обладать особыми физическими свойствами, необходимыми для складывания в стабильную структуру, подходящую для конкретной функции. С точки зрения эволюции, предполагая, что конкретная новая способность, которая может быть достигнута с помощью новой белковой складки, принесет пользу организму, и что генетическая ошибка в этом организме привела к появлению последовательности гена, которая существенно отличается от того, что существовало раньше, эта доля представляет собой вероятность того, что новый ген кодирует новый белок, выполняющий желаемую новую функцию.Используя результаты моих экспериментов с ферментом устойчивости к пенициллину, я оценил эту вероятность примерно как:

1/100000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000

Музыка белков становится слышимой с помощью компьютерной программы, которая учится у Шопена

С правильной компьютерной программой белки превращаются в приятную музыку.

Есть много удивительных аналогий между белками, основными строительными блоками жизни, и музыкальной нотацией.Эти аналогии можно использовать не только для продвижения исследований, но и для того, чтобы сделать сложность белков доступной для общественности.

Мы — компьютерные биологи, которые считают, что звуки жизни на молекулярном уровне могут помочь вдохновить людей больше узнавать о биологии и вычислительных науках. Хотя создание музыки на основе белков не новость, различные музыкальные стили и алгоритмы композиции еще предстоит изучить. Поэтому мы возглавили команду старшеклассников и других ученых, чтобы выяснить, как создавать классическую музыку из белков.

Музыкальные аналогии белков

Белки имеют структуру в виде свернутых цепочек. Эти цепи состоят из небольших единиц из 20 возможных аминокислот, каждая из которых обозначена буквой алфавита.

Белковая цепочка может быть представлена ​​в виде цепочки этих букв, очень похожих на цепочку нот в алфавитной записи.

Белковые цепи также могут складываться в волнистые и изогнутые узоры с подъемами, спусками, поворотами и петлями. Точно так же музыка состоит из звуковых волн более высокого и низкого тона, с изменяющимся темпом и повторяющимися мотивами.

могут отображать структурные и физико-химические особенности последовательности аминокислот на музыкальные особенности последовательности нот.

Повышение музыкальности картирования белков

Сопоставление белков с музыкой можно точно настроить, основываясь на особенностях определенного музыкального стиля.Это повышает музыкальность или мелодичность песни при преобразовании свойств аминокислот, таких как паттерны последовательности и вариации, в аналогичные музыкальные свойства, такие как высота звука, длина нот и аккорды.

Для нашего исследования мы специально выбрали классическую фортепианную музыку романтического периода 19-го века, в которую входят такие композиторы, как Шопен и Шуберт, в качестве руководства, поскольку она обычно охватывает широкий диапазон нот с более сложными функциями, такими как хроматизм, например, игра белого и белого цветов. черные клавиши на фортепиано в порядке высоты тона и аккордов.Музыка этого периода также имеет более легкие, изящные и эмоциональные мелодии. Песни обычно омофонические, то есть они следуют центральной мелодии под аккомпанемент. Эти функции позволили нам протестировать более широкий диапазон нот в нашем алгоритме сопоставления белков и музыки. В данном случае мы решили проанализировать особенности «Фантазии-экспромта» Шопена, чтобы направлять нашу разработку программы.

Чтобы протестировать алгоритм, мы применили его к 18 белкам, которые играют ключевую роль в различных биологических функциях.Каждая аминокислота в белке соотносится с определенной нотой в зависимости от того, как часто они появляются в белке, а другие аспекты их биохимии соответствуют другим аспектам музыки. Например, аминокислота большего размера будет иметь меньшую длину ноты, и наоборот.

В результате получается сложная музыка с заметными вариациями высоты тона, громкости и ритма. Поскольку алгоритм полностью основан на аминокислотной последовательности и никакие два белка не имеют одинаковой аминокислотной последовательности, каждый белок будет воспроизводить отдельную песню.Это также означает, что в разных произведениях есть различия в музыкальности и могут возникнуть интересные закономерности.

Например, музыка, генерируемая рецепторным белком, который связывается с гормоном и нейромедиатором окситоцином, имеет некоторые повторяющиеся мотивы из-за повторения определенных небольших последовательностей аминокислот.

С другой стороны, музыка, созданная из опухолевого антигена p53, белка, который предотвращает образование рака, очень хроматична, производя особенно захватывающие фразы, в которых музыка звучит почти как токката, стиль, который часто отличается быстрой и виртуозной техникой.

Благодаря анализу свойств аминокислот с помощью конкретных музыкальных стилей, протеиновая музыка может звучать намного приятнее для уха. Это может быть далее развито и применяться к более широкому спектру музыкальных стилей, включая поп и джаз.

Белковая музыка — это пример того, как сочетание биологических и вычислительных наук может создавать прекрасные произведения искусства.Мы надеемся, что эта работа побудит исследователей сочинять протеиновую музыку разных стилей и вдохновит общественность на изучение основных строительных блоков жизни.

Это исследование было разработано совместно с Николь Тай, Фаньси Лю, Чаосинь Ван и Хуэй Чжан.

[ Получите наши лучшие истории о науке, здоровье и технологиях. Подпишитесь на научный бюллетень The Conversation.]

Рак: карта белков в опухолевых клетках определяет цели терапии

Джейсон Арунн Муругесу

Клетки рака груди

Библиотека научных фотографий

Первая в истории карта взаимодействия белков при раке подчеркивает ранее упускаемые из виду мутации, которые могут быть нацелены на терапию.

Трей Идекер из Калифорнийского университета в Сан-Диего и его коллеги разработали карту, на которой показано, как несколько десятков обычных раковых белков взаимодействуют при раке груди и раке головы и шеи.

«Раковые гены действуют не в одиночку», — говорит Идекер. «Это как части любой машины — они влияют друг на друга».

Карты взаимодействия белков включают каталогизацию всех различных способов взаимодействия белков друг с другом в биологической системе. В этом случае команда отобрала 61 белок с часто встречающимися мутациями в двух раковых опухолях и определила, как каждый из них взаимодействует друг с другом и с сотнями других белков в раковых опухолях.

«Мы ищем сообщества белков, которые вынуждены мутировать во время рака», — говорит Идекер.

Для рака головы и шеи команда обнаружила 771 белок взаимодействия с участием около 650 белков — и о 84 процентах взаимодействий никогда ранее не сообщалось. Если эти взаимодействия имеют решающее значение для роста опухоли, будущие онкологические препараты, которые нацелены на них и разрушают их, могут замедлить рост рака.

Между тем, глядя на данные в целом, команда обнаружила мутацию в белке коллагена, на которую не обратили внимания предыдущие исследования.

«Это большой шаг вперед в исследовании», — говорит Идекер. «Были анекдоты об обнаружении раковых мутаций таким способом и раньше, но никто не доказал это систематически».

Идекер надеется, что этот метод будет использован при других формах рака, и что другие присоединятся к поискам еще большего количества взаимодействий белков при раке. По его словам, это не только поможет найти новые лекарства, но также поможет ученым найти новые биомаркеры рака, что поможет врачам разработать более индивидуальные методы лечения.

«Определив, какие белки часто работают вместе при определенных раковых заболеваниях, и помогая нам понять, как мутации влияют на такие взаимодействия белков, это исследование помогает нам лучше понять развитие и прогрессирование рака», — говорит Крис Бакал из Института исследований рака в Великобритании.