Вход в личный кабинет | Регистрация
Избранное (0) Список сравнения (0)
Ваши покупки:
0 товаров на 0 Р
Итого: 0 Р Купить

Выбор протеина: на что необходимо обратить внимание

Содержание

По каким показателям лучше подбирать протеин?

Протеиновые добавки часто используют для набора мышечной массы. Важно сделать правильный выбор — в большом ассортименте добавок легко запутаться, особенно новичкам. Есть несколько основных нюансов выбора правильного белка для набора мышечной массы.

Зачем нужен протеин?

После интенсивных физических нагрузок происходит разрушение мышечной ткани, а затем ее наращивание. Для этого и требуется белок протеин.

Спортсменам, тренирующимся регулярно, строительный материал для мышечной массы необходим постоянно. Но при правильном рационе питания не всегда получается съесть необходимое количество белка. Суточная норма при регулярных занятиях фитнесом может составлять 8 куриных грудок. Это большое количество, поэтому многие прибегают к использованию спортивных добавок или «сухого протеина».


Внимание! Важно выбрать качественный сухой белок, который, не сказываясь на здоровье атлета,способствует набору мышечной массы.

Что такое сывороточный протеин?

Сывороточный протеин — вид спортивного питания. Для его производства используется белок, извлеченный из сыворотки при помощи фильтрации. Такие добавки содержат 8 незаменимых аминокислот.

Плюсы применения сывороточного белка:

  • белок, который входит в состав таких добавок, является основным материалом для наращивания мышечной массы и создания рельефной мускулатуры;
  • помогает выработать инсулин и действует как анаболик;
  • понижает выработку веществ, которые разрушают мышечную ткань;
  • является дополнительным зарядом энергии во время тренировки.

Поэтому многие спортсмены и люди, увлекающиеся ежедневными тренировками, в свой рацион включают добавки сывороточного протеина.

Польза и вред добавок

Помимо пользы для спортивных тренировок, протеиновые добавки имеют и другие ценные свойства. К ним относятся:

  • помощь в снижении веса;
  • падение уровня «плохого холестерина»;
  • укрепление иммунитета;
  • восстановление мышечной ткани.

При фанатичном употреблении протеиновых добавок могут возникнуть негативные последствия:

  • ухудшится работа сердечно-сосудистой системы и почек;
  • повысится необходимость в ферментах пищеварения, в противном случае увеличится газообразование, и возникнут боли.
Внимание! Прежде чем начинать прием БАД, лучше обратиться за консультацией к тренеру или врачу.

Выбор протеина

Чтобы не навредить здоровью, важно выбрать качественную спортивную добавку и принимать ее по правилам. Сывороточные препараты классифицируются по 4 категориям, каждая отличается по количеству содержания белка:

  1. Концентрат. В этих добавках белка меньше всего, поэтому и стоимость у них низкая. Максимум содержания протеина в этой категории — 88%.
  2. Изолят. Содержание белка — 90%. Уровень лактозы и жиров минимален. Много питательных веществ.
  3. Гидролизат. Это вещество почти полностью состоит из протеина — его содержание 99%. На вкус такая добавка «на любителя», поэтому придется потерпеть.
  4. Сывороточный протеин из нескольких компонентов. Получается путем слияния концентрата и изолята. У каждого производителя процент содержания протеина индивидуален.

    В этом рейтинге лучший, конечно, гидролизат, но и по цене он самый дорогой.

    Внимание! Изолят лучше усваивается, поскольку в нем абсолютно нет лактозы. Она часто способствует возникновению проблем с пищеварением.

    Как правильно принимать?

    Правильный прием сывороточного протеина выглядит так: его разводят в молоке или воде, а потом тщательно перемешивают. Важно, чтобы напитки не были горячими, иначе протеин свернется и не сможет принести пользу.

    Схемы приема БАД могут отличаться в зависимости от желаемого конечного результата:

    1. Для роста мышц.За 30 минут до занятий необходимо принять препарат, а затем еще раз после окончания тренировки – через 30–60 минут. Рассчитать количество необходимого белка просто: на каждый килограмм тела должно в день выходить не менее 2 грамм белка.
    2. Для снижения веса. В таком случае сыворотка применяется как добавка. Принимать ее нужно как замену одному основному приему пищи, например, ужину.

      Внимание! Не рекомендуется принимать в сутки для снижения веса более 30 грамм белка. Также не стоит при похудении употреблять «строительные» коктейли вместе с основной едой — они слишком калорийны.

      Выбор протеина для триатлета

      Коротко о самом важном, что нужно знать о протеине во время тренировочного процесса

      12:10, 26 апреля 2017

      2017-04-26T12:10:54+03:00 2017-04-26T12:10:54+03:00

      Каковы различия между типами протеинов, содержащихся в продуктах спортивного питания, и какие опитмальны для триатлета? Мы рассмотрим разницу между сывороточными, соевыми и другими видами протеина на рынке, и учтем также форму – порошок или баточник. 

      Спортивные продукты питания, созданные для восстановления, могут содержать различные виды протеина: цельное молоко, сыворотка, казеин, соевый протеин и даже гороховый протеин.

      В течение 30 минут после тренировки ваши мышцы очень восприимчивы к усвоению протеина и углеводов – обычно этот период называется метаболическим окном.

      По этой причине, протеин, который может быть усвоен организмом максимально быстро, подходит для употребления сразу после тренировки, чтобы успеть в метаболическое окно. К такому типу протеина относится

      сывороточный протеин (whey protein). К счастью, именно он является основой почти во всех восстановительных напитках (recovery drinks). Сывороточный протеин также богат важнейшей аминокислотой для тренировочного процесса – лейцином, который отвечает за рост и восстановление после нагрузки. 

      Однако и медленно-высвобождаемые протеины также нужны в рационе спортсмена. Из-за своего медленнего распада, такие протеины являются источниками аминокислот более продолжительное время. Это отлично подходит для употребления перед сном, чтобы мышцы медленно, но верно насыщались на протяжении всей ночи. Казеин – самый медленный протеин, он содержится в твороге, молочной продукции, сыре. Порцию казеинового протеина есть смысл пить только перед сном, в другое время дня он скорее будет мешать активному тренировочному процессу, так как снижает чувство голода и дает относительно немного энергии за определенный промежуток времени.

      Лучший универсальный вид протеина – это яичный белок, который содержит почти все нужные организмы аминокислоты. Он, как легко догадаться, содержится в обычных яицах, но из сырых яиц не усваивается. Есть и порошковый вариант яичного протеина. Таким протеином хорошо заменять прием пищи, если возникает необходимость или нет возможности съесть полноценный обед. 

      И наконец соевый протеин. Однако мы не рекомендуем его употреблять на постоянной основе. По большому счету, это самый дешевый и низкокачественный вид протеина, который проигрывает в питательности и биодоступности другим видам. 

      В теории, протеиновые коктейли и батончики по составу представляют из себя примерно одно и то же. Однако, у батончиков есть нюанс – в их состав добавляют жиры, чтобы сделать массу более съедобной. К тому же жир замедляет опорожнение желудка, что в свою очередь замедляет скорость, с которой аминокислоты становятся доступны для восстановления мышц. По этой причине, после тренировки предпочтительнее восстановительные напитки, не содержащие жир

      Источник (Фотографии: Реми Вайтинг)

      критерии выбора и как принимать

      На построение мышечной массы тела влияет ряд факторов, без которых рост мышц невозможен. К этим факторам относятся: тренировки (разрушение мышечной ткани), строительный материал (протеин, который в дальнейшем расщепляется на аминокислоты) и отдых. В данной статье, речь пойдет о протеине, ведь это как при строительстве дома, без материалов достичь конечного результата невозможно. Для рассмотрения предложен протеин, как вид спортивного питания, который вызывает множество вопросов. Из чего делается протеин? Для чего нужен протеин? Вреден ли проетин? Ответы на эти вопросы вы найдете в данной статье.

       

      Что такое протеин?

      Протеин – (с англ. Protein – белок) это тип органических веществ, которые состоят из определенного набора аминокислот и необходимы человеку для обеспечения биохимических процессов. Получаемые из протеина аминокислоты бывают двух типов: заменимые (которые синтезируются в человеческом организме) и незаменимые (которые должны попадать в организм из пищи). После попадания в человеческий организм, протеин расщепляется на аминокислоты, которые и становятся строительным материалом для мышечной ткани. Что же касается протеина как спортивной добавки то – это концентрированная смесь питательных веществ с большой концентрацией белка,  которая легко усваивается организмом. Выпускается добавка в форме порошка, имеет вкусовые наполнители и употребляется, зачастую размешиваясь в воде или молоке.

       

      Для чего нужен протеин?

      Для чего нужен протеин

      Для человека, занимающегося в тренажерном зале, возрастает необходимость употребления большего количества белка, нежели при отсутствии физических нагрузок. Большая часть белка должна поступать из обычных продуктов питания (мясо, молочные продукты, рыба) но, как показывает практика набрать нужное количество белка из обычных продуктов очень сложно. Именно поэтому появилась потребность в высокобелковых добавках, которые призваны увеличить количество легкоусвояемого белка в рационе. К тому же протеиновые  добавки достаточно просты в употреблении и приходят на помощь в те моменты, когда получить полноценный прием пищи не является возможным.

       

      Какие бывают виды протеина?

      Классифицировать протеиновые добавки можно по множеству принципов: по составу, скорости усвояемости,  аминокислотному набору и так далее. Но если рассматривать протеиновую добавку, как замену приема пищи, то следует обратить внимание на время попадания аминокислот в кровь, а следовательно скорости усвояемости происхождения белка. 

      Виды протеина
      • Сывороточный протеин. Наиболее популярный вид протеина, из-за своих характеристик. Производится он из сыворотки, обладает достаточно высоким аминокислотным составом. Данный тип протеина имеет самую высокую скорость усвоения, что составляет приблизительно десять грамм в час.
      •  Яичный протеин. Название говорит само за себя, сырьем для производства данного типа протеина являются яйца. Яйца, как известно, имеют один из самых лучших аминокислотных составов, следовательно, протеин наделен теми же качествами. Скорость всасывания данного протеина достаточно большая, около девяти грамм в час. Отличительной особенностью данного протеина является достаточно высокая цена.
      •  Соевый протеин. Производится из соевого сырья и у экспертов вызывает множество противоречий относительно рациональности употребления данного протеина. Основным фактором, который располагает к употреблению данного протеина, является его сравнительно невысокая стоимость, при этом биологическая ценности и аминокислотный состав оставляют желать лучшего. Всасывается данный белок достаточно медленно, около четырех грамм в час.
      •  Казеин. Данный протеин производится из створоженной массы молока. Отличительной особенностью данного протеина является его медленная скорость всасывания и хороший аминокислотный состав. В среднем скорость всасывания равна четыре грамма в час.

      Как принимать протеин?

      Ответ на этот вопрос заключается в типе протеина. К тому же, мнения экспертов по этому поводу неоднозначные, однако есть моменты,  с которыми согласны все. Сывороточный протеин либо же яичный, лучше всего принимать сразу после пробуждения, чтобы бы закрыть катаболические процессы. Выбор именно этих протеинов, обосновывается быстрой скоростью усвояемости. Так же рационально принимать их сразу же после тренировки, для закрытия белкового окна. Казеиновый протеин следует принимать на ночь, чтобы во время сна, организм постепенно получал аминокислоты.

      Как принимать протеин

      Так как среднее время полного усвоения казеинового протеина является 7 часов, он идеально подходит для этих целей. Что же касается порции приема, то здесь мнения разделились, некоторые считают, что за раз усваивается не более 30 грамм протеина, другие считают, что все индивидуально и зависит от организма и количества ферментов и многих других факторов.

       

       

      Но рекомендованной нормой является 30 грамм между приемами пищи, либо же сразу после пробуждения и после тренировки, разводя протеин с водой или молоком.

      Вреден ли протеин?

      Очень актуальный вопрос, который вызывает у простых обывателей множество споров и ходит огромное количество легенд о якобы пагубных воздействиях протеина на человеческий организм. Давайте разберемся и выясним, вреден ли протеин? Протеин производится из обычных продуктов питания, но предоставляется в употребление человеку в концентрированной форме. Следовательно, получается, что протеиновая добавка, это тоже молоко, либо же яйца, но имеющая форму порошка и содержащая больше питательных веществ на один грамм веса.

       

      А значит, как и обычные продукты питания, протеин не несет пагубное влияние в первую очередь на половую функцию человека, употребляющего протеин, как многие думают. Единственным побочным эффектом при употреблении протеина, может быть высокая нагрузка на почки, и то лишь при использовании больших порций данной добавки. Если следователь рекомендациям производителя, и значительно не превышать дозировки, то протеиновая добавка по уровню опасности находится в ряду с молоком, яйцами, творогом и не носит никакого вреда организму, а лишь помогает ему.

      Что лучше протеин или гейнер?

      Этот вопрос так же встречается достаточно часто. Однозначно ответить на него нельзя, все зависит от вашей цели. В гейнере присутствует тот же протеин только в процентном соотношении с углеводами. Если же вы трудно набираете массу, то в вашем случае рационально обратить внимание на гейнер. Если же целью является набор чистой мышечной массы, и вы склонны к жировым отложениям то здесь однозначно делаем ставку на протеин. Но стоит понимать, что сверх результата не даст ни одна добавка, она лишь служит дополнением к вашему обычному рациону, который является куда более важным.

      Протеин или гейнер

      Выбор протеина

      В данный момент на рынке спортивного питания представлено огромное количество протеиновых добавок и выбрать становиться достаточно сложно. Однако как показывает многолетний опыт, есть ряд производителей, которые выпускают качественную продукцию уже много лет. На что следует обратить внимание при выборе протеина?

      •  В первую очередь нужно смотреть на количество содержания белка на порцию, чем выше его, тем лучше. 
      •  Вторым аспектом, который заслуживает вашего внимания, является состав. То, из чего сделан протеин играет важную роль. Изучив типы протеина, описанные выше, вы сможете легко сделать свой выбор, который будет отвечать вашим требованиям.
      •  Вкусовые качества. Существует очень большое количество приторных вкусов, которые пить достаточно сложно. У каждого производителя один и тот же вкус может быть разным, однако наиболее приятными для употребления являются протеины со вкусом шоколада, печенья, ванили. Достаточно приторные вкусы клубники и банана.

      Получив ответы на интересующие вас вопросы, вы сможете выбрать наиболее подходящий вам протеин либо же сделать выводы о необходимости употребления данного продукта. Важно помнить, что ни одна спортивная добавка не принесет результата. Если вы не соблюдаете спортивный режим.

      Посмотрите видео о том, как выбрать протеин:

       

      Игорь Брюхов: как выбрать качественный протеин?

      Отвечает Игорь Брюхов

      Абсолютный чемпион Урала и Сибири, чемпион России 2017-18 гг., абсолютный чемпион России по юниорам 2017-18 гг в категории бодибилдинг.

      Многие новички всегда в замешательстве перед выбором протеина. И не удивительно – в интерне встречаются всевозможные изоляты, концентраты, гидролизаты, казеин, комплексные, соевые и мультикомпонентные протеины. Количество видов протеина затрудняет выбор начинающего пользователя. Еще и куча брендов, которые пишут то одни рекомендации, то другие, то одни компоненты в составе, то другие. Как же удачно сделать выбор? И нужен ли протеин вообще? Попробую рассказать.

      Главное, на что стоит обратить внимание при выборе протеина – его тип, количество белка в продукте в процентном соотношении, а также количество углеводов и жиров в добавке. Ведь они свидетельствуют о степени очистки продукта. Еще нужно обратить внимание на наличие загустителей, красителей и подсластителей. Чем их меньше в составе – тем лучше. Стоит остановить свой выбор на продукте, соответствующий вашим целям, ритму жизни и вкусовым ощущениям.

      Я лично покажу на примере протеина, который выбрал сам. Это BIG WHEY. В линейке 6 разных вкусов, в последний раз я выбрал печенье. Вкус понравился. Расскажу про состав и на что важно обратить внимание при выборе продукта.

      Состав протеина BIG – концентрат и изолят сывороточного белка. Это основа. Можно, чтобы в составе был один компонент. В таком случае изолят будет стоить чуть подороже. Что допустимо? Подсластитель. Например, в данном продукте в его роли выступают сукралоза и вкусо-ароматическая добавка.

      Как видим, данный бренд не использует никаких удешевляющих ингредиентов, красителей, загустителей и прочих ненужных веществ. В этом продукте используется сырье INSTANT, что, безусловно, является большим плюсом. Коктейль лишен комков и пены, пьется отлично. Это основа, а остальное – вкусовые предпочтения. Кому-то нравится шоколад, кто-то выбирает протеин со вкусом печенья

      Какой протеин не стоит брать:

      1. Если не указан полный аминокислотный состав (по всем аминокислотам). Это означает, что могут использоваться дешевые ингредиенты.

      2. Лейцин указан, но его меньше, чем 2,7 г на порцию в 25 г белка. Качественный протеин содержит примерно 11% лейцина (отсюда и соотношение – 2,7 г в 25 г). Вставляем фото аминокислотного профиля с этикетки биг вей. Примерно 25% от белков должны быть всеми любимые ВСАА (лейцин, изолейцин и валин). Хитрый производитель любит писать на банке большими буквами, что именно в этом протеине добавлены ВСАА. Но они там в любом случае должны быть!

      3. Большое количество углеводов на 100 г. Концентрат в среднем содержит около 10 грамм углеводов. Если больше, то это говорит о крайне дешевом сырье или манипуляциях производителя. Такой продукт брать нельзя!

      Протеин марки BIG расписали на этикетке все эти моменты и за это им 5-ка.

      Обратите внимание при выборе протеина

      На что следует обратить внимание при выборе протеина?

      На сегодняшний день, на рынке специализированного питания существует огромный ряд, разновидностей и видов спортивных добавках. У спортсмена, который еще не подобрал для себя правильный рацион, очень часто возникает проблема, при выборе качественного продукта. На что же стоит обратить внимание? На яркую и красивую коробочку? Или все же на качество полезных ингредиентов в его составе?

      В данной статье раскроем вопрос, как правильно выбрать спорт питание и такой продукт как – протеин.

      Что такое протеин

      Протеин – это белок, который состоит из ряда аминокислот. Аминокислоты бывают: заменимы (данный вид присутствует в человеческом организме), и незаменимы (те, которые поступают в организм с пищей). Когда протеин попадает в организм, он расщепляется на аминокислоты, а, это способствует построению мышечной ткани. Производители спортивного питания производят протеин в виде питательной смеси, состоящей из большой концентрации белка, который быстро и легко усваивается организмом.

      Выбираем продукт

      Существует два критерия, по которым стоит выбирать протеин.

      • Процент белка в продукте.
      • Качество белка.

      Процент содержания белка в продукте.

      В составе протеина содержание белка не должно быть меньше 60%. Если в продукте содержание белка с меньшим процентом, то он не может называться «протеином». Но многие производители выдают за протеин продукт, с малым количеством белка. Это может означать, что вместо протеина, вам хотят продать высокобелковый гейнер. Поэтому при покупке продукта обязательно ознакомьтесь с его составом, иначе заплатив за выбранный продукт, вы можете приобрести пищевую добавку, которая навряд ли поможет вам в достижении поставленной цели. Стоит отметить, что производители не выпускают протеин с 100% содержанием белка. Максимальное содержание белка в данном продукте спортивного питания может составлять 93%.

      Протеины по количеству белка:

      • Менее 60% — псевдо протеины;
      • 60% — 70% — протеин с низким содержанием белка;
      • 70% — 80% — протеин со средним содержанием белка;
      • Более 80% — протеин с высоким содержанием белка.

      Давайте более детально рассмотрим второй критерий подбора протеина – качество белка входящего в состав продукта. Очень часто производитель разбавляют свои продукты дешёвым белком. Это могут быть: соевые, пшеничный и рисовые белки. Казеин могут заменить сывороточным белком. Поэтому при выборе продукта также стоит обращать внимание, не разбавлен ли выбранный вами протеин более дешевым белком.

      Не маловажно отметить при выборе протеина, и на его вкусовые качества. Иногда недобросовестные производители выпускают продукт с приторным вкусом, который достаточно сложно пить.

      Протеиновые добавки можно распределить за таким принципом: по набору аминокислот, составу и скорости усвояемости.

      Виды протеинов

      Рассмотрим существующие виды протеинов.

      • Сывороточный протеин – в нем присутствует достаточно высокое содержание аминокислот. Сывороточный протеин является наиболее популярным среди спортсменов, так как он отличается большой скоростью усвоения. Его производят из молочной сыворотки.
      • Яичный протеин – в нем содержится минимальное количество жиров. Данный продукт отлично подходит людям у которых присутствует непереносимость лактозы. Яичный протеин также имеет быструю скорость усвоения.
      • Соевый протеин – это растительный белок. В нем содержится необходимое количество аминокислот, которые способствуют быстрому росту мышечной массы. Соевый протеин имеет более медленную скорость усвоения.
      • Казеиновый протеин – имеет медленную скорость усвоения. Данный вид рекомендуется к употреблению перед сном.

      То есть при выборе протеина обратите, пожалуйста, внимание на процентное соотношение белка. Его содержание не должно быть менее 60%. И, смотрите, чтобы ваш белок не был разведён. Выбирайте тот белок, который соответствует своему названию. Только так вы сможете приобрести продукт, который сделает ваши мышцы сильнее и красивее.

      Select Protein | Body & Fit

      Select Protein | Body & Fit text.skipToContent text.skipToNavigation Мы используем файлы cookie, чтобы дать вам лучший опыт использования Интернет-магазина. Сообщите нам, согласны ли вы использовать все эти файлы cookie.

      Принять все файлы cookie

      15% на весь сайт* и 20% на Body&Fit I Код: BESTFIT
      Бесплатная доставка от 999 ₽ + подарок от 3000 ₽

      PES
      • 24 г белка в каждой порции
      • Смесь молочно-белкового концентрата и концентрата сывороточного протеина
      • Способствует наращиванию и поддержанию мышечной массы

      Это идеальный продукт, когда цель

      Наращивание мышечной массы

      Хочешь увеличить мышечную массу или достичь идеального тонуса и формы? Этот продукт — идеальное дополнение к твоим тренировкам и программе питания, которое помогает наращивать и поддерживать мышечную массу.

      С высоким содержанием протеина Низкое содержание сахара Низкое содержание жиров

      Если вам нужен универсальный, простой в использовании протеиновый порошок для коктейлей, смузи или панкейков, тогда Select Protein— это идеальный выбор. Select Protein представляет собой смесь источников белка с быстрым и медленным перевариванием. В каждой порции содержится 24 г белка, предназначенного для наращивания и поддержания мышечной массы. Select Protein можно принимать после тренировки или в любое время дня: он станет вашим верным помощником в достижении спортивных целей и поддержании тонуса и идеальной физической формы.

      • 24 г белка в каждой порции
      • Смесь молочно-белкового концентрата и концентрата сывороточного протеина
      • Способствует наращиванию и поддержанию мышечной массы
      • Низкое содержание сахара и жиров
      • Содержание питательных веществ может меняться в зависимости от вкуса.

      Смешайте одну большую ложку (33 г) с 180–240 мл воды, принимайте через 30–60 минут после тренировки. Или приготовьте себе вкусный коктейль в любое время дня.

      Произошла ошибка при получении информации о пищевой ценности для выбранного вами вкуса.

      Информация о пищевой ценности будет отображена при выборе вкуса и/или размера.

      Извините, информация о пищевой ценности для этого вкуса и/или размера отсутствует.

      Наименования

      nutritionalInformation.labelData.request.tryAgain

      Посмотреть перевод на русском языке

      Посмотреть перевод на русском языке

      Посмотреть перевод на русском языке

      Посмотреть перевод на русском языке

      Посмотреть перевод на русском языке

      Посмотреть перевод на русском языке

      Посмотреть перевод на русском языке

      Посмотреть перевод на русском языке

      Посмотреть перевод на русском языке

      Посмотреть перевод на русском языке

      Время сеанса истекло

      Пожалуйста, перезагрузите страницу и попробуйте еще раз.

      Перезагрузить

      Select Protein | PESCIENCE | Сывороточный протеин

      Совершенно новый и уникальный протеин SELECT от известного производителя PEScience теперь доступен и на территории России. Если спортивные тренировки являются частью вашей жизни, и вы ежедневно употребляете спортивное питание в виде сывороточного протеина, то его качество должно быть исключительно высоким.

      Многие активно ищут информацию касаемо тренировочного процесса, оптимального рациона и спортивного питания, а затем используют полученные знания на практике. Давно известно, что сывороточный протеин является лидером среди прочих протеиносодержащих смесей. Регулярно употребляя такой препарат, каждый уверен, что его мышечные волокна получают лучшее, за счет чего должны активно расти.

      Однако на самом деле употребляемый вами протеин основан на устаревших научных разработках.

      Как это ни печально, но индустрия спортивного питания не спешит к внедрению инноваций. Известно, что для роста и набора чистой мышечной массы недостаточно приема только 100% сывороточного протеина. Это подтверждают исследования и многочисленные научные работы, часть которых представлена на PubMed. Всё сводится к тому, что непревзойденный дуэт для развития мышц — это сывороточный белок и казеин.

      Что важно – эти вещества действуют в комплексе и усиливают действие друг друга. В молочном белке содержится 80% казеина, а оставшиеся 20 % — это сыворотка, что позволяет использовать его в качестве незаменимого источника протеина. Основу SELECT Protein составляет изолят сывороточного белка, не содержащий жира и углеводных соединений.

      В 2005 году на международной конференции было доказано, что равное соотношение сыворотки и казеина является наилучшим сочетанием для быстрого роста мышц. Используя эти данные, в состав SELECT Protein включили сывороточный протеин для получения необходимой пропорции. Применяемое сырье отличается высочайшим качеством и характеризуется максимальным содержанием белка (80%).

      С целью усовершенствования SELECT Protein производитель дополнил состав пептидами лейцина, без которого достичь высоких показателей роста мышечных волокон невозможно. Ведь именно от количества этого компонента, употребленного за каждый приём пищи, зависит активность роста сухой мышечной массы.

      Перестаньте использовать разработки прошлого и наслаждайтесь максимальным результатом на основе современных технологий!

      Как принимать Select Protein?

      Смешайте один мерный скуп с 200мл воды или молока. Хорошо размешайте коктейль в блендере или шейкере. Принимайте 2-3 порции в день. 

      Выбор белка — обзор

      C Модуляция системы UPS в раке и терапии

      Раковые клетки демонстрируют более высокий уровень протеасомной активности. 200,201 Это свойство может быть связано с их интенсивными потребностями из-за повышенной скорости пролиферации, их внутриклеточного повышенного уровня окислительного стресса, 202 или их постоянного воздействия множественных цитокинов и факторов роста, которые влияют на структуру и функцию протеасом. 203,204 Вдобавок к этому, многие белки, кодируемые онкогенами и генами-супрессорами опухолей, лежат среди протеасомных субстратов, 205,206 с p53 207 и p27 Kip1 , ингибитор циклин-зависимых киназ (cdk) 208 наиболее изученные примеры.По вышеупомянутым причинам в сочетании с высокой специфичностью отбора белков-мишеней убиквитин-лигазами E3 209 исследователи предложили систему UPS в качестве мишени в терапии рака. 210

      Ингибитор протеасом бортезомиб в настоящее время используется в качестве нового противоракового препарата, который показал себя многообещающим при лечении различных гематологических злокачественных новообразований (более подробную информацию см. В последнем абзаце текущего раздела). Однако его клинической эффективности препятствовало появление явлений лекарственной устойчивости.Изучение молекулярного механизма устойчивости к бортезомибу в устойчивом миеломоноцитарном THP1 человека выявило (1) мутацию Ala49Thr, находящуюся в высококонсервативном бортезомиб-связывающем кармане в белке субъединицы протеасомы β 5 ; (2) резкая сверхэкспрессия (до 60 раз) белка β 5 , но не других субъединиц протеасомы, включая β 1 , β 2 и α 4 ; (3) высокие уровни перекрестной устойчивости к цитотоксическим пептидам 4А6, MG132, MG262 и ALLN, нацеленным на субъединицу β 5 , но не к широкому спектру химиотерапевтических препаратов; (4) отсутствие заметных изменений активности протеасомы CT-L; и (5) восстановление чувствительности к бортезомибу в устойчивых к бортезомибу клетках посредством siRNA-опосредованного подавления экспрессии гена β 5 . 211 Аналогичная мутантная сверхэкспрессия субъединицы β 5 была также обнаружена при немелкоклеточном раке легкого 212 и в клетках лейкемии. 213 Кроме того, сверхэкспрессия субъединицы протеасомы β 5 дикого типа, а также амплификация гена β 5 также наблюдалась в клетках Т-лимфобластной лимфомы / лейкемии, происходящих из линии Jurkat. . 214 Эти данные устанавливают новый механизм устойчивости к бортезомибу, связанный с избирательной сверхэкспрессией мутантного белка β 5 дикого типа, и подтверждают важную роль модуляции субъединицы протеасомы в выживаемости раковых клеток, устойчивости и, следовательно, в терапии рака. .

      Лигазы E3, которые нацелены на продукты онкогенов или продукты генов-супрессоров опухолей, участвуют в поддержании нормального уровня этих продуктов. Следовательно, инактивация лигаз E3, которые нацелены на продукты онкогенов, или сверхэкспрессия лигаз E3, которые нацелены на белки-супрессоры опухоли, могут играть роль в канцерогенезе или злокачественном прогрессировании. Будут представлены избранные примеры лигаз E3, которые модулируются во время прогрессирования рака.

      Комплекс SCF контролирует многие связанные с раком белки, включая белки-супрессоры опухоли и продукты онкогенов. 215 Среди различных белков F-бокса, Skp2 и Fbw7 были связаны с контролем многих белков, связанных с раком человека. 216 Белки-супрессоры опухолей, такие как ингибиторы cdk и регуляторы клеточного цикла, являются основными мишенями для Skp2 , причем p27 Kip1 является наиболее охарактеризованным. 217 Таким образом, избыточная экспрессия Skp2 была зарегистрирована при многих раковых заболеваниях, таких как рак простаты, 218 плоскоклеточный рак пищевода, 219 меланома, 220 аденокарцинома яичников, 221 колоректальный рак и рак груди, 223 среди других.Более того, амплификации гена Skp2 были обнаружены при раке желудка человека. 224 Следовательно, предполагается, что Skp2 является онкогеном.

      Fbw7 в основном нацелен на деградацию онкогенных белков, таких как Cyclin E, c-Myc, c-Jun, c-Myb, Notch и mTOR. 225 Более того, делеция и мутация Fbw7 обнаруживаются при раке человека. 226 Таким образом, поскольку пониженный уровень экспрессии Fbw7 и мутации потери функции обнаруживаются в широком диапазоне рака человека, Fbw7 считается геном-супрессором опухоли.

      Лигазы E3 HECT-типа контролируют путь TGFβ-Smad 227 228 , тогда как некоторые лигазы E3 HECT-типа нацелены на расщепление белков семейства p53, то есть E6AP-E6, 43 ARF-BP1 (Huwe1) для p53 , 229 Зуд для p63 и p73, 230 231 и WWP1 для p63. 232 Поскольку эти лигазы E3 HECT-типа часто сверхэкспрессируются при раке человека, они могут быть связаны с ростом опухолевых клеток. Лигазы E3 с внутренним единственным доменом RING-finger, такие как Mdm2, Pirh3 и COP1, также нацелены на p53. 233 Mdm2 является наиболее изученным, он сверхэкспрессируется в нескольких типах опухолей, имеющих различную прогностическую значимость. 234 Тем не менее, сверхэкспрессия других лигаз p53 также была описана; для Pirh3 в легких, 235 простаты, 236 и рака головы и шеи 237 и для Cop1 в аденокарциномах груди и яичников. 238 Что касается Mdm2, также было показано, что он регулирует деградацию убиквитина белка ретинобластомы (pRb), другого продукта гена-супрессора опухоли. 239 Обратная корреляция pRb и Mdm2 была показана при раке легких человека. 240 Следовательно, Mdm2 играет ключевую регуляторную роль в отношении основных белков-супрессоров опухолей.

      Накопление HIF-1 наблюдается при большинстве типов солидных опухолей и часто связано с плохим прогнозом и прогрессированием рака. 241 Стабильность белка каталитической субъединицы HIFα регулируется лигазой VHL E3 и считается лигазой E3, подавляющей опухоль. 121 Аберрации VHL были идентифицированы при семейных и спорадических светлоклеточных карциномах почек, гемангиобластомах сетчатки и центральной нервной системы и феохромоцитомах. 242

      Многочисленные случаи аберрации или активации лигазы E3 при различных типах рака, приводящие к модуляции UPS, еще раз подтверждают возросшее значение системы в терапии рака. Терапевтическую стратегию можно подразделить на две категории: (а) модуляция определенных компонентов системы UPS, таких как E3-специфическая лигаза онкогенного белка или продукт гена-супрессора опухоли, регуляторный компонент протеасомы или сама система убиквитинирования. ; и (б) ингибирование активности и функции протеасом.Последняя категория уже применялась. Существует несколько природных и синтетических ингибиторов протеасом 94 , и один из синтетических, дипептидилборонат бортезомиб (Velcade TM ; ранее известный как PS-341, LDP-341 и MLN341 243 ), является первым специфическим Ингибитор протеасом поступает в клинические испытания на онкологических больных. 244 Бортезомиб показывает более высокое сродство к субъединице β 5 протеасомы, за которым следует более слабое сродство к субъединице β 1 , в результате чего трипсиноподобная активность, связанная с субъединицей β 2 , практически не затрагивается.Бортезомиб обладает прямым противоопухолевым 210 , а также радиосенсибилизирующим действием 245 на раковые клетки in vitro и in vivo . Бортезомиб получил ускоренное одобрение Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов в мае 2003 г. для лечения рефрактерной множественной миеломы, в мае 2005 г. — для лечения пациентов с множественной миеломой, которые ранее получали хотя бы одну терапию, в декабре 2006 г. для лечения пациентов с мантийными клетками. лимфома, которые получали по крайней мере одну предшествующую терапию, и в июне 2008 года для лечения пациентов с множественной миеломой.В настоящее время проводится несколько клинических испытаний фазы I и фазы II при различных типах рака с использованием этого потенциального препарата. 246 Хотя результаты, достигнутые к настоящему времени с помощью этой терапевтической стратегии, являются многообещающими, манипуляции / нацеливание на более конкретные компоненты ИБП определенно будут полезными.

      Естественный отбор по структурным и функциональным свойствам белков: перспектива однонуклеотидного полиморфизма | Genome Biology

    1. 1.

      Hurst LD: Отношение Ka / Ks: диагностика формы эволюции последовательности.Тенденции Genet. 2002, 18: 486-10.1016 / S0168-9525 (02) 02722-1.

      PubMed Статья Google ученый

    2. 2.

      Li W-H: молекулярная эволюция. 1997, Сандерленд, Массачусетс: Sinauer Associates, Inc.

      Google ученый

    3. 3.

      Джордан И.К., Рогозин И.Б., Вольф Ю.И., Кунин Е.В.: Эссенциальные гены более консервативны эволюционно, чем несущественные гены у бактерий. Genome Res.2002, 12: 962-968. 10.1101 / гр.87702. Статья была опубликована в Интернете перед печатью в мае 2002 года.

      PubMed CAS PubMed Central Статья Google ученый

    4. 4.

      Zhang L, Li WH: Гены домашнего хозяйства млекопитающих развиваются медленнее, чем тканеспецифические гены. Mol Biol Evol. 2004, 21: 236-239. 10.1093 / молбев / мш010.

      PubMed Статья Google ученый

    5. 5.

      Консорциум по секвенированию генома мышей, Waterston RH, Lindblad-Toh K, Birney E, Rogers J, Abril JF, Agarwal P, Agarwala R, Ainscough R, Alexandersson M, An P, Antonarakis SE, Attwood J, Baertsch R, Bailey J, Барлоу К., Бек С., Берри Е., Биррен Б., Блум Т., Борк П., Ботчерби М., Брей Н., Брент М. Р., Браун Д. Г., Браун С. Д., Булт С., Бертон Дж., Батлер Дж., Кэмпбелл Р. Д., Карнинчи П. и др. : Первоначальное секвенирование и сравнительный анализ генома мыши. Природа. 2002, 420: 520-562. 10.1038 / природа01262.

      Артикул Google ученый

    6. 6.

      Шерри С.Т., Уорд М.Х., Холодов М., Бейкер Дж., Фан Л., Смигельски Е.М., Сироткин К.: dbSNP: база данных генетической изменчивости NCBI. Nucleic Acids Res. 2001, 29: 308-311. 10.1093 / nar / 29.1.308.

      PubMed CAS PubMed Central Статья Google ученый

    7. 7.

      Jiang R, Duan J, Windemuth A, Stephens JC, Judson R, Xu C: полногеномная оценка общедоступных баз данных SNP. Фармакогеномика. 2003, 4: 779-789. 10.1517 / phgs.4.6.779.22821.

      PubMed CAS Статья Google ученый

    8. 8.

      Freudenberg-Hua Y, Freudenberg J, Winantea J, Kluck N, Cichon S, Bruss M, Propping P, Nöthen MM: Систематическое исследование генетической изменчивости в 111 человеческих генах — значение для изучения вариабельной реакции на лекарства. Pharmacogenomics J. 2005, 5: 183-192. 10.1038 / sj.tpj.6500306.

      PubMed CAS Статья Google ученый

    9. 9.

      Кимура М: Нейтральная теория молекулярной эволюции. Эволюция генов и белков. Под редакцией: Nei M, Koehn RK. 1983, Сандерленд, Массачусетс: Sinauer Associates, Inc., 208-233.

      Google ученый

    10. 10.

      Fay JC, Wyckoff GJ, Wu CI: Положительный и отрицательный отбор по геному человека. Генетика. 2001, 158: 1227-1234.

      PubMed CAS PubMed Central Google ученый

    11. 11.

      Zhang L, Li WH: SNP человека не обнаруживают свидетельств частого положительного отбора. Mol Biol Evol. 2005, 22: 2504-2507. 10.1093 / molbev / msi240.

      PubMed CAS Статья Google ученый

    12. 12.

      Консорциум по секвенированию и анализу шимпанзе: Исходная последовательность генома шимпанзе и сравнение с геномом человека. Природа. 2005, 437: 69-87. 10.1038 / природа04072.

      Артикул Google ученый

    13. 13.

      Ensembl. [http://www.ensembl.org]

    14. 14.

      Гиббонс Дж. Д.: Непараметрические меры ассоциации. 1993, Парк Ньюбери: Публикации Sage

      Google ученый

    15. 15.

      Альтшул С.Ф., Мэдден Т.Л., Шеффер А.А., Чжан Дж., Чжан З., Миллер В., Липман Д.Д.: Gapped Blast и PSI-Blast: новое поколение программ поиска в базе данных белков. Nucleic Acids Res. 1997, 25: 3389-3402. 10.1093 / nar / 25.17.3389.

      PubMed CAS PubMed Central Статья Google ученый

    16. 16.

      Роча Е.П., Данчин А. Анализ детерминант скорости замены аминокислот в бактериальных белках. Mol Biol Evol. 2004, 21: 108-116. 10.1093 / молбев / мш004.

      PubMed CAS Статья Google ученый

    17. 17.

      Пал C, Papp B, Hurst LD: Высокоэкспрессируемые гены у дрожжей развиваются медленно. Генетика. 2001, 158: 927-931.

      PubMed PubMed Central Google ученый

    18. 18.

      Субраманиан С., Кумар С. Интенсивность экспрессии генов определяет скорость эволюции белков, кодируемых геномом позвоночных. Генетика. 2004, 168: 373-381. 10.1534 / genetics.104.028944.

      PubMed CAS PubMed Central Статья Google ученый

    19. 19.

      Драммонд Д.А., Раваль А., Уилке СО: Скорость эволюции дрожжевого белка определяется одной детерминантой. Mol Biol Evol. 2006, 23: 327-337. 10.1093 / molbev / msj038.

      PubMed CAS Статья Google ученый

    20. 20.

      Драммонд Д.А., Блум Дж. Д., Адами С., Уилке СО, Арнольд Ф. Х .: Почему высокоэкспрессированные белки развиваются медленно. Proc Natl Acad Sci USA. 2005, 102: 14338-14343. 10.1073 / pnas.0504070102.

      PubMed CAS PubMed Central Статья Google ученый

    21. 21.

      Плоткин Дж. Б., Фрейзер Х. Б.: Оценка детерминант темпов эволюции в присутствии шума. Mol Biol Evol. 2007, 24: 1113-1121. 10.1093 / молбев / msm044.

      PubMed CAS Статья Google ученый

    22. 22.

      Duret L, Mouchiroud D: Детерминанты скорости замен в генах млекопитающих: характер экспрессии влияет на интенсивность отбора, но не на скорость мутаций. Mol Biol Evol. 2000, 17: 68-74.

      PubMed CAS Статья Google ученый

    23. 23.

      Lercher MJ, Chamary JV, Hurst LD: Геномная региональность в темпах эволюции не объясняется кластеризацией генов с сопоставимым профилем экспрессии. Genome Res. 2004, 14: 1002-1013. 10.1101 / гр.1597404.

      PubMed CAS PubMed Central Статья Google ученый

    24. 24.

      Su AI, Wiltshire T, Batalov S, Lapp H, Ching KA, Block D, Zhang J, Soden R, Hayakawa M, Kreiman G, Cooke MP, Walker JR, Hogenesch JB: Атлас генов транскриптомы, кодирующие белки мыши и человека. Proc Natl Acad Sci USA. 2004, 101: 6062-6067. 10.1073 / pnas.0400782101.

      PubMed CAS PubMed Central Статья Google ученый

    25. 25.

      Кондрашов Ф.А., Рогозин И.Б., Вольф Ю.И., Кунин Е.В.: Селекция в эволюции дупликаций генов. Genome Biol. 2002, 3: research0008.1-0008.9. 10.1186 / gb-2002-3-2-research0008.

      Артикул Google ученый

    26. 26.

      Линч М., Конери Дж.С.: Эволюционная судьба и последствия дублирования генов. Наука. 2000, 290: 1151-1155. 10.1126 / science.290.5494.1151.

      PubMed CAS Статья Google ученый

    27. 27.

      Уилер Д.Л., Барретт Т., Бенсон Д.А., Брайант С.Х., Канезе К., Четвернин В., Черч Д.М., ДиКуччио М., Эдгар Р., Федерхен С., Гир Л.Я., Капустин Ю., Ховайко О., Ландсман Д., Липман Д.Д., Мэдден Т.Л., Маглотт DR, Ostell J, Miller V, Pruitt KD, Schuler GD, Sequeira E, Sherry ST, Sirotkin K, Souvorov A, Starchenko G, Tatusov RL, Tatusova TA, Wagner L, Yaschenko E: Ресурсы базы данных Национального центра биотехнологической информации . Nucleic Acids Res. 2007, 35 (выпуск базы данных): D5-D12. 10.1093 / нар / gkl1031.

      PubMed CAS PubMed Central Статья Google ученый

    28. 28.

      HomoloGene. [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=homologene]

    29. 29.

      Альба М.М., Кастресана Дж .: Обратная связь между скоростью эволюции и возрастом генов млекопитающих. Mol Biol Evol. 2005, 22: 598-606. 10.1093 / molbev / msi045.

      PubMed Статья Google ученый

    30. 30.

      Альба М.М., Кастресана Дж .: Поиск гомологии с помощью белка Blast и характеристика возраста генов. BMC Evol Biol.2007, 7: 53-10.1186 / 1471-2148-7-53.

      PubMed PubMed Central Статья Google ученый

    31. 31.

      Эльхайк Э., Сабат Н., Граур Д.: «Обратная связь между скоростью эволюции и возрастом генов млекопитающих» — это артефакт увеличения генетической дистанции со скоростью эволюции и временем дивергенции. Mol Biol Evol. 2006, 23: 1-3. 10.1093 / molbev / msj006.

      PubMed CAS Статья Google ученый

    32. 32.

      Эшбернер М., Болл К.А., Блейк Д.А., Ботштейн Д., Батлер Х., Черри Д.М., Дэвис А.П., Долински К., Дуайт С.С., Эппиг Д.Т., Харрис М.А., Хилл Д.П., Иссель-Тарвер Л., Касарскис А., Льюис С., Матезе Дж.С. , Ричардсон Дж. Э., Рингуолд М., Рубин Г. М., Шерлок Дж.: Онтология генов: инструмент для объединения биологии. Консорциум генных онтологий. Нат Жене. 2000, 25: 25-29. 10.1038 / 75556.

      PubMed CAS PubMed Central Статья Google ученый

    33. 33.

      Lemos B, Bettencourt BR, Meiklejohn CD, Hartl DL: Эволюция белков и уровни экспрессии генов связаны в Drosophila и независимо связаны с количеством мРНК, длиной белка и количеством белок-белковых взаимодействий. Mol Biol Evol. 2005, 22: 1345-1354. 10.1093 / molbev / msi122.

      PubMed CAS Статья Google ученый

    34. 34.

      Ларракуенте А.М., Сактон ТБ, Гринберг А.Дж., Вонг А., Сингх Н.Д., Стерджилл Д., Чжан И., Оливер Б., Кларк А.Г.: Эволюция генов, кодирующих белок, в Drosophila .Тенденции Genet. 2008, 24: 114-123. 10.1016 / j.tig.2007.12.001.

      PubMed CAS Статья Google ученый

    35. 35.

      Чжан Дж .: Распределение длин белков для трех сфер жизни. Тенденции Genet. 2000, 16: 107-109. 10.1016 / S0168-9525 (99) 01922-8.

      PubMed Статья Google ученый

    36. 36.

      Ляо BY, Скотт Н.М., Чжан Дж .: Влияние существенности генов, паттерна экспрессии и компактности генов на скорость эволюции белков млекопитающих.Mol Biol Evol. 2006, 23: 2072-2080. 10.1093 / molbev / msl076.

      PubMed CAS Статья Google ученый

    37. 37.

      Липман Д.Д., Суворов А.В., Кунин Е.В., Панченко А.Р., Татусова Т.А.: Взаимосвязь консервативности белка и длины последовательности. BMC Evol Biol. 2002, 2: 20-10.1186 / 1471-2148-2-20.

      PubMed PubMed Central Статья Google ученый

    38. 38.

      Феррер-Коста С., Ороско М., де ла Крус X: Характеристика связанных с заболеванием полиморфизмов отдельных аминокислот с точки зрения свойств последовательности и структуры.J Mol Biol. 2002, 315: 771-786. 10.1006 / jmbi.2001.5255.

      PubMed CAS Статья Google ученый

    39. 39.

      Wang Z, Moult J: SNP, структура белка и болезнь. Hum Mutat. 2001, 17: 263-270. 10.1002 / humu.22.

      PubMed Статья Google ученый

    40. 40.

      Рост B: Как использовать 1D структуру белка, предсказанную PROFphd. Справочник протоколов протеомики.Отредактировал: Уокер Дж. Э. 2005, Тотова, штат Нью-Джерси: Humana, 875-901.

      Глава Google ученый

    41. 41.

      Jones DT: Прогнозирование вторичной структуры белка на основе матриц оценок, зависящих от положения. J Mol Biol. 1999, 292: 195-202. 10.1006 / jmbi.1999.3091.

      PubMed CAS Статья Google ученый

    42. 42.

      Дункер А.К., Лоусон Дж. Д., Браун Си Джей, Уильямс Р. М., Ромеро П., О Дж. С., Олдфилд Си-Джей, Кэмпен А. М., Рэтлифф С. М., Хиппс К. В., Аусио Дж., Ниссен М.С., Ривз Р., Канг К., Киссинджер К.Р. , Бейли Р.В., Гризволд, доктор медицины, Чиу В., Гарнер Е.К., Обрадович З .: Внутренне неупорядоченный белок.Модель графа Дж. Моля. 2001, 19: 26-59. 10.1016 / S1093-3263 (00) 00138-8.

      PubMed CAS Статья Google ученый

    43. 43.

      Уорд Дж. Дж., Соди Дж. С., Макгаффин Л. Дж., Бакстон Б. Ф., Джонс Д. Т.: Прогнозирование и функциональный анализ нативного нарушения в белках из трех царств жизни. J Mol Biol. 2004, 337: 635-645. 10.1016 / j.jmb.2004.02.002.

      PubMed CAS Статья Google ученый

    44. 44.

      Лю Дж., Тан Х., Рост Б. Петлевые белки, по-видимому, сохраняются в процессе эволюции. J Mol Biol. 2002, 322: 53-64. 10.1016 / S0022-2836 (02) 00736-2.

      PubMed CAS Статья Google ученый

    45. 45.

      Дункер А.К., Кортезе М.С., Ромеро П., Якучева Л.М., Уверский В.Н.: Гибкие сетки. Роль внутреннего расстройства в сетях взаимодействия белков. FEBS J. 2005, 272: 5129-5148. 10.1111 / j.1742-4658.2005.04948.x.

      PubMed CAS Статья Google ученый

    46. 46.

      Вуттон Дж. С., Федерхен С. Анализ композиционно смещенных регионов в базах данных последовательностей. Методы Энзимол. 1996, 266: 554-571.

      PubMed CAS Статья Google ученый

    47. 47.

      Раменский В., Борк П., Сюняев С: Несинонимичные SNP человека: сервер и опрос. Nucleic Acids Res. 2002, 30: 3894-3900. 10.1093 / нар / gkf493.

      PubMed CAS PubMed Central Статья Google ученый

    48. 48.

      Юлениус К., Педерсен А.Г .: За пределами клетки эволюция белка происходит быстрее. Mol Biol Evol. 2006, 23: 2039-2048. 10.1093 / molbev / msl081.

      PubMed CAS Статья Google ученый

    49. 49.

      Bendtsen JD, Nielsen H, von Heijne G, Brunak S: Улучшенное предсказание сигнальных пептидов: SignalP 3.0. J Mol Biol. 2004, 340: 783-795. 10.1016 / j.jmb.2004.05.028.

      PubMed Статья Google ученый

    50. 50.

      Krogh A, Larsson B, von Heijne G, Sonnhammer EL: Прогнозирование топологии трансмембранного белка с помощью скрытой марковской модели: приложение для полных геномов. J Mol Biol. 2001, 305: 567-580. 10.1006 / jmbi.2000.4315.

      PubMed CAS Статья Google ученый

    51. 51.

      Наир Р., Рост Б. Имитация клеточной сортировки улучшает предсказание субклеточной локализации. J Mol Biol. 2005, 348: 85-100. 10.1016 / j.jmb.2005.02.025.

      PubMed CAS Статья Google ученый

    52. 52.

      Camon E, Magrane M, Barrell D, Lee V, Dimmer E, Maslen J, Binns D, Harte N, Lopez R, Apweiler R: База данных аннотации генной онтологии (GOA): обмен знаниями в Uniprot с генной онтологией. Nucleic Acids Res. 2004, 32 (выпуск базы данных): D262-D266. 10.1093 / нар / гх021.

      PubMed CAS PubMed Central Статья Google ученый

    53. 53.

      Финн Р. Д., Мистри Дж., Шустер-Боклер Б., Гриффитс-Джонс С., Холлих В., Лассманн Т., Моксон С., Маршалл М., Ханна А., Дурбин Р., Эдди С. Р., Зоннхаммер Е. Л., Бейтман А.: Pfam : кланы, веб-инструменты и сервисы.Nucleic Acids Res. 2006, 34 (выпуск базы данных): D247-D251. 10.1093 / нар / gkj149.

      PubMed CAS PubMed Central Статья Google ученый

    54. 54.

      Смит Н.Г., Эйр-Уокер A: Гены болезней человека: закономерности и прогнозы. Ген. 2003, 318: 169-175. 10.1016 / S0378-1119 (03) 00772-8.

      PubMed CAS Статья Google ученый

    55. 55.

      Huang H, Winter EE, Wang H, Weinstock KG, Xing H, Goodstadt L, Stenson PD, Cooper DN, Smith D, Alba MM, Ponting CP, Fechtel K: эволюционное сохранение и отбор гена болезни человека ортологи в геномах крыс и мышей.Genome Biol. 2004, 5: R47-10.1186 / GB-2004-5-7-r47.

      PubMed PubMed Central Статья Google ученый

    56. 56.

      Кондрашов Ф.А., Огурцов А.Ю., Кондрашов А.С. Биоинформатический анализ заболеваемости генами человека. Nucleic Acids Res. 2004, 32: 1731-1737. 10.1093 / нар / гх430.

      PubMed CAS PubMed Central Статья Google ученый

    57. 57.

      Futreal PA, Coin L, Marshall M, Down T, Hubbard T, Wooster R, Rahman N, Stratton MR: Перепись генов рака человека.Нат Рев Рак. 2004, 4: 177-183. 10.1038 / nrc1299.

      PubMed CAS PubMed Central Статья Google ученый

    58. 58.

      Форбс С., Клементс Дж., Доусон Е., Бэмфорд С., Уэбб Т., Доган А., Фланаган А., Тиг Дж., Вустер Р., Футреал ПА, Страттон МР: КОСМИК 2005. Бр. Дж. Рак. 2006, 94: 318-322. 10.1038 / sj.bjc.6602928.

      PubMed CAS PubMed Central Статья Google ученый

    59. 59.

      Tu Z, Wang L, Xu M, Zhou X, Chen T, Sun F: Дальнейшее понимание генов болезней человека путем сравнения с генами домашнего хозяйства и другими генами. BMC Genomics. 2006, 7: 31-10.1186 / 1471-2164-7-31.

      PubMed PubMed Central Статья Google ученый

    60. 60.

      Fraser HB, Hirsh AE, Steinmetz LM, Scharfe C, Feldman MW: Скорость эволюции в сети взаимодействия белков. Наука. 2002, 296: 750-752. 10.1126 / science.1068696.

      PubMed CAS Статья Google ученый

    61. 61.

      Джордан И.К., Вольф Ю.И., Кунин Э.В.: Нет простой зависимости между скоростью эволюции белка и количеством белок-белковых взаимодействий: только самые плодовитые взаимодействия имеют тенденцию к медленному развитию. BMC Evol Biol. 2003, 3: 1-10.1186 / 1471-2148-3-1.

      PubMed PubMed Central Статья Google ученый

    62. 62.

      Bloom JD, Adami C: Очевидная зависимость скорости эволюции белка от количества взаимодействий связана с ошибками в наборах данных белок-белковых взаимодействий. BMC Evol Biol. 2003, 3: 21-10.1186 / 1471-2148-3-21.

      PubMed PubMed Central Статья Google ученый

    63. 63.

      Батада Н.Н., Херст Л.Д., Тайерс М.: Эволюционное и физиологическое значение узловых белков. PLoS Comput Biol. 2006, 2: e88-10.1371 / journal.pcbi.0020088.

      PubMed PubMed Central Статья Google ученый

    64. 64.

      Kerrien S, Alam-Faruque Y, Aranda B, Bancarz I, Bridge A, Derow C, Dimmer E, Feuermann M, Friedrichsen A, Huntley R, Kohler C, Khadake J, Leroy C, Liban A, Лифтинк С., Монтекки-Палацци Л., Орчард С., Рисс Дж., Робб К., Рочерт Б., Торникрофт Д., Чжан И., Апвейлер Р., Хермьякоб Н.: IntAct — ресурс с открытым исходным кодом для данных о молекулярном взаимодействии. Nucleic Acids Res.2007, 35 (выпуск базы данных): D561-D565. 10.1093 / нар / gkl958.

      PubMed CAS PubMed Central Статья Google ученый

    65. 65.

      Parmley JL, Urrutia AO, Potrzebowski L, Kaessmann H, Hurst LD: Сплайсинг и эволюция белков у млекопитающих. PLoS Biol. 2007, 5: e14-10.1371 / journal.pbio.0050014.

      PubMed PubMed Central Статья Google ученый

    66. 66.

      Кунин Е.В., Вольф Ю.И.: Эволюционная системная биология: связь между эволюцией и функцией генов. Curr Opin Biotechnol. 2006, 17: 481-487. 10.1016 / j.copbio.2006.08.003.

      PubMed CAS Статья Google ученый

    67. 67.

      Атлас экспрессии генов. [http://wombat.gnf.org/index.html]

    68. 68.

      Янаи I, Бенджамин Х., Шмоиш М., Чалифа-Каспи В., Шклар М., Офир Р., Бар-Эвен А., Хорн-Сабан С. , Safran M, Domany E, Lancet D, Shmueli O: Средние профили транскрипции по всему геному показывают взаимосвязь уровней экспрессии в спецификации тканей человека.Биоинформатика. 2005, 21: 650-659. 10.1093 / биоинформатика / bti042.

      PubMed CAS Статья Google ученый

    69. 69.

      GOA slim. [ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/GO/goa/goslim/goaslim.map]

    70. 70.

      IntAct. [ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/intact/]

    71. 71.

      Перепись ракового гена. [http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/Census/]

    72. 72.

      Каталог соматических мутаций при раке.[http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/]

    73. 73.

      OMIM. [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=OMIM]

    74. 74.

      Мията Т., Ясунага Т.: Молекулярная эволюция мРНК: метод оценки скорости эволюции синонимов и амино кислотные замены из гомологичных нуклеотидных последовательностей и их применение. J Mol Evol. 1980, 16: 23-36. 10.1007 / BF01732067.

      PubMed CAS Статья Google ученый

    75. Стратегии отбора и скрининга в направленной эволюции для улучшения стабильности белка | Биоресурсы и биопроцессинг

      Повышение стабильности белка с помощью библиотечных технологий отображения

      Технологии отображения просты.Как правило, за счет физических связей варианты-мишени, отображаемые на поверхности клеток, рибосом или связанные с их кодирующими нуклеиновыми кислотами, подвергаются воздействию жестких условий, таких как высокая температура, органические растворители и агрессивный pH. Клоны выживания с выбранными свойствами будут обогащены с помощью функциональных анализов. Результат одного раунда отбора часто итеративно используется в качестве шаблонов для создания библиотеки в следующем раунде (рис. 1), за которым следует обнаружение и проверка стабилизированных мутантов.

      Рис. 1

      Использование технологий отображения на основе библиотек для повышения стабильности белка. Генетическая диверсификация POI может быть достигнута с помощью различных стратегий, таких как подверженная ошибкам ПЦР, перетасовка ДНК и включение неприродных аминокислот. Библиотека может отображаться на различных поверхностях носителей, таких как дрожжи, фаги и споры, или конъюгирована с рибосомой и мРНК. Давление разворачивания белка применяется для исключения нестабильных вариантов из библиотеки POI. Стабилизированные варианты получают на основе присущих им свойств, таких как связывание лиганда.Отобранные или проверенные варианты упорядочены, проверены и готовы к новому витку эволюции

      Технологии отображения

      можно разделить на две основные ветви: сотовый дисплей и дисплей без ячеек. Методы клеточного дисплея, такие как фаговый или дрожжевой дисплей, наряду с подходами бесклеточного дисплея, такими как рибосомный или мРНК / кДНК-дисплей, изначально предназначенные для скрининга на аффинность, теперь все применяются для конструирования стабильности белков.

      Подходы к отображению на клеточной поверхности

      Отображение на клеточной поверхности

      Технология отображения на клеточной поверхности относится к методике отображения полипептидов или белков на поверхности живых клеток с последующим анализом и сортировкой клеток по желаемым свойствам.Отображение интересующего белка (POI) может быть достигнуто путем слияния его гена с якорным белком клеточной поверхности, например белками внешней мембраны бактериальных клеток или субъединицами придатков клеточной поверхности (Lee et al. 2003; Galan et al. 2016). Используя сигнальную последовательность якорного белка, слитый белок направляется на поверхность клетки, где он иммобилизуется и может быть доступен из внеклеточного пространства. Обычно каждая отдельная клетка экспрессирует только один вариант POI, и размер библиотеки определяется эффективностью трансформации [например, в лучшем случае 10 8 –10 10 для бактериальных клеток (Galan et al.2016; Пакер и Лю, 2015)]. Функциональное отображение POI может быть обнаружено флуоресцентно меченным, POI-специфическим антителом или лигандом, так что генерируется сигнал скрининга. В качестве альтернативы можно использовать ферментативные реакции, чтобы пометить POI для генерации сигналов. Важным аргументом в пользу этой технологии является то, что только слитые белки с правильной укладкой могут достигать клеточной поверхности, а те, которые содержат неправильно свернутые POI, сохраняются и разрушаются системой контроля качества клеточных белков. Следовательно, сигналы отдельных клеток коррелируют с количеством слитых белков на поверхности клетки, что может использоваться в качестве приблизительной меры стабильности белка.

      Преимущества отображения поверхности ячеек заключаются в следующем. Прежде всего, процесс скрининга может быть удобно выполнен с использованием проточного цитометрического анализа, такого как сортировка клеток с активацией флуоресценции (FACS) или сортировка клеток с магнитной активацией (MACS). Затем эукариотические клетки можно использовать для отображения, позволяя белкам млекопитающих проходить посттрансляционные модификации (PTM) для обеспечения правильной укладки. Наконец, тысячи белков или пептидов могут отображаться на поверхности клетки, чтобы избежать стохастических колебаний, как это видно на фаговом дисплее, на котором отображаются только 1–5 копий POI (Boder and Wittrup 1997).

      Как простейшая система отображения эукариот, дрожжевой дисплей на сегодняшний день является самой популярной платформой для белковой инженерии (Cherf and Cochran 2015). В Saccharomyces cerevisiae общие поверхностные якорные белки, используемые для поверхностного дисплея, включают α-агглютинин (Agα1), α-агглютинин (Aga1p-Aga2p) и С-концевую область флоккулина (Kondo and Ueda 2004). Kieke et al. продемонстрировал одноцепочечную форму вариабельного фрагмента Т-клеточного рецептора (scTCR) с размером библиотеки 6 × 10 7 вариантов на поверхности дрожжей посредством слияния с Aga2p (Kieke et al.1999). Они использовали антитела к TCR, которые распознают конформационные эпитопы домена V β , чтобы обогатить те, которые демонстрируют правильно свернутые scTCR. После трех раундов сортировки с помощью проточной цитометрии были получены стабилизированные мутанты scTCR с более чем половиной мутантных остатков, расположенных на границе домена V α и домена V β , что позволяет предположить, что взаимодействия между двумя доменами могут иметь решающее значение для scTCR стабильность. Кроме того, полагаясь на контроль качества секреторного аппарата дрожжей для предотвращения того, чтобы плохо свернутые целевые варианты достигли поверхности клетки, можно применить внеклеточные стрессовые условия для скрининга вариантов, более устойчивых к денатурации.Например, Шуста и др. применили 30-минутный тепловой шок при 46 ° C для отображаемой библиотеки scTCR перед сортировкой по отдельным клеткам (Shusta et al. 2000). После трех последовательных циклов сортировки обогащенные популяции мутантов имели на порядок более высокий уровень отображаемых на поверхности scTCR, чем стабилизированные мутанты, ранее выделенные Kieke et al. которые были выращены только при оптимальной температуре экспрессии (Kieke et al. 1999), демонстрируя, что эффективность конструирования стабильности с помощью дрожжевого дисплея может быть улучшена дополнительными этапами «скрининга in vitro».

      Отображение спор бактерий и отображение газовых пузырьков

      В последние годы отображение клеточной поверхности было расширено во многие новые технологии, такие как отображение бактериальных спор (Pan et al. 2012) и отображение наночастиц газовых пузырьков (DasSarma и DasSarma 2015). Споры Bacillus subtilis покрыты двумя защитными слоями, состоящими из более чем 70 видов различных белков (Pan et al. 2012), которые обеспечивают достаточное количество якорных участков-кандидатов для отображения экзогенного белка.Обычно используемые якорные белки в отображении поверхности спор B. subtilis — это CotB, CotC, CotE и CotG (Wang et al. 2017a). Представленные белки не подвергаются процессу секреции, поскольку во время сборки спор белки оболочки (и их партнеры по слиянию) непосредственно откладываются на поверхности спор внутри материнской клетки. Кроме того, споры обладают высокой устойчивостью к экстремальным условиям окружающей среды, что делает их подходящими для отображения ферментов, используемых в тяжелых промышленных процессах (Chen et al., 2017), и потенциально позволяет проводить скрининг на наличие более стабилизированных биокатализаторов в этих условиях.Например, Силу и др. представили библиотеку лакказы CotA, которая сама по себе является белком оболочки споры, на поверхности спор B. subtilis для скрининга мутантов со стабильным pH, которые можно использовать в качестве иммобилизованного биокатализатора целых клеток (Sheng et al., 2017) . Споры инкубировали при низком pH перед взаимодействием с субстратом CotA. После семи раундов скрининга было выявлено, что вариант E498G имеет 25-кратное увеличение периода полужизни инактивации ( t 1/2 ) при pH 4 по сравнению с CotA дикого типа.

      Наночастицы газовых везикул (GVNP) относятся к всплывающим органеллам, продуцируемым галофильными микроорганизмами, которые могут быть очищены в виде белковых наночастиц (DasSarma и DasSarma 2015). Экзогенные белки могут отображаться на поверхности GVNP путем слияния с белком GvpC, одним из двух основных белков, которые формируют мембрану GVNP (Stuart et al. 2001). Эти наночастицы являются стабильными, нетоксичными и биотехнологическими, что делает их пригодными для демонстрации антигенов для разработки вакцины.Хотя пока нет сообщений, мы предполагаем, что способность отображать несколько белков с помощью GVNP делает эту систему очень многообещающей для конструирования стабильности белков после приложения стресса разворачивания in vitro, как продемонстрировано другими традиционными системами отображения на поверхности клетки.

      Фаговый дисплей

      Фаговый дисплей был впервые предложен Джорджем Смитом в 1985 году. Целевой белок вставлен в минорный белок оболочки (pIII) нитчатого фага, чтобы направить его на поверхность фаговых частиц (Smith 1985).Сворачивание целевого белка влияет на количество функционального pIII во время сборки фага и, таким образом, определяет инфекционность вириона, обеспечивая связь между стабильностью белка и фенотипом. Так же, как и другие разработанные технологии отображения, фаговый дисплей имеет преимущество, заключающееся в том, что большой размер библиотеки (~ 10 9 ) может быть достигнут быстро и что можно применять широкий диапазон условий скрининга, поскольку фаговые частицы относительно стабильны и могут быть усилены. эффективно.Хотя теоретически размер библиотеки может достигать 10 12 , на практике конечный размер библиотеки для отображения поверхности фага составляет около 10 9 . Это связано с ограничениями эффективности трансформации бактериальных клеток, которые используются для производства фагов, а также уровня экспрессии фагов на поверхности (Galan et al., 2016). Помимо pIII, основной белок оболочки pVIII и несколько других структурных белков также применялись для фагового дисплея (Tan et al. 2016). Как лизогенные фаги, такие как M13 и fd, так и литические фаги, такие как T7, можно использовать для отображения белков-мишеней.Более высокое разнообразие библиотеки может быть достигнуто с использованием литических фагов (Krumpe et al. 2006).

      Как только POI отображается на поверхности фага, вирионы подвергаются воздействию высокой температуры, экстремального pH, химических денатурирующих агентов или протеаз (Pershad and Kay 2013). Фаги с развернутыми вариантами-мишенями будут демонстрировать пониженную связывающую способность, вызывая их удаление во время последующего скрининга аффинности, тогда как хорошо свернутые варианты, сохраняющие аффинность связывания, будут обогащены. Этот процесс обычно требует нескольких раундов связывания, отмывки, элюции (в совокупности именуемых биопэннингом) и амплификации, прежде чем в конечном итоге будут получены мутанты со значительно улучшенными свойствами.Белиен и др. применили тепловой стресс для скрининга стабилизированной эндоксиланазы (XynA) из B. subtilis с помощью трех итеративных биопэннинга (Belien et al. 2008). Было идентифицировано пять одноточечных мутантов, и температура полуинактивации каждого мутанта была увеличена на 2–3 ° C по сравнению с диким типом. Джесперс и др. использовали временный тепловой стресс, чтобы вызвать разворачивание вариабельных доменов тяжелой цепи антитела (dAbs) (Jespers et al. 2004). После охлаждения был проведен скрининг на dAb по отношению к белку A, чтобы выделить варианты, которые могут сопротивляться агрегации и эффективно повторно укладываться.Это привело к шести мутантным dAb, которые можно было удобно очистить как растворимые белки с помощью бактериальной системы экспрессии. Франк и др. последовательно применяли давление пепсина и химотрипсина для скрининга устойчивых к протеазе вариантов гирудина, отображаемых на фаге M13 (Wirsching et al. 2003). Вариант, несущий 6 одноточечных мутаций, был идентифицирован после 2 раундов биопэннинга. Значение IC50 (концентрация ингибитора для достижения 50% ингибирования) этого варианта увеличилось в 100 раз по сравнению с гирудином дикого типа.Более того, вариант все еще сохранял активность частичного ингибирования тромбина.

      Быстрая репликация нитчатого фага позволяет автоматизировать процедуру биопэннинга. В качестве пионера группа Дэвида Лю разработала непрерывную эволюцию с помощью фагов (PACE) для эволюции белков или нуклеиновых кислот, способных выполнять более одного цикла эволюции в час без ручного вмешательства (Esvelt et al. 2011). В этом деликатном методе свежие клетки-хозяева E. coli непрерывно подают в лагунный сосуд и мгновенно заражают реплицирующейся популяцией фагов M13, в то время как старые клетки покидают лагуну с той же скоростью.Только фаги, продуцирующие достаточное количество функционального белка оболочки pIII, являются инфекционными, поэтому их размножение опережает скорость разведения, что приводит к автоматическому обогащению. Чтобы создать связь между активностью POI и производством pIII, были разработаны синтетические схемы. Вместо слияния POI с pIII, POI кодируется вектором селекционного фага (SP), а pIII отдельно кодируется вспомогательной плазмидой (AP), транскрипция которой контролируется активностью POI. Клетки-хозяева также содержат плазмиду мутагенеза (MP), которая увеличивает скорость мутации гена POI при инфицировании.Чтобы выбрать более высокую стабильность, Wang et al. представили дополнительный репортер сворачивания путем слияния POI с N-концевой половиной РНК-полимеразы Т7 на фаговом векторе при экспрессии другой половины РНКП Т7 от хозяина (Wang et al. 2018). Растворимая экспрессия POI позволила восстановить активность T7 RNAP, таким образом инициировав транскрипцию pIII с его промотора T7, чтобы фаг мог продуцировать инфекционные потомства. С помощью этой стратегии мутант P33T, способный ингибировать склонный к агрегации фенотип варианта мальтозо-связывающего белка (MBP), G32D I33P, примерно в два раза был выделен после 3-дневной непрерывной эволюции.

      Бесклеточные подходы

      Бесклеточные технологии отображения исключают необходимость введения генетических материалов в клетки. Это устраняет трудоемкие этапы преобразования, облегчает создание больших библиотек и поддержание разнообразия библиотек, а также позволяет пользователям более точно контролировать спектр мутаций. Емкость библиотеки может достигать 10 12 –10 14 (Галан и др., 2016). Разнообразие библиотеки может быть дополнительно расширено за счет включения неприродных аминокислот или нуклеотидов.

      Отображение рибосом

      Отображение рибосом основано на трансляции in vitro библиотеки молекул мРНК, не содержащих стоп-кодон. Библиотека ДНК POI сначала транскрибируется в мРНК. Во время трансляции тройной комплекс образуется между растущим полипептидом (ковалентно связанным с пептидил-тРНК в P-сайте), рибосомой и мРНК (Pluckthun 2012). Когда трансляция достигает физического конца мРНК, отсутствие стоп-кодона в мРНК заставляет рибосомы останавливаться, и комплекс стабилизируется с помощью сложного контроля условий реакции.Таким образом, прямая физическая связь между молекулой генотипа (нуклеиновой кислотой) и молекулой фенотипа (белком) устанавливается с использованием рибосомы в качестве соединителя. После одного раунда скрининга на предмет желаемых свойств белка молекулы мРНК, прикрепленные к вариантам белка, обратно транскрибируются в продукты кДНК, которые могут быть использованы в следующем раунде транскрипции, трансляции и последующего скрининга.

      Отображение белка или полипептида на поверхности рибосом облегчается путем слияния библиотеки POI с неструктурированной гибкой связующей последовательностью, которая позволяет POI складываться за пределы туннеля рибосомы (Макеев и др.1996). Сочетание транскрипции и трансляции in vitro может быть достигнуто путем инкубации ДНК с клеточными экстрактами, либо экстрактом E. coli S30, либо экстрактом ретикулоцитов кролика (He and Taussig 2007). Для скрининга стабилизированных вариантов белка перед функциональным скринингом обычно применяется давление разворачивания (Buchanan 2012), аналогично стратегиям, используемым в технологиях отображения на клеточной поверхности.

      Jermutus et al. применили снижающий окислительно-восстановительный потенциал во время трансляции одноцепочечных вариабельных фрагментов (scFv) и использовали связывание антигена в качестве считывания для выбора вариантов с повышенной стабильностью (Jermutus et al.2001). DTT уменьшал две консервативные дисульфидные связи в scFv, вызывая потерю активности и агрегацию белков. После пяти раундов отбора с увеличением концентрации DTT наиболее стабильный мутант scFv увеличивал Δ G NU на 30 кДж / моль, который также обладал сдвигом средней точки денатурации на 0,9 M мочевины по сравнению с диким типом. В другом примере Matsuura et al. разработали процедуру для скрининга правильно свернутых белков путем сочетания рибосомного дисплея с протеолитическим давлением.Они также использовали хроматографию гидрофобного взаимодействия (HIC), чтобы исключить варианты белка, склонные к агрегации (Matsuura and Pluckthun 2003). Комбинация двух давлений привела к заметному обогащению более стабильными белками.

      отображение мРНК / отображение кДНК

      Впервые предложенный в 1997 г., отображение мРНК представляет собой метод скрининга, основанный на образовании бинарного комплекса между белком и его кодирующей нуклеиновой кислотой in vitro (Nemoto et al. 1997; Roberts and Szostak 1997) . Ключом к этому методу является то, что мРНК прикрепляется через линкер ДНК к пуромицину (аналог аминоацильного конца тирозил-тРНК), который прекращает трансляцию, войдя в сайт рибосомы А.В результате растущая полипептидная цепь ковалентно присоединяется к пуромицину и его кодирующей мРНК. Подобно отображению рибосом, скрининг на функцию и стабильность можно проводить одновременно на отображении мРНК. После трансляции in vitro комплекс мРНК-белок библиотеки POI подвергается давлению стабильности с последующим функциональным скринингом до получения желаемых вариантов.

      Система экстракта E. coli S30, обычно используемая для бесклеточной трансляции, содержит эндогенные нуклеазы и протеазы, которые разрушают мРНК и транслируемые белки.Чтобы обойти эти риски, Nagumo et al. представила восстановленную систему синтеза белка E. coli , называемую синтезом белка с использованием рекомбинантных элементов (PURE), на платформу отображения мРНК (Nagumo et al., 2016). Все этапы, выполняемые с использованием очищенных элементов, приводят к большим библиотекам по сравнению с традиционной системой на основе S30. Кроме того, он предлагает возможность введения неприродных аминокислот с превосходной эффективностью скрининга. Емкость библиотеки мРНК-дисплея может достигать 10 13 , что в 10 6 раз больше, чем у дрожжевого дисплея и в 10 4 раз больше, чем у традиционного фагового дисплея (Takahashi et al.2003 г.). Тем не менее, как отображение мРНК, так и отображение рибосом ограничены в экстремальных условиях скрининга из-за нестабильности мРНК. Чтобы противостоять этой проблеме, Курц и др. разработали стратегию отображения кДНК, основанную на обычном отображении мРНК, с той модификацией, что использовали разветвленный конъюгат мРНК-пуромицин. Этап обратной транскрипции выполнялся сразу после генерации слияния мРНК-белок, что приводило к ковалентному прикреплению белка к кодирующей его ДНК (Ueno and Nemoto 2012).Слияние кДНК-белок затем использовалось в последующих этапах скрининга, который, как было продемонстрировано, более инертен по отношению к деградации с периодом полужизни, по крайней мере, в четыре раза дольше, чем у слияния мРНК-белок (Kurz et al. 2001).

      Stephen et al. сконструировал cycGiBP, циклизованный пептид, для повышения стабильности и сродства к мишени путем введения кодона неприродных аминокислот в его мРНК (Fiacco et al., 2016). Комплекс мРНК-cycGiBP инкубировали с иммобилизованным трипсином, химотрипсином, протеиназой К и аминопептидазой перед скринингом связывания для определения стабильности cycGiBP.Мутант, полученный в последнем раунде скрининга, показал 500-кратное увеличение стабильности в сыворотке и 3700-кратное улучшение устойчивости к протеазам по сравнению с исходной последовательностью.

      Повышение стабильности белка с помощью технологий на основе биосенсоров стабильности белка

      В описанных выше технологиях отображения сворачивание конкретного POI часто определяется его функцией, т. Е. Способностью связывать лиганд или антитело, или ферментативной активностью приводящие к колориметрическим или флуоресцентным сигналам.Биосенсоры стабильности белка предоставляют альтернативные методы для мониторинга стабильности белка, когда функцию POI трудно охарактеризовать. Типичный биосенсор стабильности белка состоит из двух основных компонентов: фенотипического репортерного белка и POI, генетически слитого с репортером. Благодаря экспрессии слияния на сворачивание репортера влияет сворачивание POI, что приводит к фенотипическим изменениям. Следовательно, прямая связь между способностью к складыванию POI и фенотипом репортера устанавливается без предварительного знания структуры или функции POI.Многие из биосенсоров стабильности обеспечивают легко определяемые фенотипы, которые позволяют производить отбор или скрининг вариантов стабилизированного белка с высокой пропускной способностью (рис. 2). Однако, поскольку отбор или скрининг выполняется in vivo, размер библиотеки POI обычно ограничивается эффективностью трансформации.

      Рис. 2

      Методы скрининга и отбора, основанные на биосенсорах стабильности белков. Разнообразные генетические библиотеки могут быть легко подвергнуты скринингу или отбору с использованием различных биосенсоров стабильности белка.Эти биосенсоры устанавливают прямые связи между способностью к складыванию POI и легко обнаруживаемыми фенотипами репортерных белков, такими как маркеры устойчивости к антибиотикам и флуоресцентные белки. Стабильные или растворимые мутанты могут быть идентифицированы путем скрининга клеток на предмет высокой флуоресценции или отбора клеток с повышенными концентрациями антибиотиков

      Репортер хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT)

      Хлорамфениколацетилтрансфераза (CAT) представляет собой тример из идентичных субъединиц, который придает устойчивость к хлорамфениколу путем ацетилирования хлорамфеникола для предотвращения его связывания с рибосомами.CAT — широко используемый репортерный белок из-за его легко обнаруживаемой ферментативной активности (Daunert et al. 2000). Для использования в качестве биосенсора CAT сливается с C-концом POI, так что его способность детоксифицировать хлорамфеникол связана со стабильностью и растворимостью POI (Maxwell et al. 1999). Клетки, экспрессирующие слияния CAT с нестабильными или нерастворимыми белками, демонстрируют пониженную устойчивость к хлорамфениколу по сравнению с клетками, экспрессирующими слияния со стабильными и растворимыми белками, что обеспечивает количественную оценку стабильности белков in vivo.В экспериментах по направленной эволюции стабилизированные варианты белка выделяли путем высевания клеток, экспрессирующих библиотеку POI в слитой CAT, на твердую среду, содержащую увеличивающиеся концентрации хлорамфеникола. Ряд успешных применений этого биосенсора включает скрининг митохондриального цитохрома P450 с повышенной растворимостью (Janocha et al. 2011), стабилизацию имидазол-глицеринфосфатсинтазы (Seitz et al. 2007), интерлейкина-15 (Behar et al. 2011) , (+) — δ-кадиненсинтаза (Yoshikuni et al.2006) и многое другое.

      Следует отметить, что эта конструкция «голова к хвосту» имеет несколько недостатков, не только ограничивающихся биосенсором CAT, но также и другими репортерными системами с конструкциями терминального слияния, такими как зеленый флуоресцентный белок (GFP) (Kawasaki and Inagaki). 2001; Cabantous et al. 2005a), канамициннуклеотидилтрансфераза (Chautard et al. 2007) и дигидрофолатредуктаза (DHFR) (Liu et al. 2006). Неповрежденный функциональный репортерный белок может быть высвобожден протеолитическим расщеплением плохо свернутой POI, альтернативной трансляцией из-за сдвига рамки считывания или наличия внутренних сайтов связывания криптических рибосом в гене POI (Seitz et al.2007; Кавасаки и Инагаки 2001; Cabantous et al. 2005a), или за счет включения стоп-кодона около 5′-конца гена POI (Chautard et al. 2007), все это приводит к увеличению количества ложноположительных результатов. Chen et al. также сообщили, что аминокислотные последовательности линкера, соединяющего POI и CAT, оказывают существенное различное влияние на отбор (Chen et al. 2009). Например, линкер WPGSPA приводил к более медленному росту клеток на чашках с хлорамфениколом, меньшей толерантности к большим POI и гораздо более низкому соотношению в кадре по сравнению с линкером AGSSAAGSGS.Таким образом, очевидная частота ложноположительных результатов и зависимость от линкерной последовательности препятствовали широкому применению CAT-системы в разработке стабильности белков.

      Трехсторонний репортер β-лактамазы

      Один из альтернативных подходов к созданию слияний состоит во вставке POI в репортерный белок для создания сэндвич-конструкции, которая, как ожидается, решит проблемы, вызванные протеолизом или трансляцией со сдвигом рамки считывания. После того, как POI вставлен в разрешающий сайт внутри репортера, его продуктивная укладка определяет эффективность ассоциации двух половин репортера и, следовательно, связана с фенотипом, присвоенным репортером.Если POI стабилен и хорошо уложен, репортерный белок может снова собраться в функциональную конформацию. Напротив, нестабильный или плохо свернутый POI склонен к протеолизу, расщепляя репортер на две половины, которые в конечном итоге разрушаются. Если в гене POI происходит мутация сдвига рамки считывания, экспрессия репортера также будет нарушена, что приведет к отсутствию фенотипа. В этом отношении трехсторонняя настройка снизит количество ложных срабатываний.

      Наиболее репрезентативная трехсторонняя репортерная система была разработана Foit et al.основан на β-лактамазе (βla) ТЕМ-1, которая придает устойчивость к β-лактамным антибиотикам путем их гидролиза в бактериальной периплазме (Foit et al. 2009). βla является идеальным репортерным белком, поскольку он мономерный, относительно небольшой (29 кДа) и имеет низкую цитотоксичность. Кроме того, у эукариот и многих прокариот отсутствуют ортологи, поэтому фенотип может хорошо коррелировать с уровнем экзогенно экспрессируемой βla. Расщепление βla на открытой петле использовалось для обнаружения белок-белковых взаимодействий, связывания лиганда и сетей взаимодействия (Wehrman et al.2002; Galarneau et al. 2002; Lofdahl et al. 2009; Реми и Мичник 2015). Фойт и др. преобразовал βla в биосенсор стабильности, вставив POI между остатками 196 и 197, сайт, ранее продемонстрированный как допускающий расщепление. Селекция колоний, выращенных на возрастающих концентрациях пенициллина, позволила выделить 26 стабилизированных вариантов иммунного белка 7 (Im7). Было подтверждено, что эти варианты имеют значения ΔG NU , увеличенные на 0,6–5,9 кДж / моль, более кинетически стабильные и имеют более высокие уровни экспрессии.Аналогичные подходы применялись той же группой для получения более свернутых вариантов ингибитора трипсина поджелудочной железы крупного рогатого скота (BPTI) (Foit et al. 2011). Среди 14 вариантов BPTI, G28W и K26M, которые проявляли наиболее интенсивную устойчивость к пенициллину, значительно повышали стационарные уровни в периплазме более чем в два раза по сравнению с диким типом.

      Xiong et al. продемонстрировали способность этой системы оценивать способность к складыванию белков, созданных de novo, охватывающих 4 структурных класса (все-α, все-β, α / β и α + β) (Xiong et al.2014). Они обнаружили, что при выражении в виде слияния βla разработанная последовательность, которая обеспечивает высокую устойчивость к пенициллину, также образует хорошо сложенную структуру в растворе. Благодаря подходу направленной эволюции, складываемость первоначально разработанных белков была дополнительно оптимизирована, демонстрируя способность этой системы исправлять исходные проблемные конструкции в качестве эффективного дополнения к подходу рационального дизайна. Wang et al. также показали, что эта система может быть применена для оптимизации сворачивания сконструированного химерного (βα) 8-цилиндрического белка (TIM-цилиндрический белок) (Wang et al.2017b). За шесть этапов эволюции половина температуры плавления ( T m ) изолированного варианта, которая привела к наивысшей устойчивости к ампициллину, была улучшена более чем на 20 ° C.

      В дополнение к бета-лактамазе ТЕМ-1, трехкомпонентные репортерные системы, основанные на устойчивости к антибиотикам, были аналогичным образом созданы в маркерах устойчивости к канамицину, стрептомицину / спектиномицину и курсеотрицину (Malik et al. 2014).

      Расщепленный репортер GFP

      Зеленый флуоресцентный белок (GFP) на сегодняшний день является наиболее часто используемым и наиболее изученным репортерным белком в биохимии и клеточной биологии.Для применения GFP в сворачивании белков Waldo et al. впервые разработал быстрый анализ сворачивания белков с использованием конструирования GFP и POI «голова к хвосту» (Waldo et al. 1999). Базовый принцип определения стабильности белков состоит в том, что образование хромофора GFP требует правильной укладки GFP (Ormo et al. 1996), а GFP плохо сворачивается при слиянии с неправильно свернутыми белками. Таким образом, только слитый белок с надлежащей укладкой и разумной растворимостью может придавать GFP сильную флуоресценцию. Путем скрининга испускаемой флуоресценции, склонная к агрегации H-субъединица ферритина из лягушки-быка была успешно оптимизирована для полной растворимости при 37 ° C (Waldo et al.1999). Однако основная проблема использования слияния GFP в качестве репортера агрегации состоит в том, что нерастворимые слитые белки все еще будут в значительной степени флуоресцентными, если их скорости агрегации ниже скорости образования хромофора GFP (Kothawala et al. 2012). Более того, терминальное слияние GFP может нарушать укладку белков-мишеней и изменять их склонность к неправильной укладке (Kothawala et al. 2012; Bertens et al. 2003). Чтобы преодолеть эти ограничения, в исходную систему GFP были внесены изменения.

      Уолдо и соавторы разработали систему, в которой GFP расщепляется на два неактивных нефлуоресцентных фрагмента: GFP1-10 (остатки 1-214), экспрессируемый сам по себе, и GFP11 (остатки 215-230), предназначенный для слияния с POI (Cabantous et al. 2005b). Затем они развили два фрагмента, чтобы улучшить их растворимость и эффективность самосборки. Из-за своего небольшого размера метка GFP11 оказывает минимальное влияние на растворимость и укладку белков, с которыми она сливается. Последовательная экспрессия GFP11-tagged POI и большого фрагмента GFP1-10 позволяет POI подвергаться контролю качества белка перед восстановлением хромофора.Важное обоснование этого метода измерения стабильности белка заключается в том, что такие процессы, как неправильная укладка POI или агрегация, которые делают тег GFP11 недоступным, могут препятствовать его комплементации с фрагментом GFP1-10, что приводит к отсутствию зеленой флуоресценции и только тегу GFP11, слитному с -свернутый POI может получить доступ к фрагменту GFP1-10 вместе с образованием хромофора GFP (Cabantous et al. 2005b). Используя систему разделения GFP в сочетании с анализом методом эксклюзионной хроматографии (FSEC), Rodriguez-Banqueri et al.успешно улучшил стабильность мембранного белка SteT (обмениватель l-серина / l-треонина Bacillus subtilis ) (Rodriguez-Banqueri et al., 2016). Два оптимизированных мутанта, I134V / A377T и L210Q / M229V, показали наилучшее комбинированное улучшение экспрессии, стабильности и монодисперсности детергентов. Эта система split-GFP также использовалась для скрининга растворимости белка в автоматическом и высокопроизводительном режиме за счет включения модульных платформ для обработки жидкостей (Listwan et al.2009 г.).

      Кроме того, Уолдо и его коллеги дополнительно расщепили GFP1-10 на GFP1-9 (остатки 1–193) и GFP10 (остатки 194–212) вместе с GFP11 (остатки 213–233), чтобы получить трехчастную расщепленную систему GFP (Cabantous et al. др.2013). Затем точка интереса вставляется между GFP10 и GFP11, образуя зажатую шпильку, которую GFP1–9 может распознать. Недавно Мо и соавт. вставили эстеразу Aaeo1 между GFP10 и GFP11 и провели скрининг библиотеки Aaeo1 с помощью высокопроизводительной проточной цитометрии и устройства для сбора колоний QPix420 (Mo et al.2018). Они выделили 55 колоний с более яркой флуоресценцией из библиотеки, содержащей 25000 вариантов. После вторичного скрининга на активность эстеразы они получили два мутанта, чья растворимая экспрессия была улучшена вдвое в E. coli со значениями k cat / K m в два раза выше, чем у родителя.

      Если GFP разрезать на поверхностной петле между остатками 157 и 158, полученные фрагменты не будут спонтанно повторно собираться при одновременном образовании в бактериях (Magliery et al.2005). Линдман с соавторами использовали эту сплит-систему для повышения стабильности 56-остатков B1 домена белка G (PGB1) (Lindman et al. 2010). Здесь PGB1 был разделен между остатками 40 и 41, и полученные N- и C-фрагменты были генетически слиты с GFP 158–238 и GFP 1–157 соответственно. Подчеркивающий принцип заключается в том, что взаимодействия, стабилизирующие свернутую конформацию интактного белка, часто бывают сильными и достаточно специфичными, чтобы позволить восстановление интактной белковой складки из фрагментов белка.Следовательно, скрининг мутаций, усиливающих связывание двух фрагментов PGB1, позволит выявить мутации, повышающие стабильность. Из «интеллектуальной библиотеки» из 3456 вариантов PGB1 1–40 были отобраны, секвенированы колонии, демонстрирующие более яркую флуоресценцию, и мутации воссозданы на интактном PGB1 для анализа на стабильность. Лучший мутант показал увеличение средней точки термической денатурации на 12 ° C и увеличение ΔG NU на 8,7 кДж / моль при 25 ° C (Lindman et al. 2010).

      С момента открытия GFP для разработки биосенсоров на основе флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) стало доступно множество ярких флуоресцентных белков со спектрами от синего до красного. В этих сенсорах POI фланкируется донором флуоресценции и белком-акцептором. Изменения в конформации POI отражаются изменениями в передаче энергии, и только хорошо сложенные POI могут приблизить донор и акцептор в непосредственной близости для создания эффективных сигналов FRET (Tamura and Hamachi 2014; Lindenburg and Merkx 2014).Такие свойства позволяют проводить скрининг стабилизированных вариантов белка. Например, используя трехкомпонентный датчик, состоящий из GFP, POI и синего флуоресцентного белка (BFP), Philipps et al. провели скрининг библиотеки доменов иммуноглобулина V L 2 на наличие ярко-зеленых бактериальных колоний, используя длину волны возбуждения BFP (Philipps et al. 2003). Наконец, они идентифицировали два мутанта иммуноглобулина V с доменом L 2, у которых Δ G NU увеличилась на 4 кДж / моль.

      GFP также может работать как биосенсор стабильности полу-in vitro.Многие из стрессовых условий (например, органических растворителей, детергентов), применяемые в вышеупомянутых технологиях отображения, не применимы к живым клеткам, поскольку они вызывают лизис клеток. Это препятствует использованию биосенсоров in vivo, таких как GFP, в разработке стабильности, отличной от термодинамической или протеазной стабильности. Недавняя удачная попытка устранить эти ограничения — связать GFP с клеточной высокопроизводительной инкапсуляционной солюбилизацией и скринингом (CHESS) (Yong and Scott, 2015), которая первоначально была разработана для создания устойчивых к детергентам рецепторов, связанных с G-белками (GPCR) (Scott и Pluckthun 2013).В CHESS каждая клетка, экспрессирующая вариант POI, инкапсулируется полимерами, устойчивыми к детергенту, для получения микрокапсул, подобных клеткам. Таким образом, стабильность POI может быть определена с использованием высокопроизводительного метода в условиях, которые солюбилизируют клеточные мембраны. Исследователи продемонстрировали, что биосенсоры GFP более 70 кДа хорошо удерживаются внутри микрокапсул после обработки детергентом. Кроме того, флуоресцентный сигнал от инкапсулированного GFP может поддерживаться при 90 ° C до 5 минут и в 2% SDS до 24 часов (Yong and Scott 2015).Эти результаты являются хорошей отправной точкой для скрининга стабильных вариантов белка с помощью биосенсора GFP в суровых промышленных условиях. В качестве доказательства принципа была проведена итеративная проверка библиотеки MBP-sfGFP (суперпапка GFP) с помощью CHESS, и были получены варианты sfGFP, показывающие повышенную температуру и устойчивость к SDS (Yong and Scott 2015). Ожидается, что наличие устойчивого к детергентам sfGFP позволяет сообщать о стабильности его слитого POI в аналогичных денатурирующих условиях.Вполне возможно, что, изменив тип стрессоров (таких как pH, активные формы кислорода и окислительно-восстановительные состояния), этот подход может увеличить вероятность создания других стабильностей в дополнение к термодинамической стабильности.

      Датчик укладки Tat

      Клетки используют различные системы контроля качества белка (PQC), чтобы контролировать, правильно ли свернуты белки. У большинства бактерий и архей система экспорта белков с двойной аргининовой транслокацией (Tat) осуществляет контроль качества белков, доставляя только правильно уложенные белки через внутреннюю мембрану (Palmer and Berks 2012; DeLisa et al.2003 г.). Основываясь на том факте, что Tat транслоказа отличает свернутые белки от неправильно свернутых белков и строго экспортирует только первые, DeLisa и др. Разработали систему генетической селекции на растворимость белков (Fisher et al. 2006, 2011). Трехкомпонентный биосенсор состоит из N-концевого сигнального пептида Tat (например, ssTorA), который направляет слитый белок к транслоказе Tat, POI и репортеру β-лактамазы TEM1, слитому на C-конце POI, что только придает устойчивость к пенициллину. при перемещении в периплазматическое пространство (Fisher et al.2011; Варахо-Жмаев и др. 2013). Используя эффективную способность коррекции пути экспорта Tat и специфичную для локализации функцию репортера βla, статус сворачивания целевого белка напрямую связан с фенотипом устойчивости к антибиотикам.

      Биосенсор Tat использовался в направленной эволюции для идентификации вариантов пары белков с повышенной растворимостью. После идентификации мутанта F19S L34P пептида Aβ42 болезни Альцгеймера Fisher et al. показали, что гидрофобный кластер, состоящий из остатков 17–21 и 30–36, отвечает за растворимость пептида Aβ42 (Fisher et al.2006 г.). Кроме того, они выделили растворимый scFv после трех раундов лабораторной эволюции, начиная с нерастворимой родительской последовательности (Fisher and DeLisa 2009). Для эндоглюканазы Cel5A из фитопатогена Fusarium graminearum (FgCel5A) Boock et al. улучшил его гетерологичную продукцию в E. coli и идентифицировал вариант, продукция которого была увеличена в 30 раз (Boock et al. 2015). Путем сочетания полувысокопроизводительного скрининга на функцию они также восстанавливали ферментативную активность выделенных мутантов до того же уровня, что и фермент дикого типа.Помимо группы ДеЛизы, Ким и др. идентифицировали растворимые варианты вариабельного домена тяжелой цепи человека (V H ) из библиотеки VH зародышевой линии человека, выполнив три цикла отбора растворимости (Kim et al. 2014). Затем лучший вариант был использован в качестве основы, в которую комбинаторные мутации были введены в семи конкретных сайтах с использованием дегенеративных кодонов NNK. Отбор выявил сильное смещение в сторону остатка объемной боковой цепи, триптофана, в двух соседних положениях, локализованных в заметном кармане на поверхности.Эти остатки вместе с третьим триптофаном образуют триаду, демонстрирующую важную роль гидрофобной упаковки в поддержании стабильности белка.

      Помимо транспорта одной полипептидной цепи, транслоказа Tat также поддерживает экспорт гетероолигомерных белковых комплексов. Эта уникальная особенность позволяет применять биосенсор на основе Tat для отбора стабильных белковых комплексов. В таких случаях применяется автостопный механизм, в котором один компонент сливается с сигнальной последовательностью Tat, а другой соединяется с репортером βla.βla может котранслоцироваться в периплазму только в том случае, если комплекс относительно стабилен (Rodrigue et al. 1999; Waraho and DeLisa 2009). Эта стратегия позволила выделить варианты scFv с повышенным сродством к домену bZIP из 47 остатков дрожжевого фактора транскрипции Gcn4p. Растворимость этих вариантов также улучшалась, когда они экспрессировались сами по себе, а растворимость лучшего варианта повышалась более чем в десять раз (Waraho-Zhmayev et al. 2014).

      Повышение стабильности белка без использования слияния репортерных белков

      Хотя исследователи приложили все усилия, чтобы свести к минимуму влияние репортерных белков на врожденные свойства белков-мишеней, присутствие тегов слияния в большей или меньшей степени влияет на статус складывания или функции in vivo целевые белки (Waldo 2003).Следовательно, прямой скрининг или отбор, основанный на стабильности или растворимости целевого белка, а не на фенотипе, присваиваемом партнером по слиянию, является начальной и конечной целью направленной эволюции стабильности белка.

      Анализ фильтрации колоний, прототип которого был разработан Dreher и соавторами, использует принцип, согласно которому растворимые белки могут диффундировать через пористую мембрану, но агрегаты белка трудно проникнуть через мембрану из-за их большого диаметра (Dreher et al.1991). В их работе фрагменты антител, экспрессируемые в бактериальных клетках, диффундируют через фильтр Durapore, захватываются антигеном на второй мембране и обнаруживаются стандартными иммунохимическими реагентами. Этот анализ был достаточно чувствительным, чтобы позволить точное выделение одной положительной бактериальной колонии, экспрессирующей антиген-специфический scFv, из 10 000 отрицательных колоний (Dreher et al. 1991). Концептуально аналогично, Knaust et al. использовали фильтровальные планшеты в 96-луночном формате для отделения растворимых фракций от телец включения в клеточных лизатах (Knaust and Nordlund 2001).Растворимые фракции, прошедшие через фильтровальные пластины, загружали на нитроцеллюлозную мембрану. Только растворимые рекомбинантные белки могут быть обнаружены с помощью специфичных для мишени антител в последующих анализах иммуноблоттинга.

      На основании предыдущего исследования Cornvik et al. впервые применил блот-фильтрацию колоний (сокращенно CoFi-блот) с принципами направленной эволюции для выделения вариантов растворимых белков (Cornvik et al. 2005). При скрининге лейцинкарбоксилметилтрансферазы 1 из библиотеки N-концевых делеций Cornvik et al.идентифицировали домены, которые могут экспрессироваться в растворимой форме. Asial et al. еще больше расширили разнообразие целевых белков в блоте CoFi (Asial et al. 2013). Они улучшили T m гидролазного домена NUDIX человеческого NUDT18 на 26,6 ° C, scFv анти-Grb2 на 9,5 ° C, антагониста рецептора интерлейкина-1 на 9,5 ° C и протеазы TEV на 9,8 ° C. Более того, они продемонстрировали, что эти стабилизированные мутанты все еще сохраняли активность, аналогичную их соответствующим белкам дикого типа. В целом, CoFi-блотом легко манипулировать, и он может стать надежным и независимым от репортером методом скрининга для разработки стабильности белка.

      Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

      Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


      Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

      Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

      • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки вашего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
      • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
      • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
      • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
      • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

      Почему этому сайту требуются файлы cookie?

      Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


      Что сохраняется в файле cookie?

      Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

      Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

      Таблица выбора экспрессии и очистки белка

      Таблица выбора экспрессии и очистки белка | Таблица выбора экспрессии и очистки белка NEB | NEB Принимать файлы cookie

      Мы используем файлы cookie, чтобы понять, как вы используете наш сайт, и улучшить общее впечатление пользователя. Это включает в себя персонализацию контента и рекламы. Чтобы узнать больше и управлять файлами cookie, обратитесь к нашему Заявлению о файлах cookie .

      Дом Инструменты и ресурсы Таблицы выбора Таблица выбора экспрессии и очистки белков

      Экспрессия и очистка белка могут быть очень сложными, поскольку не существует единого подхода, подходящего для каждого белка или каждого последующего применения.На успешную экспрессию может влиять собственная способность каждого отдельного белка сворачиваться, его растворимость, токсичность или необходимость посттрансляционных модификаций. Кроме того, приложение, для которого в конечном итоге будет использоваться белок, может диктовать, как белок должен быть экспрессирован или очищен. Поэтому важно иметь гибкий набор инструментов и методов, которые можно применить к каждому уникальному проекту.

      Каждая технология экспрессии NEB предлагает различные преимущества, которые позволяют вам выбрать стратегию, которая наилучшим образом соответствует вашим потребностям в экспрессии и очистке белка.Многие из векторов экспрессии имеют совместимый поли-линкер, что позволяет легко перемещать интересующий ген между системами. Ниже перечислены различные приложения, а также рекомендуемый комплект NEB.

      Экспрессия и очистка белка могут быть очень сложными, поскольку не существует единого подхода, подходящего для каждого белка или каждого последующего применения. На успешную экспрессию может влиять собственная способность каждого отдельного белка сворачиваться, его растворимость, токсичность или необходимость посттрансляционных модификаций.Кроме того, приложение, для которого в конечном итоге будет использоваться белок, может диктовать, как белок должен быть экспрессирован или очищен. Поэтому важно иметь гибкий набор инструментов и методов, которые можно применить к каждому уникальному проекту.

      Каждая технология экспрессии NEB предлагает различные преимущества, которые позволяют вам выбрать стратегию, которая наилучшим образом соответствует вашим потребностям в экспрессии и очистке белка. Многие из векторов экспрессии имеют совместимый поли-линкер, что позволяет легко перемещать интересующий ген между системами.Ниже перечислены различные приложения, а также рекомендуемый комплект NEB.

      * Капуст и Во (1999) Protein Science, 8, 1668–1674. PMID: 10452611

      Сессия истекла

      Вы бездействовали более 20 минут, в целях безопасности вы вышли из системы. Пожалуйста, войдите снова, чтобы продолжить сеанс.

      Войти

      Организация изменена

      Ваш профиль привязан к учреждению, пожалуйста, войдите еще раз, чтобы завершить обновление вашего профиля.

      Войти

      Выбор белков с желаемыми свойствами из библиотек природных протеомов с использованием дисплея мРНК

    76. 1

      Tateyama, S. et al. Аффинный отбор ДНК-связывающих белковых комплексов с использованием отображения мРНК. нуклеиновые кислоты. Res. 34 , e27 (2006).

      Артикул PubMed PubMed Central Google ученый

    77. 2

      Schilling, O., Huesgen, P.F., Barré, O., Auf dem Keller, U.И в целом C.M. Характеристика специфичности первичных и непраймерных активных сайтов протеаз с помощью пептидных библиотек, полученных из протеома, и тандемной масс-спектрометрии. Нат. Protoc. 6 , 111–120 (2011).

      CAS Статья PubMed Google ученый

    78. 3

      Gevaert, K. et al. Изучение протеомов и анализ процессинга белков с помощью масс-спектрометрической идентификации отсортированных N-концевых пептидов. Нат.Biotechnol. 21 , 566–569 (2003).

      CAS Статья PubMed Google ученый

    79. 4

      Brockstedt, E. et al. Идентификация белков, связанных с апоптозом, в клеточной линии лимфомы Беркитта человека. Расщепление гетерогенного ядерного рибонуклеопротеина A1 каспазой 3. J. Biol. Chem. 273 , 28057–28064 (1998).

      CAS Статья PubMed Google ученый

    80. 5

      Филдс, С.И Сонг, О. Новая генетическая система для обнаружения белок-белковых взаимодействий. Nature 340 , 245–246 (1989).

      CAS Статья PubMed Google ученый

    81. 6

      Любан Дж. И Гофф С.П. Дрожжевая двугибридная система для изучения белок-белковых взаимодействий. Curr. Opin. Biotechnol. 6 , 59–64 (1995).

      CAS Статья PubMed Google ученый

    82. 7

      Миллер, Дж.& Stagljar, I. Использование дрожжевой двугибридной системы для идентификации взаимодействующих белков. Methods Mol. Биол. 261 , 247–262 (2004).

      CAS PubMed Google ученый

    83. 8

      Lin, H. & Cornish, V.W. Методы скрининга и отбора для крупномасштабного анализа функции белков. Angew. Chem. Int. Эд. Англ. 41 , 4402–4425 (2002).

      CAS Статья PubMed Google ученый

    84. 9

      Смит, Г.P. Нитевидный слитый фаг: новые векторы экспрессии, которые отображают клонированные антигены на поверхности вириона. Наука 228 , 1315–1317 (1985).

      CAS Статья PubMed Google ученый

    85. 10

      Parmley, S.F. И Смит, Г. Отбираемые антителами нитчатые фаговые векторы fd: аффинная очистка генов-мишеней. Ген 73 , 305–318 (1988).

      CAS Статья PubMed Google ученый

    86. 11

      Смит, Г.П. и Скотт, Дж. Библиотеки пептидов и белков отображаются на нитчатых фагах. Meth. Энзимол. 217 , 228–257 (1993).

      CAS Статья PubMed Google ученый

    87. 12

      Конрад, У. и Шеллер, Дж. Соображения по методологии антитело-фагового дисплея. Расческа. Chem. Экран высокой пропускной способности 8 , 117–126 (2005).

      CAS Статья PubMed Google ученый

    88. 13

      Weaver-Feldhaus, J.М., Миллер, К.Д., Фельдхаус, М.Дж. и Сигель, Р.В. Руководили эволюцией разработки конформационно-специфичных аффинных реагентов с использованием дрожжевого дисплея. Protein Eng. Des. Sel. 18 , 527–536 (2005).

      CAS Статья PubMed Google ученый

    89. 14

      Fukuda, N. et al. Высокоэффективное восстановление клеток-мишеней с использованием улучшенной дрожжевой системы отображения для обнаружения белок-белковых взаимодействий. Заявл.Microbiol. Biotechnol. 76 , 151–158 (2007).

      CAS Статья PubMed Google ученый

    90. 15

      Jung, S.T., Jeong, K.J., Iverson, B.L. И Джорджиу, Г. Связывание и обогащение сферопластов Escherichia coli , экспрессирующих связанные с внутренней мембраной scFv-антитела на поверхностных иммобилизованных антигенах. Biotechnol. Bioeng. 98 , 39–47 (2007).

      CAS Статья PubMed Google ученый

    91. 16

      Маттеакис, Л.C., Bhatt, R.R. & Dower, W.J. Система полисомного дисплея in vitro для идентификации лигандов из очень больших библиотек пептидов. Proc. Natl. Акад. Sci. США 91 , 9022–9026 (1994).

      CAS Статья PubMed Google ученый

    92. 17

      Hanes, J. & Plückthun, A. Выбор и эволюция функциональных белков in vitro с использованием рибосомного дисплея. Proc. Natl. Акад.Sci. США 94 , 4937–4942 (1997).

      CAS Статья PubMed Google ученый

    93. 18

      Брюкнер, А., Польге, К., Ленце, Н., Ауэрбах, Д. и Шлаттнер, У. Двугибридные дрожжи, мощный инструмент для системной биологии. Внутр. J. Mol. Sci. 10 , 2763–2788 (2009).

      Артикул PubMed PubMed Central Google ученый

    94. 19

      Хуанг, Х., Едынак, Б. И Бадер, Дж. Куда пропали все взаимодействия? Оценка покрытия двухгибридных карт взаимодействия белков. PLoS Comput. Биол. 3 , e214 (2007).

      Артикул PubMed PubMed Central Google ученый

    95. 20

      Rhyner, C. et al. Клонирование аллергенов с помощью фагового дисплея. Методы 32 , 212–218 (2004).

      CAS Статья PubMed Google ученый

    96. 21

      Adey, N.Б. и Кей, Б. К. Идентификация консенсусных последовательностей кальмодулин-связывающего пептида из библиотеки случайных пептидов, отображаемых на фаге. Ген 169 , 133–134 (1996).

      CAS Статья PubMed Google ученый

    97. 22

      He, M. & Taussig, M.J. Отображение эукариотических рибосом с выделением in situ ДНК. Нат. Методы 4 , 281–288 (2007).

      CAS Статья PubMed Google ученый

    98. 23

      Zahnd, C., Amstutz, P. & Plückthun, A. Отображение рибосом: выбор и развитие белков in vitro , которые специфически связываются с мишенью. Нат. Методы 4 , 269–279 (2007).

      CAS Статья PubMed Google ученый

    99. 24

      Ju, W. et al. Протеомная идентификация репертуара природных субстратов каспаз, специфичного для членов семейства. Proc. Natl. Акад. Sci. США 104 , 14294–14299 (2007).

      CAS Статья PubMed Google ученый

    100. 25

      Шен, X. et al. Сканирование протеома человека на кальмодулин-связывающие белки. Proc. Natl. Акад. Sci. США 102 , 5969–5974 (2005).

      CAS Статья PubMed Google ученый

    101. 26

      Шен, X. et al. Са (2 +) / кальмодулин-связывающие белки из протеома C. elegans . Cell Calcium 43 , 444–456 (2008).

      CAS Статья PubMed Google ученый

    102. 27

      Хуанг Б. и Лю Р. Сравнение выборок на основе мРНК-дисплея с использованием библиотек синтетических пептидов и природных белков. Биохимия 46 , 10102–10112 (2007).

      CAS Статья PubMed Google ученый

    103. 28

      Валенсия, К.A., Cotten, S.W., Dong, B. & Liu, R. Выбор белков с желаемыми функциями на основе мРНК-дисплея: тематическое исследование протеазы-субстрата. Biotechnol. Прог. 24 , 561–569 (2008).

      Артикул PubMed Google ученый

    104. 29

      Робертс, Р.У. и Шостак, Дж. В. Слияние РНК-пептид для отбора in vitro пептидов и белков. Proc. Natl. Акад. Sci. США 94 , 12297–12302 (1997).

      CAS Статья PubMed Google ученый

    105. 30

      Лю Р., Баррик Дж. Э., Шостак Дж. У. И Робертс, Р.В. Оптимизированный синтез слитых белков РНК для отбора in vitro белка . Meth. Энзимол. 318 , 268–293 (2000).

      CAS Статья PubMed Google ученый

    106. 31

      Немото, Н., Миямото-Сато, Э., Husimi, Y. & Yanagawa, H. In vitro вирус : связывание мРНК, несущей пуромицин на 3′-конце, с C-концевым концом его кодируемого белка на рибосоме in vitro . FEBS Lett. 414 , 405–408 (1997).

      CAS Статья PubMed Google ученый

    107. 32

      Hammond, P.W., Alpin, J., Rise, C.E., Wright, M. & Kreider, B.L. In vitro отбор и характеристика Bcl-X (L)-связывающих белков из смеси тканеспецифичных библиотек отображения мРНК. J. Biol. Chem. 276 , 20898–20906 (2001).

      CAS Статья PubMed Google ученый

    108. 33

      Cujec, T.P., Medeiros, P.F., Hammond, P., Rise, C. & Kreider, B.L. Отбор последовательностей субстрата тирозинкиназы v-abl из рандомизированных пептидных и клеточных протеомных библиотек с использованием мРНК-дисплея. Chem. Биол. 9 , 253–264 (2002).

      CAS Статья PubMed Google ученый

    109. 34

      Макферсон, М., Янг, Ю., Хаммонд, П.В. И Крейдер, Б. Идентификация рецепторов лекарств из множества тканей с использованием библиотек отображения мРНК клеточного происхождения. Chem. Биол. 9 , 691–698 (2002).

      CAS Статья PubMed Google ученый

    110. 35

      Horisawa, K. et al. In vitro отбор Jun-ассоциированных белков с использованием отображения мРНК. нуклеиновые кислоты. Res. 32 , e169 (2004).

      Артикул PubMed PubMed Central Google ученый

    111. 36

      Фукуда, И.и другие. In vitro эволюция одноцепочечных антител с использованием отображения мРНК. нуклеиновые кислоты. Res. 34 , e127 (2006).

      Артикул PubMed PubMed Central Google ученый

    112. 37

      Джозефсон, К., Хартман, М.С.Т. И Шостак, Дж. Рибосомный синтез неестественных пептидов. J. Am. Chem. Soc. 127 , 11727–11735 (2005).

      CAS Статья PubMed Google ученый

    113. 38

      Силиг, Б.И Шостак, Дж. Выбор и эволюция ферментов из частично рандомизированного некаталитического каркаса. Nature 448 , 828–831 (2007).

      CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

    114. 39

      Wilson, D.S., Keefe, A.D. & Szostak, J.W. Использование отображения мРНК для выбора пептидов, связывающих белок с высоким сродством. Proc. Natl. Акад. Sci. США 98 , 3750–3755 (2001).

      CAS Статья PubMed Google ученый

    115. 40

      Xu, L. et al. Направленная эволюция имитаторов высокоаффинных антител с использованием отображения мРНК. Chem. Биол. 9 , 933–942 (2002).

      CAS Статья PubMed Google ученый

    116. 41

      Olson, C.A., Liao, H., Sun, R. & Roberts, R.W. мРНК демонстрируют селекцию высокоаффинного, специфичного к модификации фосфо-IkappaBalpha-связывающего фибронектина. ACS Chem. Биол. 3 , 480–485 (2008).

      CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

    117. 42

      Liao, H. et al. Дизайн мРНК отображения внутрител на основе фибронектина, которые выявляют и ингибируют нуклеокапсидный белок коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома. J. Biol. Chem. 284 , 17512–17520 (2009).

      CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

    118. 43

      Косуги, С.и другие. Шесть классов сигналов ядерной локализации, специфичных для различных связывающих бороздок импортина альфа. J. Biol. Chem. 284 , 478–485 (2009).

      CAS Статья PubMed Google ученый

    119. 44

      Austin, R.J., Ja, W.W. И Робертс, Р.В. Эволюция класс-специфичных пептидов, нацеленных на горячую точку субъединицы Galphas. J. Mol. Биол. 377 , 1406–1418 (2008).

      CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

    120. 45

      Амбион.Руководство по эксплуатации Retic Lysate IVT. На 〈http://www.ambion.com/catalog/ProdGrp.html?fkApp=11&fkProdGrp=103〉.

    121. 46

      Чо, Г., Киф, А.Д., Лю, Р., Уилсон, Д.С., Шостак, Дж. У. Создание синтетических библиотек высокой сложности из длинных ORF с использованием in vitro отбора . J. Mol. Биол. 297 , 309–319 (2000).

      CAS Статья PubMed Google ученый

    122. 47

      Курц, М., Гу К. и Лозе П.А. Фотосшитые псораленом конъюгаты мРНК-пуромицин: новая матрица для быстрого и легкого получения гибридных мРНК-белков. нуклеиновые кислоты. Res. 28 , e83 (2000).

      CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

    123. 48

      Leemhuis, H., Stein, V., Griffiths, A.D. & Hollfelder, F. Новые связи генотип-фенотип для направленной эволюции функциональных белков. Curr. Opin. Struct. Биол. 15 , 472–478 (2005).

      CAS Статья PubMed Google ученый

    124. 49

      Tabuchi, I. et al. Эффективный метод лигирования при создании вируса in vitro для эволюции белка in vitro . Biol. Интернет-процедуры 4 , 49–54 (2002).

      CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

    125. 50

      Мецкер, М.L. Технологии секвенирования — следующее поколение. Нат. Преподобный Жене. 11 , 31–46 (2010).

      CAS Статья PubMed Google ученый

    126. Границы | Окончательный отбор качественных белковых гибридов попкорна

      Введение

      Попкорн [ Zea mays L. ssp. everta (Sturt.) Zhuk] — сорт кремневой кукурузы, характеризующийся способностью расширяться и образовывать легкие хлопья при сильном нагревании.Попкорн использовался в качестве продукта прямого потребления в Соединенных Штатах уже более века, а в 2013 году индустрия попкорна возродилась после двух десятилетий периода розничной торговли благодаря растущему потребительскому спросу на более здоровые и инновационные закуски. и возросшее разнообразие на рынке попкорна (Smith et al., 2004; Topping, 2011; Mordor Intelligence, 2018). Внутривидовое скрещивание кукурузы вмятин и попкорна, один из путей увеличения разнообразия пула зародышевой плазмы попкорна, показало, что оно улучшает агрономическую пригодность и вкусовой профиль попкорна за счет недостаточных качественных характеристик попкорна, таких как заселенность и объем прироста (Роббинс и Эшман, 1984; Спраг и Дадли, 1988; Дофинг и др., 1991; Зиглер и Эшман, 1994). Чтобы свести на нет эти нежелательные побочные эффекты, в исследовании 2018 года была описана программа межподвидового скрещивания сортов кукурузы с высоким содержанием стекловидного тела Quality Protein Maize dent (QPM) с патентованными линиями попкорна для получения попкорна с высоким содержанием лизина и высоким содержанием белка (QPP) BC 2 F 5 инбредных линий (Ren et al., 2018). Одновременно с быстрым восстановлением свойств попкорна эти уникальные инбредные линии попкорна несли гомозиготную рецессивную мутацию opaque-2 и присвоили 1.5-2-кратное увеличение уровней лизина эндосперма ядра по сравнению с исходными родителями попкорна (Ren et al., 2018). Это исследование подтвердило положительную корреляцию между стекловидностью эндосперма ядра, твердым и полупрозрачным фенотипом эндосперма и характеристиками качества попкорна — ранее опубликованная, но в значительной степени неизученная концепция (Hoseney et al., 1983; Matz, 1984; da Silva et al. др., 1993; Смит и др., 2004; Бабу и др., 2006). Методы, задействованные в этом исследовании, включали фенотипическую оценку стекловидного тела, отбор с помощью генотипических маркеров для аллеля opaque-2 и протеомную оценку посредством экстракции белка эндосперма и SDS-PAGE (Ren et al., 2018). Хотя гены-модификаторы, обеспечивающие стекловидность в линиях-носителях opaque-2 , все еще остаются в значительной степени неизвестными, исследование 2016 года подтвердило, что избыточная экспрессия запасного белка эндосперма кукурузы γ-зеина 27 кДа, известная потребность в восстановлении стекловидности у непрозрачных- 2 , несущих линий, произошло из-за генетической дупликации γ-гена 27 кДа (Liu et al., 2016). Поскольку остальные гены-модификаторы эндосперма не определены (хотя генетическая локализация постулирована), фенотипическая оценка стекловидного тела и профилирование зеина по-прежнему служат лучшими средствами для выбора стекловидного тела и, следовательно, появления признаков на фоне непрозрачности -2 ( Holding et al., 2008; Wu et al., 2010; Холдинг, 2014; Parsons et al., 2020).

      Для дальнейшего развития этой экспериментальной программы внутривидового разведения, 12 BC 2 F 5 инбредов QPP были гибридизированы летом 2018 года с получением 132 линий QPP F 1 . После первоначального наблюдения было отобрано 44 гибрида QPP для дальнейшего предварительного скринингового анализа агрономических, белковых и качественных характеристик попкорна. Летом 2019 года эти 44 гибрида были выращены в нескольких местах, и 14 признаков были оценены для отбора пяти превосходных гибридов BC 2 F 5 QPP-гибридов (Парсонс и др., 2020). Были измерены количественные положительные корреляции между объемом разрастания попкорна, заселенностью и стекловидностью эндосперма, и результаты дополнительно подчеркнули предварительную потребность в родителях с сильно выраженными вмятинами стекловидного тела при успешном скрещивании подвидов попкорна с зубчатой ​​кукурузой (Parsons et al., 2020). Пять выбранных гибридов, производных от QPP BC 2 F 5 , имели относительно лучшие агрономические характеристики, повышенные уровни лизина в зернах и наиболее оптимальные характеристики качества попкорна по сравнению с остальными оцениваемыми гибридами.

      Хотя гибриды QPP были фенотипически неотличимы от исходных линий попкорна и демонстрировали сравнительно превосходные агрономические характеристики и адекватные характеристики попкорна, предыдущие исследования показали, что многократные раунды обратного скрещивания помогают восстановить объем всплывающего роста (Babu et al., 2006). Пять элитных гибридов BC 2 F 5 QPP, выбранных в 2019 году, имели незначительные различия в заселенности (количество неоткрытых ядер / количество протестированных ядер), но немного меньший объем всплывающего расширения по сравнению с исходной зародышевой плазмой попкорна (Parsons et al., 2020). Для проверки потенциального улучшения качественных характеристик попкорна QPP, в частности увеличения объема разрастания, путем обратного скрещивания BC 2 F 5 инбредов QPP снова скрещивали с элитными родительскими линиями попкорна, а непрозрачных-2 несущих фенотипически стекловидное тело BC 3 F 4 линий QPP были произведены осенью 2019 года. Эти BC 3 F 4 инбредов были выборочно скрещены для получения пяти предварительно выбранных гибридов QPP из анализа 2019 BC 2 F 5 крестов.Летом 2020 года эти 10 гибридов QPP, пять BC 2 F 5 и пять BC 3 F 4 производных, а также пять отобранных гибридных сортов попкорна ConAgra Brands ® были выращены для сравнения QPP и ConAgra. Бренды сортов попкорна ® на основе агрономических характеристик, качества попкорна и качества белка. В целом наблюдался компромисс между качеством попкорна и агрономическими характеристиками. Показатели качества белка существенно не различались между популяциями обратного скрещивания QPP и значительно превосходили элитные сорта попкорна ConAgra.В этом исследовании использовалась ранее опубликованная система ранжирования одновременно с экспериментальными данными для выбора линий для крупномасштабных полевых испытаний. Подробное и успешное использование этой системы ранжирования в данном исследовании подчеркивает ее полезность для других программ тестирования гибридов при оценке и выборе основных гибридов, пригодных для коммерциализации. После ранжирования шесть гибридов QPP были отобраны в качестве кандидатов-предшественников для окончательного отбора. В целом, путем включения этого отбора с сенсорным анализом, два лучших гибрида QPP были выбраны в качестве главных кандидатов для потенциальной коммерциализации.

      Материалы и методы

      Растительные материалы

      BC
      2 F 5 Инбредные линии QPP

      BC 2 F 5 инбредных линий QPP были получены с помощью программы разведения QPM путем обратного скрещивания попкорна, как описано в Ren et al. (2018). Вкратце, в 2013 году линии QPM CML154Q, Tx807 и K0326Y были скрещены с фирменными инбредными линиями попкорна ConAgra Brands ® , помеченными P1 – P4 (собственные названия не разглашаются). , K0326Y Кукуруза QPM dent была предоставлена ​​Хансом Геверсом (Gevers and Lake, 1992), а CML154Q и Tx807 были предоставлены Северо-центральной региональной региональной станцией интродукции растений (Ren et al., 2018). Для получения инбредных линий QPP BC 2 F 5 гибриды F 1 были дважды скрещены с родительским попкорном и пять раз самоопылялись, что дало 0,39% теоретической гетерозиготности (Ren et al., 2018).

      BC
      3 F 4 Инбредные линии QPP

      BC 3 линий были получены в результате дополнительного скрещивания женских линий попкорна ConAgra ® с мужскими BC 2 F 5 QPP инбредными линиями летом 2018 года.Эти линии BC 3 F 1 были самоопылены зимой 2018 года, а семена BC 3 F 2 были выделены по аллелю QPM opaque-2 . Гомозиготные рецессивные ядра opaque-2 отбирали с помощью SDS-PAGE и селекции с помощью маркеров (как подробно описано ниже) и затем дважды самоопылялись. BC 3 F 4 семян было произведено летом 2019 года одновременно с анализом гибридов BC 2 F 5 QPP.Если предположить, что теоретический генетический вклад попкорна в вмятину кукурузы составляет 93,75 и 6,25% соответственно, а гомозиготность F 4 составляет 93,75%, то результирующая гетерозиготность у инбредных линий BC 3 F 4 эквивалентна BC 2 F 5 строк под 0,39%. Для сравнения, инбредная линия F 8 обеспечивает такую ​​же гетерозиготность 0,39% (Collard et al., 2005; Uptmoor et al., 2006; Gupta et al., 2010).

      BC
      2 F 5 , BC 3 F 4 и ConAgra ® Бренды F 1 Hybrid Seed

      После летних полевых испытаний 2019 года пять гибридов QPP BC 2 F 5 были отобраны для дальнейшего тестирования: Гибрид 20 (QPP BC 2 F 5 Inbred 6 x QPP BC 2 F 5 Inbred 10), Гибрид 25 (QPP BC 2 F 5 Инбред 9 x QPP BC 2 F 5 Инбред 3), Гибрид 28 (QPP BC 2 F 5 Инбред 9 x QPP BC 2 F 5 инбред 6), гибрид 38 (QPP BC 2 F 5 инбред 10 x QPP BC 2 F 5 инбред 5) и гибрид 43 (QPP BC 2 F 5 Инбред 10 x QPP BC 2 F 5 Инбред 11) (Parsons et al., 2020). Весной 2020 года были получены гибриды BC 2 F 5 и BC 3 F 4 выбранных кроссов и собран урожай семян F 1 . Эти сорта QPP были выращены вместе с пятью контрольными гибридами и сортами ConAgra летом 2020 года. Семена {Popcorn parent 1 x Popcorn parent 2} и его ответные семена были произведены весной 2020 года вместе с гибридами QPP и {родительский Popcorn 1 x Popcorn родительские семена 3} и два контрольных сорта ConAgra были предоставлены ConAgra Brands ® .Всего летом 2020 года было посажено 15 сортов, получивших номера 1–15 в порядке BC 2 F 5 гибридов, BC 3 F 4 гибридов и тестовых сортов ConAgra, соответственно (Таблица 1 ).

      Таблица 1. Описание сортов, испытанных в летних испытаниях 2020 г.

      2020 Проектирование месторождения

      15 выбранных культурных сортов были выращены в трех местах летом 2020 года. Семена были посеяны 30 апреля в Линкольне, Небраска (40 ° 50′11.6 ”с.ш. 96 ° 39′42,4” з.д.), 1 мая в Миде, Небраска (41 ° 08′51,6 ”с.ш. 96 ° 27′04,7” з.д. ”N 101 ° 03′33.0” W DMS) в сотрудничестве с Северо-западным научно-исследовательским центром Канзасского государственного университета. Испытания были спроектированы с использованием обобщенного рандомизированного блочного дизайна (GRBD) с тремя повторениями экспериментальных единиц (EU) на каждое место. EUs были 17 футов (5,18 м) на четырехрядные (10 футов или 3 м) участки, засаженные примерно 34 500 растений / акр (8,53 растений / м 2 ), и каждый участок был разделен со всех сторон от шести до восьми рядов вмятин. граничащая кукуруза для предотвращения перекрестного опыления попкорна (использованные семена попкорна были перекрестно несовместимы с пыльцой граничащей с вмятиной кукурузы).Средние два ряда EUs были собраны машинным способом, а случайные початки четвертого ряда были собраны вручную для анализа.

      Экстракция зеина и других белков и профилирование SDS-PAGE

      F 1 гибридных семян из полевых испытаний 2020 г. для всех экспериментальных скрещиваний подвергали анализу белков зеина и не-зеина, как описано ранее (Wallace et al., 1990; Ren et al., 2018; Parsons et al., 2020 ). Гибридные семена QPP F 1 и F 2 , полученные из BC 2 F 5 и BC 3 F 4 инбредных линий были протестированы для проверки протеома с QPM-паттерном 27-кДа-зеина с высоким содержанием 27 кДа. и низкие α-зеины.Конкретные процедуры, используемые как для анализа на зеин, так и не на зеин, описаны в Parsons et al. (2020). Вкратце, равные количества необработанной зерновой муки вводили в буфер для экстракции бората и экстрагировали белковый супернатант. Фракции зеина и не-зеина разделяли, добавляя 70% этанол и инкубируя в течение ночи. Фракции растворимого зеина и нерастворимого не зеина из идентичных количеств муки были отделены, и белки были профилированы с использованием акриламидного SDS-PAGE (Wallace et al., 1990).

      Проверка генотипа

      o2o2 у инбредов QPP

      QPP BC 2 F 5 и BC 3 F 4 инбредных линий, используемых для гибридов, инбредов 3, 5, 6, 9, 10 и 11, были генотипированы для o2o2 валидации с использованием opaque- 2 in-генный маркер umc1066 и фланкирующий маркер bnlg1200 (Babu et al., 2005; Ren et al., 2018; Parsons et al., 2020). Инбреды 3, 9, 10 и 11 были генотипированы по bnlg1200, в то время как инбреды 5 и 6 были генотипированы по внутригенному маркеру umc1066.Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили согласно Ren et al. (2018), за исключением использования ДНК-полимеразы TaKaRa Ex Taq. Температура отжига для umc1066 варьировалась от 60 до 63 ° C и поддерживалась примерно на уровне 55 ° C для bnlg1200. Для ДНК собирали ткань листьев двухнедельного возраста и экстрагировали ДНК в соответствии с ранее опубликованной процедурой (Holding et al., 2008). Сырую ДНК разводили в 20 раз бидистиллированной или автоклавированной водой до средней концентрации 50 нг / мкл.

      Анализ характеристик

      сорта были собраны с помощью двухрядного зерноуборочного комбайна Kincaid XP-8, способного определять тестовую массу (фунты / бушель), вес делянки (фунты) и содержание влаги.Оценки урожайности были определены уравнениями 1 и 2, и фунты сухого вещества на бушель были измерены для сравнения размера ядра, как показано в уравнении. 3.

      Y⁢i⁢e⁢l⁢d⁢ (p⁢o⁢u⁢n⁢d⁢s⁢o⁢f⁢d⁢r⁢y⁢m⁢a⁢t⁢t⁢e⁢rf⁢e⁢e⁢t2 ) = P⁢l⁢o⁢t⁢w⁢e⁢i⁢g⁢h⁢t⁢ (p⁢o⁢u⁢n⁢d⁢s) * (1-m⁢o⁢i⁢s⁢t⁢u ⁢R⁢e⁢p⁢e⁢r⁢c⁢e⁢n⁢t⁢a⁢g⁢e) 85⁢f⁢e⁢e⁢t2 (1)

      I⁢e⁢l⁢d (56⁢l⁢b⁢b⁢u⁢s⁢h⁢e⁢l⁢a⁢t⁢ 15.5% ⁢m⁢o⁢i⁢s⁢t⁢u⁢r⁢ ea⁢c⁢r⁢e) = (P⁢l⁢o⁢t⁢w⁢e⁢i⁢g⁢h⁢t⁢ (p⁢o⁢u⁢n⁢d⁢s) * (1- {m⁢ o⁢i⁢s⁢t⁢u⁢r⁢e⁢p⁢e⁢r⁢c⁢e⁢n⁢t⁢a⁢g⁢e-.155} *. 012) 56) * 512,5 (2)

      p⁢o⁢u⁢n⁢d⁢s⁢o⁢f⁢d⁢r⁢y⁢m⁢a⁢t⁢t⁢e⁢rv⁢o⁢l⁢u⁢m⁢e⁢t⁢r⁢i⁢ c⁢b⁢u⁢s⁢h⁢e⁢l = T⁢e⁢s⁢t⁢w⁢e⁢i⁢g⁢h⁢t⁢ (p⁢o⁢u⁢n⁢d⁢sv⁢o⁢l .b⁢u⁢s⁢h⁢e⁢l) * (1-m⁢o⁢i⁢s⁢t⁢u⁢r⁢e⁢p⁢e⁢r⁢c⁢e⁢n⁢t⁢a⁢g⁢ д) (3)

      Уравнение 1 оценило количество сухого вещества, накопленного в каждом ЕС, в то время как уравнение. 2 оценивали урожайность участков на основе бушеля влажности зерна 15,5% (стандартное значение влажности бушеля сухой кукурузы). В уравнение было включено значение усадки 1,2% из-за ожидаемой потери воды (Hicks and Cloud, 1991). Коэффициент «512,5» означает кратное увеличение квадратных футов, необходимых для акров. Уравнение 3 помогло оценить размер ядра.Тестовый вес был механически измерен комбайном для делянок, и было определено и возвращено среднее значение в фунтах. Оценка урожайности уравнения. 1 использовался в рейтинговой системе 2020 года (подробно описано ниже). Конечные значения из уравнений 1–3, обсуждаемых ниже, были преобразованы в метрические единицы.

      Примерно два фунта (~ 1000 г) суб-образцов были получены из двух центральных рядов каждого EU для измерения стекловидности, объема расширения, заселенности и морфологии чешуек. Стекловидность ядра оценивали по шкале от 1 до 7, как описано ранее (Parsons et al., 2020). Пять ушей были случайным образом собраны вручную из четвертого ряда каждого EU для измерения одной средней длины уха на EU и аминокислотного профилирования протеома эндосперма. Три измерения высоты растений были записаны и усреднены для одного измерения высоты на ЕС. Примерно 250 г семян машинного сбора из каждого ЕС (всего 135 образцов) были помещены в комнату для кондиционирования с влажностью 14% на 6 недель для уравновешивания влажности перед тестами на качество лопания. После уравновешивания отбирали образцы 250 г и измеряли объем расширения (кубические сантиметры на грамм), заполняемость (количество неоткрытых ядер / общее количество ядер, подвергшихся выталкиванию, выраженное в процентах) и оценки индекса размера хлопьев (FSI). .FSI был оценен с использованием уравнения. 4:

      OCFSI = (OE * 250) / (((K⁢C10) * Charge) -UPK)) (4)

      Oil Crude FSI (OCFSI) представляет собой оценку среднего расширения чешуек отдельного ядра в условиях выталкивания нефти. « OE » — это объем расширения, измеренный в градуированном цилиндре (0–50 мл), объем расширения на грамм в кубических сантиметрах. Значение « KC » — это количество ядер в случайной выборке из 10 г (вес подсчитанных образцов может быть изменен, и знаменатель соответственно изменен). Заряд — это масса пробы, загруженная в масляный поппер (250 г), а UPK — это общее количество неоткрытых ядер в пробе 250 г. Путем умножения общего расширения (OE) на вес образца и деления продукта на предполагаемое количество вытянутого ядра, FSI служил индивидуальной мерой расширения вытянутого ядра. Измерение объема расширения пробы, заполняемости и оценок OCFSI было выполнено с использованием тестового масляного насоса ConAgra Brands (Cretors 120V, 60 Гц, 2300 Вт, Cretors & Co, Чикаго, Иллинойс, США) и объектов в Брукстоне, штат Индиана.Было установлено категориальное наблюдение морфологии чешуек как грибной, бабочки или смешанной.

      Профили свободных и связанных с белками аминокислот всех протестированных сортов

      были проанализированы в Университете Миссури в соответствии с ранее опубликованными процедурами (Angelovici et al., 2013; Yobi and Angelovici, 2018). Были проанализированы шесть образцов от каждого сорта: три в виде порошка сырых ядер и три в форме хлопьевидных хлопьев. Образцы сырой муки и хлопьев, взбитых воздухом, были приготовлены в соответствии с ранее описанными процедурами (Parsons et al., 2020). Вкратце, хлопья выскакивающих образцов замораживали в жидком азоте, а затем измельчали ​​с помощью ступки и пестика до получения мелкого порошка. Свободные и связанные с белком аминокислоты из муки из зерен B73 также измеряли для сравнения.

      Статистический анализ

      Оценки признаков сорта были проанализированы с помощью статистической модели, представленной уравнением. 5:

      yi⁢j⁢k = μ + βi + τj + (β⁢τi⁢j) + εi⁢j⁢k (5)

      , в котором y ijk — это реакция сорта, μ — общее среднее значение, β i — блок или локальный эффект, τ j — обработка или сорт, эффект, (βτ ij ) — это местоположение лечебного взаимодействия, а ε ijk — экспериментальная ошибка (Addelman, 1969).Суммы квадратов типа II использовались для расчета дисперсионного анализа, и эффект лечения был фиксированным. Центральная предельная теорема была принята для нормальности данных. Программное обеспечение R использовалось для проведения всех анализов, включая корреляции признаков и достоверные существенные различия Тьюки (R Core Team, 2018). Пакет R «ggfortify» использовался для анализа PCA всех связанных с белками аминокислотных значений посредством разложения по сингулярным числам и функции «prcomp» (Tang et al., 2016).

      Выбор индекса сорта

      : Система рейтинга 2020

      Как показано в формуле.6, система ранжирования 2020 года, описанная в предыдущем исследовании, была использована для ранжирования 15 протестированных сортов (Parsons et al., 2020):

      Xh = ∑i = 1m (yi, hyi, m⁢a⁢x-1) 2⁢Ii⁢ (σi, h / σi, m⁢a⁢x) (6)

      Окончательный ранг каждого сорта, X_h , был определен путем суммирования индивидуально определенных значений признака, рассчитанных по характеристикам признака относительно тестируемой популяции, (yi, hyi, m⁢a⁢x-1) 2, экономическое значение признака. важность, I_i , и относительная однородность значений признаков сорта по сравнению с другими протестированными линиями (σ i , h / σ i , max ).Экономические веса ( I_i ) определялись по возрастающей непрерывной шкале от 0 до 1 параллельно с заботой потребителей и производителей о характеристиках. Масса была определена как «0,90», «0,90», «0,90», «0,85», «0,80» и «0,55» соответственно для содержания связанного с белком лизина (г / 100 г) и признаков «Урожайность». «Объем расширения», «OCFSI», «Заполняемость» и «Стекловидность». Высота растения, количество колосьев на растении, длина колоса и морфология чешуек учитывались одновременно с результатами системы ранжирования для окончательного выбора лучших гибридов QPP.

      Результаты

      Селекция и селекция BC

      3 F 4 QPP инбредные и гибридные сорта

      Стекловидное тело BC 3 F 4 Инбредные линии QPP были получены фенотипическим и генотипическим отбором по поколениям стекловидного тела и аллеля opaque-2 соответственно (рисунок 1 и дополнительный рисунок 1). Гомозиготный o2o2 BC 3 F 2 сеянцев были отобраны весной 2019 г. и самоопылялись до поколения BC 3 F 4 . o2-, индуцированное подавление экспрессии зеина и не-зеиновое усиление в BC 3 F 4 инбредных семян проверяли экстракцией белка и SDS-PAGE, а гомозиготную аллельную интрогрессию opaque-2 проверяли с помощью селекции с помощью маркеров (не показано). Поскольку BC 3 F 4 инбредных линий были получены путем обратного скрещивания BC 2 F 5 QPP с исходными родителями попкорна, улучшение стекловидности сортов BC 3 по сравнению с их аналогом BC 2 было невозможно. (Дополнительный рисунок 1).Примечательно, что QPP Inbred 3 различалась по цвету эндосперма между линиями BC 2 F 5 и BC 3 F 4 , а QPP BC 3 F 4 Inbred 3 приобрела непрозрачность колпачка. Все другие инбредные линии QPP сохраняли тот же наблюдаемый уровень стекловидности между поколениями обратного скрещивания (дополнительный рисунок 1). Оценки по уравнению 3 на основе испытательного веса и содержания влаги показали уменьшение размера семян у гибридов QPP, производных от BC 3 F 4 , по сравнению с гибридами BC 2 F 5 , а исходные родительские гибриды попкорна имели семена значительно меньшего размера, чем оба Популяции QPP.

      Рис. 1. Схема разведения для получения гибридов BC 2 F 5 и BC 3 F 4 QPP F 1 . Общая схема разведения с 2018 по 2020 год. (A) Летом 2018 года инбреды BC 2 F 5 QPP были скрещены в полном диаллеле с получением гибридов F 1 . BC 2 F 5 инбредов также были селективно скрещены с соответствующими исходными родителями попкорна с получением гетерозиготного потомства O 2 o 2 BC 3 F 1 потомков. (B) Гетерозиготы самоопылялись с получением сегрегационного потомства BC 3 F 2 , которое было отобрано из семян на основе фенотипирования стекловидности opaque-2 , профилирования белков и более позднего отбора с помощью маркеров. (C) Гомозиготные семена F 2 были выращены и самоопылены до лета 2019 года. (D) Гомозиготный мутант o 2 o 2 BC 3 F 3 семян были собраны и выращены для получения семян BC 3 F 4 QPP летом 2019 года.Все инбредные линии были идентифицированы как o2-, несущие преимущественно белковые профили. (E) BC 2 F 5 и BC 3 F 4 Инбредные линии QPP были выращены весной 2020 г. и селективно скрещены для получения аналогичных гибридов QPP разных поколений обратного скрещивания. (F) BC 2 F 5 — и BC 3 F 4 — производные гибриды F 1 были выращены в трех местах и ​​оценены вместе с элитными сортами ConAgra для отбора.

      Фенотипическая и количественная оценка

      opaque-2 Инициированное протеомное ребалансирование в качественных белковых гибридах попкорна

      Произвольный набор ядер F 2 из исходных родительских скрещиваний попкорна, скрещиваний QPP BC 2 F 5 и QPP BC 3 F 4 скрещиваний был получен для экстракции зеина и не-зеинового белка и свободных и профили аминокислот, связанных с белками (рис. 2). Первые два компонента в основном компонентном анализе профилей связанных с белками аминокислот составили 95.47% вариации и четко отделенные гибриды ConAgra от гибридов QPP (рис. 2А). Общее увеличение лизина, аргинина и аспартата / аспарагина в гибридах QPP заметно дифференцировало их кластер от лейцина, глицина и гибридов ConAgra, богатых глутаматом / глутамином, h22, h23, и h24 и B73. Согласно номенклатуре в Таблице 1, производный от BC 2 «h3» демонстрирует уникальный профиль связанных с белком аминокислот по сравнению с остальными гибридами QPP, как показано путем разделения с двумя гибридами ConAgra, h21 и h25 (за пределами как красные, так и синие кластеры) (рис. 2А).В соответствии с этими результатами профилирования, h3 имел наименьшее количество связанного с белком лизина по сравнению со всеми гибридами QPP (рис. 2B). В среднем гибриды ConAgra давали 0,189 ± 0,02 г / 100 г связанного с белком лизина, в то время как гибриды QPP демонстрировали относительное увеличение в 1,7 раза связанного с белком лизина и в среднем составляли значительно более высокое значение — 0,320 ± 0,04 г / 100 г. (Дополнительные таблицы 2–6). В соответствии с этими результатами, SDS-PAGE экстрагированных белков зеина из трех случайно выбранных гибридов ConAgra, BC 2 F 5 — и BC 3 F 4 — производных гибридов QPP, продемонстрировали ожидаемые профили (рис. 2C).Линии ConAgra демонстрировали профиль зеина дикого типа для обильного 22-кДа-зеина, относительно подавленного 27-кДа-гамма-зеина и вариабельного 19-кДа-зеина (рис. 2С). Все шесть гибридов QPP имели α-зеин массой 22 кДа, как указано в opaque-2 , вариабельность α-зеина 19 кДа и высокий уровень γ-зеина 27 кДа, возникающий в результате дупликации, которая отвечает за улучшение стекловидности (рис. 2С). ). Интересно, что h2 и h5 показали видимое увеличение содержания α-зеина массой 19 кДа, которое не наблюдалось в аналогах BC 3 H6 и H9, соответственно.

      Рисунок 2. Профилирование белков элитных линий QPP и ConAgra. (A) Анализ основных компонентов (PCA) белок-связанных аминокислот в сырой муке элитных линий ConAgra, B73 для справки и гибридов QPP выявил четкую сегрегацию между QPP и исходными сортами, полученными из попкорна. B73 сгруппирован с линиями ConAgra h22, h23 и h24, тогда как h21 и h25 независимо сегрегированы с QPP h3. QPP h3 имел отличный протеом по сравнению со всеми другими гибридами QPP и аналогичные уровни лизина по сравнению с линиями ConAgra. (B) Связанный с белком лизин в сырой муке всех генотипов выявил значительно более высокие уровни лизина во всех линиях QPP, кроме h3. (C) Экстракция зеина и анализ SDS-PAGE случайно выбранных ядер выявили значительное снижение содержания альфа-зеина 22 кДа, различную продукцию альфа-зеина 19 кДа и повышенную экспрессию γ-зеина 27 кДа в Линии QPP по сравнению с линиями ConAgra соответствуют гомозиготному профилю opaque-2 . В совокупности эти результаты подтвердили успешную интрогрессию и стабилизацию гомозиготной мутации в популяциях BC 2 F 5 и BC 3 F 4 QPP.

      Различие в агрономических характеристиках между QPP BC

      2 F 5 , BC 3 F 4 и родительскими гибридами попкорна

      Ур. 2 была предложена оценка урожайности в бушелях на акр при влажности 15,5%, общая единица для оценки урожайности кукурузы, и значения были преобразованы в килограммы / квадратные метры. ConAgra Commercial Line 2 (h25) выращивали как высокоурожайную мишень со средними признаками взрыва, в то время как ConAgra Commercial Line 1 (h24) выращивали и оценивали по своим превосходным характеристикам взрыва и средней урожайности (Таблица 1).h25 показал максимальный средний урожай 0,563 кг / м3 2 (89,53 бушелей / акр), в то время как h24 дал 0,428 кг / м 2 (68,07 бушелей / акр; Таблица 2). В среднем урожайность гибридов QPP, полученных из BC 2 , существенно не отличалась от линий ConAgra с урожайностью ∼0,390 кг / м 2 (62 бушелей / акр) и ∼0,421 кг / м 2 (67 бушелей / акр). соответственно (таблица 2). Гибриды, производные от BC 3 , давали в среднем 0,333 кг / м 2 2 (53 бушелей / акр), что значительно ниже, чем у двух других групп.В частности, сравнивая h25 со всеми гибридами QPP и ConAgra, только QPP H5 не имеет существенно различающихся показателей урожайности. Напротив, все гибриды QPP, кроме H6, H7 и H8, давали сопоставимые урожаи с h24.

      Таблица 2. Выборочные измерения признаков сортов, испытанных в летних испытаниях 2020 г.

      Урожайность всех гибридов QPP существенно не различалась по сравнению с их соответствующими родительскими родословными попкорна, за исключением h3 и H7, двух гибридов, происходящих от одной и той же родословной попкорна, эквивалентной h23 (таблицы 1, 2).

      Высота растения, длина колоса и количество колосьев на растении были измерены до уборки комбайном, но были обнаружены низкие, незначительные корреляции между признаками, измеренными вручную, и оценками урожайности (корреляции не показаны; дополнительная таблица 1). Поэтому признаки, измеренные вручную, не учитывались в общем рейтинге гибридов с использованием системы рейтинга 2020 года.

      Оценка признака качества поппинга между гибридами ConAgra Elite и различными гибридами, полученными методом обратного скрещивания QPP

      Объем расширения, OCFSI (Oil-popped Crude FSI, показатель среднего размера хлопьев) и измерения заселенности показали преимущество сорта ConAgra по сравнению со всеми гибридами QPP (Таблица 2).Процент влажности зерна определялся перед взбиванием каждого образца и не оказывал значительного влияния на EV. Хотя эффект местоположения был значительным (α0,05), при анализе данных через группы обратного скрещивания визуально не было выявлено никаких взаимодействий. Местоположение Mead привело к более высокому проценту повреждения зерна / плесени, и процент плесени был отмечен для каждого ЕС. h3 испытывал 50% -ное повреждение плесенью на образец, в то время как все другие гибриды QPP и ConAgra не имели значительно различающихся уровней повреждения.После появления гибриды ConAgra имели в среднем EV 35,38 ± 5,29 кубических сантиметров / грамм, производные от BC 2 гибриды QPP в среднем составляли 22,8 ± 4,6 кубических сантиметра / грамм, а гибриды, производные от BC 3 , составляли в среднем 25,28 ± 4,63 кубических сантиметра / грамм. грамм, демонстрируя значительные различия между всеми группами и значительное улучшение EV после третьего обратного скрещивания QPP (Таблица 2). При сравнении гибридов QPP с коммерческими линиями h24 и h25, H9 существенно не отличался по показателю EV по сравнению с h25.

      С точки зрения популяции (процент всплывающих ядер), H9 не показал значительных различий по сравнению с h21 (его соответствующий гибрид ConAgra по родословной) и h25. H6 и H8 также не показали значительно отличающихся значений всплываемости по сравнению с их гибридами, родственными ConAgra (h22 и h21, соответственно) и h25. Разделение гибридов на группы обратного скрещивания и контроль ConAgra ® выявило значительные различия между всеми тремя группами (таблица 2). Гибриды, производные от QPP BC 2 , показали самый низкий процент заселенности — 96%, в то время как гибриды, производные от BC 3 и ConAgra ® , были немного выше со средним показателем 97.1 и 98,4% соответственно (табл. 2).

      Значения FSI

      Oil Crude показали незначительные различия между поколениями обратного скрещивания, но гибриды ConAgra действительно имели значительно более высокий FSI по сравнению с гибридами QPP (Таблица 2). Все средние значения OCFSI варьировались от 2,56 до 5,52, при этом h3 имел самое низкое значение, а h24 — самое высокое (Таблица 2).

      Обзор этих выдающихся значений признаков выявил тенденции между гибридами QPP, группами обратного скрещивания и гибридами, соответствующими ConAgra. h3 и H5 имели самые низкие значения EV и OCFSI из всех гибридов QPP, за ними следовали их BC 3 -аналоги H7 и h20.Все четыре из этих гибридов стабильно имели самые низкие средние значения по всем трем признакам по сравнению со всеми другими протестированными гибридами, хотя гибриды BC 3 действительно имели значительно более высокие значения популяции по сравнению с соответствующими сортами BC 2 . Эти четыре гибрида QPP были также получены из той же родословной ConAgra PP1 x PP3 (h23), которая не имела, соответственно, более низких значений признака качества поппинга по сравнению с другими сортами ConAgra (Таблица 2).

      Гибриды попкорна с качественным белком, которые показали более высокие показатели качества хлопка, чем в среднем, были h2, H6 и H9 (Таблица 2).У этих трех гибридов были самые высокие измерения EV, у H6 и H9 был самый высокий процент заселенности, а у трио были самые высокие измерения OCFSI, сопровождаемые h5 (Таблица 2). h22, соответствующий гибрид ConAgra для h2 и H6, показал самый низкий OCFSI, самую низкую популяцию и второй по величине EV по сравнению с другими гибридами ConAgra.

      Оценка морфологии хлопьев испытанных гибридов

      Сразу после появления хлопья оценивали, и каждый EU был разделен на морфологию бабочки, гриба или смешанную морфологию (синий, красный и белый, соответственно; рис. 3).Гибриды QPP, полученные из соответствующих фонов, но при разных обратных скрещиваниях, показали в основном сходные морфологические паттерны чешуек (рис. 3). Все гибриды, производные от ConAgra (h21 – h23) и h24, неизменно имели одинаковую морфологию «бабочка». h2 и H6 в основном имели «смешанную» морфологию с одним отличием «бабочка». h3 и H7 оба имели большую часть морфологии чешуек бабочки. h4, H7 и H9 показали наиболее однородную морфологию бабочки, за которой следует H8. h5, H5 и h20 имели различную морфологию чешуек.На h5 и h20 было большинство смешанных хлопьев, а на H5 — большая «бабочка». Все три из этих гибридов QPP имели по крайней мере одно отчетливое «грибное» назначение. h25 была единственной линией ConAgra, которая имела назначение, отличное от «бабочки», в котором три EU были отнесены к категории «смешанной» морфологии (рис. 3).

      Рис. 3. Оценка морфологии чешуек элитных линий QPP и ConAgra. Случайным образцам линий QPP и ConAgra с каждого экспериментального участка давали описание морфологии бабочки (B — синий), гриб (M — красный) или смешанной морфологии чешуек (MX — белый).Каждому сорту было присвоено в общей сложности девять описаний (по три от каждого из трех мест). Всем разновидностям ConAgra была присвоена морфология бабочки, за исключением h25, которому были присвоены три морфологии MX. Гибриды, производные от QPP BC 2 , отображаются в первой строке, соответствующие гибриды, производные от QPP BC 3 , находятся во второй строке, а исходные гибриды попкорна из соответствующих родословных расположены в третьей строке, чтобы позволить сравнение столбцов между аналогичными Родословные QPP и ConAgra.Коммерческие строки h24 и h25 расположены на четвертом ряду.

      Свободный и связанный с белком лизин в QPP по сравнению с родительскими гибридами попкорна в сырой и воздушно-воздушной формах

      Как указывалось ранее, гибриды QPP показали 1,7-кратное увеличение связанного с белком лизина по сравнению с гибридами ConAgra в форме сырой муки (дополнительные таблицы 2–6). После вспенивания уровни связанного с белком лизина в хлопьях были в 1,84 раза выше у гибридов QPP по сравнению с гибридами ConAgra с 0,24 ± 0,04 г / 100 г и 0.13 значений ± 0,01 г / 100 г соответственно (дополнительные таблицы 2–6). Значения лизина между BC 2 и BC 3 обратных скрещенных популяций QPP не различались значимо как для связанного с белком, так и для свободного лизина как в наземной, так и в воздушно-полученной формах (α0,05). Воздушное всплывание снижало уровни связанного с белком лизина на ~ 30,3% у всех гибридов со значительным коэффициентом корреляции Пирсона 0,872 (α0,05). Однако h5 показал незначительные изменения в содержании связанного с белком лизина до и после взрыва, вероятно, из-за ошибки подготовки образца.Исключение данных h5 из корреляционного теста показало значимый коэффициент корреляции Пирсона 0,948 (α0,05) между уровнями связанного с белком лизина сырой муки и уровня связанного с белком лизина, содержащегося в воздухе. Более того, несмотря на 30% -ное снижение лизина, гибриды QPP, выращенные воздухом, по-прежнему имели более высокие уровни связанного с белком лизина, чем линии ConAgra в форме сырой муки (дополнительные таблицы 2–6).

      Обнаружена незначительная разница в восстановлении после появления между гибридами ConAgra и QPP как связанного с белком, так и свободного лизина.Уровни свободного лизина снизились после выращивания примерно на 20% у всех сортов, хотя значения коррелировали с коэффициентом Пирсона 0,746 (дополнительные таблицы 7–10). Уровни свободного лизина были минимальными по сравнению с уровнями связанного с белком, в среднем 0,0014 ± 0,0003 г / 100 г лизина у гибридов ConAgra и 0,0071 ± 0,003 г / 100 г у гибридов QPP в форме сырой муки (дополнительный рисунок 2). Эти средние значения показывают, что гибриды QPP дают 4,95-кратное относительное увеличение уровней свободного лизина в сырой муке и 5.Относительное увеличение количества свободного лизина, остающегося после вспенивания, в 44 раза, в среднем 0,00519 и 0,00095 г / 100 г у гибридов QPP и ConAgra, соответственно. Хотя это большое кратное увеличение свободного лизина было значительным, свободный лизин в образцах, взятых из воздуха, составлял только ∼2 и ∼0,7% от общего лизина в хлопьях, образованных гибридом QPP и ConAgra, соответственно (дополнительные таблицы 7–10).

      Конкретно сравнивая уровни лизина между коммерческими линиями ConAgra h24 и h25 и гибридами QPP, QPP h2, h5, H5, H6, H9 и h20 все имели значительно более высокие уровни связанного с белком лизина в сырой форме, чем h24 и h2, H5, и H6 содержал значительно более высокие уровни, чем h25 (Рисунок 2B и дополнительные таблицы 7-10).В готовой форме все гибриды QPP, за исключением h3, показали значительно более высокие уровни связанного с белком лизина, чем h24 и h25, что указывает на значительно более высокое потребление лизина в пригодной для употребления форме. В целом, гибриды QPP показали более высокий уровень лизина в измельченных зернах и хлопьях по сравнению с коммерчески доступными сортами попкорна ConAgra.

      Система рейтинга 2020: оценка и ранжирование гибридов

      Экономические веса «0,90», «0,90», «0,90», «0,85», «0,80» и «0.55 ”соответственно, для содержания связанного с белком лизина (г / 100 г), выхода (уравнение 1), EV, OCFSI, популяции и стекловидности были использованы в рейтинговой системе 2020 (таблица 3, рисунок 4 и дополнительная таблица). 11). У h23 был лучший, самый низкий рейтинг из-за его измерений выше среднего по всем признакам, за исключением содержания связанного с белком лизина. h25 занял второе место из-за относительно более низкого EV по сравнению с другими гибридами ConAgra. h21 занимает третье место отчасти из-за более низкой урожайности, а h22 занимает очень низкое место из-за урожайности ниже среднего и особенностей появления.QPP BC 3 Гибрид h20, производный от , занял четвертое место в общем рейтинге, несмотря на его плохие характеристики, за ним следуют h24, h4, h5, h2, H6 и H9. H5 занял второе место из-за очень плохих характеристик всплывающего урожая, а h3 оказался последним из-за низкой урожайности, характеристик всплываемости и относительно более низкого содержания лизина (Рисунок 4). В целом, большинство гибридов ConAgra ® имеют более высокий рейтинг, чем большинство сортов QPP; однако h20, h4, h5 и h2 показали близкие ранговые значения по сравнению с коммерческими гибридами h25 и h24 (рис. 4).

      Таблица 3. Экономические значения, присвоенные признакам в рейтинговой системе 2020.

      Рисунок 4. Результаты индекса выбора системы ранжирования 2020. Использование системы рейтинга 2020 года позволило визуально отобразить общий рейтинг сорта от лучшего к худшему, слева направо, соответственно. Цвет по переменной определяет индивидуальные ловушки гибридов (чем длиннее столбец в столбце, тем дальше от лучшего гибрида) и высокие значения признаков. h23, PP1 x PP3, занял самое высокое место среди всех гибридов, имея относительно низкую оценку только из-за отсутствия в нем содержания связанного с белком лизина.QPP h20 занял лучшее место по сравнению со всеми другими линиями QPP и оказался выше, чем h24 или коммерческая линия 1. QPP BC 2 производные от гибриды h4, h5 и h2 оказались соответственно выше остальных, а BC 3 -производные гибриды H6, H9 и H7 имеют более высокий рейтинг, чем исходная гибридная линия попкорна h22. H8, H5 и h3 заняли самое низкое место среди всех гибридов. Экономические веса для каждого признака были определены, чтобы отразить интересы потребителей и производителей в готовом к употреблению продукте из качественного белкового попкорна.Уровни лизина, урожайность и объем роста считались одинаково важными признаками при ранжировании всех гибридов.

      Обсуждение

      QPP Разведение и селекция обратного скрещивания

      Производство BC 2 F 5 QPP инбредных линий с высокостекловидным эндоспермом, высоким содержанием лизина и восстановленными характеристиками попкорна открыло широкие возможности для успешного производства гибридов попкорна с использованием зародышевой плазмы зубчатой ​​кукурузы. Однако из-за временной потери способности поппинга на ранних стадиях размножения QPP и восстановления на заключительном этапе такие признаки выталкивания, как объем расширения, популяция и OCFSI, не были выбраны для во время инбредного производства и окончательного определения элитных инбредов QPP ( Ren et al., 2018). Более того, предварительный тест на выталкивание отобранных инбредов выявил общий сниженный объем разрастания с изменчивостью. После начальной гибридизации инбредных линий и отбора производных от 44 BC 2 F 5 гибридов QPP были проанализированы признаки поппинга, которые оказались значительно, умеренно ниже, чем у исходных родительских линий попкорна (Parsons et al., 2020).

      Предыдущие исследования постулировали, что массовая экспансия, главный качественный признак попкорна, является преимущественно наследуемым аддитивным признаком, регулируемым тремя-пятью основными генами (Dofing et al., 1991; Перейра и Амарал Джуниор, 2001; Зиглер, 2001; Ли и др., 2003; Coan et al., 2019). Недавнее исследование скрещивания, направленное на изучение способа наследования объема разрастания, показало, что одно обратное скрещивание с исходной родительской линией попкорна восстановило 75% всплывающего расширения исходной родительской линии, а скрещивание BC 2 не производилось и не тестировалось (Coan и др., 2019). Действительно, предыдущие исследования, ориентированные на наследование, согласны с тем, что одного обратного скрещивания достаточно для восстановления большей части способности выталкивания, пригодной для генетических исследований, но недостаточно для достижения измерений синонимичных признаков выталкивания по отношению к исходному родителю (Li et al., 2003, 2007, 2008). Начиная с 1949 года, Crumbacker et al. предположил, что двух поколений обратного скрещивания с исходным родителем попкорна было достаточно для восстановления объема всплывающего расширения после вмятины в результате скрещивания попкорна, и ограничено, но недавние исследования подтвердили этот подход (Crumbaker et al., 1949; Li et al., 2004; Niu и др., 2008).

      Хотя теоретическое восстановление генома рецидивирующего родителя при скрещивании BC 2 составляет 0,875 и 0,9375 для обратного скрещивания BC 3 , эти пропорции не учитывают меры геномной или фенотипической селекции, используемые в программе разведения (Collard et al., 2005; Uptmoor et al., 2006; Сильва и др., 2007; Гупта и др., 2010; Ramos et al., 2011). Одно исследование, преобразовывающее две линии не-QPM вмятины в QPM, показало, что выбранные линии BC 2 восстановили в среднем 0,901–0,972 рекуррентного родительского генома, а поколение BC 3 восстановило 0,971–0,996 с использованием отбора переднего плана (Thakur et al. др., 2014). В этой селекционной программе использовались два родителя кукурузы вмятин, а не родительский рецидивирующий и вмятинный донор кукурузы, и были выбраны только аллель непрозрачного-2 QPM и необходимые модификаторы.Принимая во внимание цель текущего исследования по отбору основанных на QPM генов аминокислот и модификаторов эндосперма, а также фенотипических признаков на основе попкорна, таких как размер семян, морфология ядра и признаки лопания — все из которых имеют неопределенное генетическое расположение — генетический вклад обоих родителей в инбредные линии QPP BC 2 F 5 не могут быть предсказаны как теоретически распределенные и не обязательно благоприятствующие рекуррентному родителю в такой степени, как было обнаружено в предыдущем исследовании QPM-конверсии.Более того, без знания местоположения необходимых локусов как от рекуррентных, так и от донорных родителей, секвенирование нескольких доступных линий QPP обеспечило бы пропорции генетического вклада, но мало что помогло бы в идентификации основных инбредных или поппинговых локусов или локусов количественных признаков QPM из-за ограниченное количество доступных линий. Следовательно, поскольку предыдущие исследования приписывали улучшение черт попкорна за счет скрещивания попкорна методам разведения, основанным на обратном скрещивании, теоретический генетический вклад рецидивирующего родителя может быть увеличен на 6.25% путем дополнительного обратного скрещивания, BC 2 F 5 QPP инбредных линий были скрещены с исходными родителями попкорна, самоопылялись и отобраны в поколение F 4 . Учитывая, что доступность для гетерозиготности в исходном скрещивании BC 3 составляла всего ∼0,0625, три поколения самоопыления и отбора сделали доступность для гетерозиготности в линиях BC 3 F 4 на уровне 0,39%, что эквивалентно поколение F 8 без обратного скрещивания (Semagn et al., 2006; Гупта и др., 2010).

      Хотя теоретический дополнительный генетический вклад повторяющегося родительского родителя попкорна составлял 0,0625 между поколениями BC 2 и BC 3 , эмпирические исследования секвенирования популяции обратного скрещивания различных растений указывают на высокую изменчивость между популяциями обратного скрещивания и довольно непредсказуемые генетические пропорции (Uptmoor et al., 2006; Ramos et al., 2011; Thakur et al., 2014). Таким образом, без секвенирования BC 2 F 5 и BC 3 F 4 инбредных линий, степень и расположение выбранных локусов QPM и попкорна, а также окончательный генетический вклад обоих родителей остаются неизвестными.Будущее выращивание попкорна может принести больше пользы за счет обратного скрещивания после того, как были идентифицированы генетические местоположения признаков попкорна и генов, восстанавливающих эндосперм QPM, и модификаторов аминокислот. Предыдущие и текущие исследования предполагали генетическое местонахождение обоих признаков появления и opaque-2 родственных генов, но выяснение точного местоположения, связанного с доступными генетическими маркерами, остается недоступным (Holding et al., 2008, 2011; Li et al., 2009 ; Gutiérrez-Rojas et al., 2010; Wu et al., 2010; Бабу и др., 2015; Pandey et al., 2015; Коан и др., 2019; Senhorinho et al., 2019). Потенциал для проверенных маркеров в обоих наборах генов в сочетании со снижающейся стоимостью геномного секвенирования открывает возможности для будущего внедрения систем селекции попкорна, которые направлены на улучшение агрономии в пределах сортов попкорна при сохранении синонимичных характеристик попкорна.

      Одновременные сравнения поколений, прошедших обратное скрещивание, и линий ConAgra Elite

      Быстрое разведение инбредных линий BC 3 F 4 QPP позволило провести одновременное сравнение между производными гибридами BC 2 и BC 3 , а также между всеми линиями QPP и элитными сортами ConAgra.Повреждение ядра плесенью, испытанное в районе Мид, Северо-Восток, дало возможность протестировать восприимчивость к вредителям между линиями попкорна BC 2 -, BC 3 — и без QPM. Первоначальная интрогрессия opaque-2 без необходимых модификаторов эндосперма в различные линии зубчатой ​​кукурузы привела к ухудшению агрономических характеристик и более высокой восприимчивости к вредителям / гнили (Prasanna et al., 2001). За исключением h3, гибрида QPP, уступающего по всем другим оцененным признакам, все линии QPP не испытали существенно различающейся восприимчивости к плесени по сравнению с сортами ConAgra.Эти результаты предполагают успешную интрогрессию исходного аллеля dent opaque-2 и основных модификаторов эндосперма в фон попкорна. При сравнении популяций обратного скрещивания QPP результаты показали, что дополнительное обратное скрещивание попкорна несколько улучшило характеристики всплывания QPP по сравнению с гибридами, производными от BC 2 ; тем не менее, средние признаки появления QPP были все еще значительно ниже, чем у линий ConAgra. Средние измерения объема расширения BC 2 для гибридов составили примерно 64% ​​от объемов ConAgra, в то время как гибриды BC 3 заняли 71% от основных значений объема.Значения OCFSI показали сходные соотношения между линиями QPP и ConAgra, в то время как измерения популяции были одинаковыми для всех гибридов. Несоответствие между ранее опубликованными восстановленными обратным скрещиванием признаками поппинга и инбредами QPP, вероятно, связано с мерами отбора, применяемыми во время инбридинга (Coan et al., 2019). Без известных местоположений и степени необходимой интрогрессии локусов QPM dent кукурузы и с известными связями фаз отталкивания между урожайностью и объемом разрастания, а также с присущим им выбором агрономических характеристик на протяжении всего производства инбредных линий QPP, непреднамеренный отбор против объема разрастания мог быть использован (Sprague and Дадли, 1988; Дофинг и др., 1991; Зиглер и Эшман, 1994; Ren et al., 2018).

      Несмотря на то, что после дополнительного обратного скрещивания с исходными родителями синонимичные характеристики всплывания не были достигнуты, линии, производные от BC 3 , показали значительные улучшения в этих характеристиках по сравнению с линиями, производными от BC 2 . Тем не менее, компромисс между послевкусием и агрономическими характеристиками был очевиден, поскольку линии, производные от BC 2 , имели значительно лучшие средние показатели урожайности. Таким образом, использование ранее опубликованного уравнения системы ранжирования 2020 оказалось полезным для целостного различения гибридов, производных от BC 2 и BC 3 , и сравнения их по отдельности с исходными линиями попкорна (Parsons et al., 2020). В этом анализе оценка урожайности машинного сбора заменила ранее использованные агрономические признаки, измеренные вручную. Кроме того, надежный анализ признаков выскакивания позволил более точно измерить качество выскакивания по сравнению с предыдущим анализом, который позволил придать стекловидности меньший вес в настоящей выборке (Parsons et al., 2020). Содержание лизина было введено в уравнение, чтобы придать одинаковый вес агрономическим, хлопковым и качественным характеристикам протеина. Следовательно, содержание связанного с белком лизина эндосперма, выход и объем разрастания считались равнозначными при окончательном отборе гибридов QPP, и каждому из них был присвоен экономический вес 0.90. Измерения размера хлопьев и численности также учитывались в окончательных рейтингах, чтобы выделить первоклассное появление в QPP, но этим характеристикам было придано относительно меньшее влияние из-за снижения экономических весов. Стекловидность в наименьшей степени влияла на общий рейтинг, но все же имела значение в рейтинговой системе из-за своей связи со всеми основными чертами (лизин, агрономия и поппинг). Окончательный рейтинг определил лучшие гибриды QPP как h20, h4, h5, h2, H6 и H9 в соответствующем порядке. Хотя наивысшим рейтингом был гибрид, производный от BC 3 , BC 2 — скрещивания h4, h5 и h2 превосходили BC 3 — скрещивания H6 и H9.Эти результаты предполагают, что популяция, подвергнутая третьему обратному скрещиванию, не дала удовлетворительных результатов, чтобы гарантировать время, средства и усилия, затраченные на ее создание. Однако значительные улучшения производных от BC 3 гибридов H7 и h20 по сравнению с их аналогами BC 2 h3 и H5, соответственно, демонстрируют особый потенциал в этой схеме селекции, если генетический отбор может быть проведен более конкретно. В целом, шесть наиболее элитных гибридов произошли в равной степени от популяции BC 2 и популяции BC 3 , что сделало возможным рассмотрение разнообразного набора потенциально востребованных сортов QPP.

      Морфология чешуек отобранных гибридов QPP

      Все гибриды QPP демонстрировали различные смеси морфологии хлопьев бабочки и грибов. h4, H7 и H9 продемонстрировали наибольшее сходство со своими гибридами ConAgra, за которыми следовали h3 и H8. h2 и H6, гибриды от одного и того же скрещивания QPP, но разных поколений скрещенных назад, проявляли одинаковое морфологическое поведение в основном в смеси хлопьев. h5 и H9 наиболее сильно различались между бэккроссами по этому признаку. H9 показал большую часть хлопьев бабочки, тогда как h5 имел большую часть смеси, затем несколько образцов выскочили только из бабочек, а один образец выскочил только из грибов.Этот морфологический профиль аналогичным образом отражался в h20, хотя у h20 был еще один образец, помеченный как «гриб», а не смесь. Интересно, что у H5 был только один смешанный образец; остальное выскочило либо исключительно бабочка, либо исключительно гриб. Влияние местоположения на морфологию появления этих конкретных гибридов было значительным (дополнительная таблица 11). Из девяти проанализированных образцов три образца H5, взятые из Линкольна, штат Нью-Йорк, были сочтены «бабочкой», за ними следовало вторичное местоположение, где были представлены два образца бабочки и один образец грибов, и, наконец, в местоположении Колби, штат Канзас, было два образца грибов и один смешанный. образец.Подобно H5, у h20 было три «смешанных» пробы в Линкольне, штат Северная Каролина, за которыми следовали две пробы бабочки и одна смешанная проба в Миде, Северная Каролина, а также две пробы грибов и одна смешанная проба, взятые из Колби, штат Канзас. Предыдущие исследования, посвященные анализу влияния окружающей среды на морфологию хлопьев попкорна, ограничены, но одно исследование, проведенное в 2012 году, выявило место произрастания как важный фактор в морфологии хлопьев попкорна, хотя степень влияния местоположения на морфологию по сравнению с другими внутренними и внешними факторами оставалась неуловимой (Sweley et al. al., 2012). Небольшое количество гибридов и образцов, протестированных в каждом месте, ограничивало идентификацию этих результатов конкретных морфологических реакций чешуек на определенные воздействия окружающей среды; однако, как и в исследовании 2012 года, было обнаружено, что влияние местоположения на морфологию хлопьев является значительным и заслуживает рассмотрения при типизации будущих морфологий хлопьев попкорна.

      Сорта

      QPP демонстрируют повышенный уровень лизина по сравнению с линиями ConAgra Elite в муке из сырых и воздушно-приготовленных ядер

      Предыдущие исследования показали, что уровни триптофана и лизина в пределах одного и того же сорта кукурузы положительно коррелируют по относительному содержанию во фракции зеина и, следовательно, во всем эндосперме (Hernandez and Bates, 1969; Krivanek et al., 2007; Olakojo et al., 2007; Ren et al., 2018; Parsons et al., 2020). Из-за разрушения связанного с белком триптофана кислотным гидролизом уровни лизина были восстановлены и использованы в качестве эталона для повышения уровня лизина и триптофана, производного от opaque-2-, по сравнению с разновидностями ConAgra (Angelovici et al., 2013; Yobi and Angelovici, 2018). ). Уровни связанного с белком лизина в сырой муке показали значительную разницу между сортами ConAgra и сортами QPP, и не было обнаружено значительных различий между сортами QPP, производными от BC 2 и BC 3 .В среднем сорта QPP содержали 0,320 ± 0,039, а сорта ConAgra содержали 0,189 ± 0,019 г / 100 г связанного с белком лизина в сырой муке, соответственно. После вспенивания уровни лизина снизились на ~ 30% до 0,235 ± 0,042 г / 100 г лизина и 0,128 ± 0,006 г / 100 г лизина у сортов QPP и ConAgra, соответственно. Даже после аэрозольного вспенивания сорта QPP сохранили больше лизина, чем было произведено в муке из сырых ядер попкорна без QPM.

      Предыдущий анализ содержания лизина попкорна QPP и не-QPP показал немного более высокий уровень связанного с белком лизина, чем показано в текущем исследовании (Parsons et al., 2020). Однако, учитывая, что соотношение между уровнями лизина попкорна без QPM и QPM является согласованным между анализами, эти результаты в совокупности предполагают стабильное и надежное увеличение содержания лизина в разновидностях попкорна, приготовленных с помощью воздушно-капельной кукурузы, по сравнению с продаваемым в настоящее время попкорном. С точки зрения контекста, человеку весом 68 кг (150 фунтов) обычно рекомендуется принимать 2,108 г лизина в день (Elango et al., 2009). Эти результаты предполагают, что эквивалент одного мешка с воздушной кукурузой QPP (∼47 г), который можно использовать в микроволновой печи, соответствует 5.2% этой суточной потребности в лизине вместо 2,8% удовлетворения, доступного благодаря коммерчески доступным сортам попкорна.

      Заключение: окончательный отбор гибридов QPP

      Целостная оценка гибридов QPP с контролем ConAgra позволила выполнить первую задачу этого исследования, одновременное сравнение генетического фона BC 2 F 5 и BC 3 F 4 с элитными линиями ConAgra для далее выберите QPP, наиболее подходящий для потенциальной коммерциализации.Эта оценка показала, что гибриды BC 3 имели значительно более низкую урожайность по сравнению с группами ConAgra и BC 2 , но сорта BC 3 имели значительно улучшенные признаки появления по сравнению с гибридами BC 2 . По всем оцененным признакам, в частности, по объему роста, OCFSI и популяции, все три группы имели значительно разные средние значения: лидировали элитные линии ConAgra, за ними следовали BC 3 F 4 производные от гибриды QPP и, наконец, BC 2 F 5 производных гибридов QPP.Поскольку только две линии, производные от BC 3 , показали лучшие результаты, чем их аналоги, производные от BC 2 , в окончательном рейтинге с использованием системы рейтинга 2020 года, неясно, оправданы ли время и ресурсы, потраченные на введение еще одного обратного скрещивания с этой зародышевой плазмой. Таким образом, это исследование может вызвать осторожность в отношении дальнейшего обратного скрещивания других вмятины с помощью программ селекции попкорна, направленных на улучшение агрономических и качественных признаков. Однако значительное улучшение H7 и h20 по сравнению с h3 и H5 демонстрирует успех, хотя и довольно неизбирательный, для этого плана разведения.Значительное увеличение связанного с белком лизина во всех гибридах QPP, кроме h3, по сравнению с элитными линиями ConAgra в лопнувших хлопьях подтверждает успешную интрогрессию аллеля QPM opaque-2 и необходимых генов-модификаторов эндосперма для восстановления поппинга. Кроме того, PCA профиля связанного с белком аминокислотного белка объединяет все QPP отдельно от линий ConAgra, за исключением h3. h3 показал наихудшие результаты из всех гибридов в нескольких различных анализах, имея самое низкое содержание связанного с белком лизина, объем разрастания, OCFSI, второе место по численности, третье место по стекловидности и восьмое место по урожайности.И наоборот, гибриды QPP h20, h4, h5, h2, H6 и H9 показали высокие значения лизина и в целом дали более высокие рейтинговые значения по сравнению с четырьмя другими гибридами QPP. Использование системы ранжирования 2020 позволило провести комплексную оценку агрономических характеристик гибрида, его качества приготовления и качества белка, а также обеспечило окончательный выбор QPP. Эта система рейтинга является доступным и доступным ресурсом, пригодным для гибридных программ производства и тестирования. Гибриды QPP, выделенные в этой рейтинговой системе, продемонстрировали достаточные агрономические оценки и качественные характеристики, а также значительно более высокое содержание лизина по сравнению с сортами, продаваемыми в настоящее время, что свидетельствует об их потенциальной конкурентоспособности.Кроме того, недавний сенсорный анализ, сравнивающий гибриды h25, h24 и шесть QPP, показал, что потребители предпочитают большее разнообразие вкуса и текстуры QPP по сравнению с линейками, продаваемыми в настоящее время. Этот вкусовой тест определил, что гибриды QPP h5, H8 и h4 являются предшественниками по потребительской симпатии. Взятые вместе, эти результаты предполагают, что гибриды QPP h5 и h4 являются главными кандидатами для дальнейшего тестирования и вполне пригодны для коммерциализации.

      Заявление о доступности данных

      Исходные материалы, представленные в исследовании, включены в статью / дополнительные материалы, дальнейшие запросы можно направлять соответствующим авторам.

      Авторские взносы

      LP и DH разработали исследование. YR и DH произвели инбредные линии BC 2 F 5 . LP, AY, RA, OR и DH провели исследование. LP, AY, RA и DH проанализировали данные. Рукопись написали LP и DH. Все авторы внесли свой вклад в статью и одобрили представленную версию.

      Конфликт интересов

      Авторы заявляют, что это исследование получило финансирование от ConAgra Brands ® . Кроме того, OR использовала компания ConAgra Brands ® .Спонсор не участвовал в разработке, сборе, анализе, интерпретации данных, написании этой статьи или решении представить ее для публикации.

      Остальные авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

      Финансирование

      Эта работа была поддержана ConAgra Brands ® и Университетом Небраски – Линкольн.

      Благодарности

      Мы выражаем признательность ConAgra Brands ® за постоянное финансирование, сотрудничество и предоставление зародышевой плазмы попкорна.Мы очень благодарны Т. Дж. МакЭндрю, Дженни Стеббинг и Ронни Янссен из Университета Небраски-Линкольна за их постоянную поддержку на протяжении всей этой инбредной и гибридной программы попкорна. Мы благодарим доктора Роба Эйкена из Северо-Западного научно-исследовательского центра и Университета штата Канзас за помощь в посадке, уходе и сборе урожая на испытательном участке Колби, штат Канзас.

      Дополнительные материалы

      Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https: //www.frontiersin.org / article / 10.3389 / fpls.2021.658456 / full # additional-material

      Список литературы

      Аддельман, С. (1969). Обобщенный рандомизированный блочный дизайн. Am. Статист. 23, 35–36.

      Google Scholar

      Ангеловичи Р., Липка А. Э., Дисон Н., Гонсалес-Хорхе С., Лин Х. и Чепела Дж. (2013). Полногеномный анализ уровней аминокислот с разветвленной цепью в семенах Arabidopsis . Растительная клетка 25, 4827–4843. DOI: 10.1105 / tpc.113.119370

      PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

      Бабу, Б.К., Агравал, П. К., Саха, С., и Гупта, Х. С. (2015). Картирование QTL для модификаторов opaque2, влияющих на содержание триптофана в качественной белковой кукурузе, с использованием геномных SSR и SSR на основе генов-кандидатов метаболического пути лизина и триптофана. Rep. Растительных клеток 34, 37–45.

      Google Scholar

      Бабу Р., Наир С. К., Кумар А., Рао, Х. С., Верма П., Гахалаин А. и др. (2006). Сопоставление QTL для способности выталкивания в кроссе из попкорна и кремня. Теор. Прил. Genet. 112, 1392–1399.

      Google Scholar

      Бабу Р., Наир С. К., Кумар А., Венкатеш С., Секхар Дж. К. и Сингх Н. Н. (2005). Обратное скрещивание с использованием маркеров двух поколений для быстрого преобразования нормальных линий кукурузы в качественную белковую кукурузу (QPM). Теор. Прил. Genet. 111, 888–897. DOI: 10.1007 / s00122-005-0011-6

      PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

      Коан, М. М., Пинто, Р. Дж. Б., Куки, М. К., Амарал, А. Т. младший, Фигейредо, А.S.T., Scapim, C.A. и др. (2019). Исследование наследования для увеличения роста попкорна по сравнению с генотипами кремневой кукурузы. Агрон. J. 111, 2174–2183. DOI: 10.1007 / s00122-006-0242-1

      PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

      Коллард, Б., Захуфер, М., Брауэр, Дж., И Панг, Э. (2005). Введение в маркеры, картирование локусов количественных признаков (QTL) и выбор с помощью маркеров для улучшения сельскохозяйственных культур: основные концепции. Euphytica 142, 169–196.DOI: 10.1007 / s10681-005-1681-5

      CrossRef Полный текст | Google Scholar

      Крамбейкер Д. Э., Джонсон И. и Элдридж Дж. (1949). Наследование объема хлопка и связанных символов в скрещиваниях между попкорном и вмятиной кукурузы. Агрон. J. 41, 207–212. DOI: 10.2134 / agronj1949.00021962004100050009x

      CrossRef Полный текст | Google Scholar

      да Силва В., Видал Б., Мартинс М., Варгас Х., Перейра К., Зербетто М. и др. (1993). Что делает попкорн популярным. Природа 362: 417. DOI: 10.1038 / 362417a0

      CrossRef Полный текст | Google Scholar

      Дофинг С. М., Кроз-Мейсон Н. и Томас-Комптон М. А. (1991). Наследование объема расширения и урожайности в двух кроссах попкорн × вмятина кукурузы. Crop Sci. 31, 715–718. DOI: 10.2135 / cropci1991.0011183X003100030035x

      CrossRef Полный текст | Google Scholar

      Эланго Р., Болл Р. О. и Пенчарз П. Б. (2009). Потребности человека в аминокислотах: особое внимание уделяется метаболической доступности аминокислот. Аминокислоты 37:19. DOI: 10.1007 / s00726-009-0234-y

      PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

      Геверс, Х. О., и Лейк, Дж. К. (1992). «Развитие модифицированной кукурузы opaque-2 в Южной Африке», в Quality Protein Maize , ed. Э. Т. Мерц (Сент-Пол, Миннесота: AACC), 49–78.

      Google Scholar

      Гупта П. К., Кумар Дж., Мир Р. Р. и Кумар А. (2010). Маркерная селекция как компонент традиционной селекции растений. Растение Порода. Ред. 33, 145–217. DOI: 10.1002 / 9780470535486.ch5

      CrossRef Полный текст | Google Scholar

      Гутьеррес-Рохас А., Бетран Дж., Пол Скотт М., Атта Х. и Менз М. (2010). Локусы количественных признаков модификации эндосперма и содержание аминокислот в качественном белке кукурузы. Crop Sci. 50, 870–879.

      Google Scholar

      Эрнандес, Х. Х. и Бейтс, Л. С. (1969). Модифицированный метод быстрого анализа триптофана кукурузы.Информационный бюллетень СИММИТ № 13. Мексика: СИММИТ.

      Google Scholar

      Хикс, Д. Р., Клауд, Х. А. (1991). Расчет усадки зерна кукурузы в результате механической сушки. West Lafayette, IN: Публикация Национального справочника по кукурузе NCH-61.

      Google Scholar

      Holding, Д. Р., Хантер, Б. Г., Чанг, Т., Гиббон, Б. К., Форд, К. Ф. и Бхарти, А. К. (2008). Генетический анализ локусов модификатора opaque2 в качественной белковой кукурузе. Теор.Прил. Genet . 117, 157–170. DOI: 10.1007 / s00122-008-0762-y

      PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

      Holding, Д. Р., Хантер, Б. Г., Клинглер, Дж. П., Ву, С., Го, X., и Гиббон, Б. С. (2011). Характеристика QTL модификатора opaque2 и генов-кандидатов в рекомбинантных инбредных линиях, полученных из инбредного белка кукурузы качества K0326Y. Теор. Прил. Genet. 122, 783–794.

      Google Scholar

      Криванек, А.Ф., Де Гроот, Х., Гунаратна, Н.С., Диалло, А.О., и Фризен, Д. (2007). Селекция и распространение качественной белковой кукурузы (QPM) для Африки. Afr. J. Biotechnol. 6, 312–324.

      Google Scholar

      Ли Ю., Донг Ю., Ню С. и Цуй Д. (2007). QTL для характеристик попкорна. Растение Порода. 126, 509–514. DOI: 10.1111 / j.1439-0523.2007.01372.x

      CrossRef Полный текст | Google Scholar

      Ли Ю., Ву С., Дун Ю., Чжан Ю. и Ли З. (2004).Изучение характеристик посадки различных популяций при обычном скрещивании кукурузы × попкорна. J. Maize Sci. 2, 3–6.

      Google Scholar

      Ли, Ю., Ву, С., Чжан, Ю., Ван, Ю., Ду, З., и Ван, К. (2003). Изучение комбинирующей способности передовых племенных отобранных линий от кроссов попкорна и нормальной кукурузы и их использования. Acta Agri. Boreali Sin. 4, 46–50.

      Google Scholar

      Ли, Ю. Л., Донг, Ю., Ню, С., Цуй, Д., Ван, Ю., Лю Ю. и др. (2008). Идентификация агрономически благоприятных аллелей локусов количественных признаков от инбредной Dan232 зубчатой ​​кукурузы с использованием расширенного анализа QTL обратного скрещивания и сравнения с популяцией F2: 3 в попкорне. Мол. Порода. 21, 1–14. DOI: 10.1007 / s11032-007-9104-z

      CrossRef Полный текст | Google Scholar

      Ли Ю. Л., Донг Ю. Б., Ню С. З. и Цуй Д. К. (2009). Идентификация QTL для характеристик поппинга с использованием популяции BC2F2 и сравнение с его популяцией F2: 3 в попкорне. Agric. Sci. Китай 8, 137–143. DOI: 10.1016 / S1671-2927 (09) 60020-1

      CrossRef Полный текст | Google Scholar

      Лю Х., Ши Дж., Сунь К., Гонг Х., Фань Х. и Цю Ф. (2016). Дублирование гена обеспечивает повышенную экспрессию γ-зеина 27 кДа для модификации эндосперма в качественном белке кукурузы. Proc. Natl. Акад. Sci. США 113, 4964–4969. DOI: 10.1073 / pnas.1601352113

      PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

      Мац, С.А. (1984). «Закуски на основе попкорна», в Snack Food Technology , ed. С. Мац (Дордрехт: Springer), 138–149.

      Google Scholar

      Mordor Intelligence (2018). Рынок попкорна — рост, тенденции и прогноз (2020-2025). Хайдарабад: разведка Мордора.

      Google Scholar

      Ниу А., Ли Ю. и Чен Х. (2008). Характеристики выталкивания линий BC_2S_1, полученных из обычного кросса кукуруза × попкорн, и их отношения с символами ядра початка. J. Henan Ag. Sci. 1, 20–22.

      Google Scholar

      Олакодзё, С. А., Омуети, О., Аджомале, К., и Огунбодеде, Б. А. (2007). Разработка качественной белковой кукурузы: биохимическая и агрономическая оценка. Троп. Субтроп. Агроэкосист. 7, 97–104.

      Google Scholar

      Пандей Н., Хоссейн Ф., Кумар К., Вишвакарма А. К., Мутхусами В., Саха С. и др. (2015). Молекулярная характеристика модификаций эндосперма и аминокислот у качественных белковых инбредов кукурузы. Растение Порода. 135, 47–54.

      Google Scholar

      Парсонс, Л., Рен, Ю., Йоби, А., Херст, П., Ангеловичи, Р., Родригес, О., и др. (2020). Производство и отбор качественных белковых гибридов попкорна с использованием новой системы ранжирования и комбинированных оценок возможностей. Фронт. Plant Sci. 11: 698. DOI: 10.3389 / fpls.2020.00698

      PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

      Перейра, М. Г., и Амарал Джуниор, А. Т. (2001). Оценка генетических компонентов попкорна на основе вложенного дизайна. Урожайная порода. Прил. Биотехнология . 1, 3–10. DOI: 10.13082 / 1984-7033.v01n01a01

      CrossRef Полный текст | Google Scholar

      Прасанна Б. М., Васал С. К., Кассахун Б. и Сингх Н. Н. (2001). Качественный протеин кукурузы. Curr. Sci. 81, 1308–1319.

      Google Scholar

      R Основная команда (2018). R: язык и среда для статистических вычислений. Вена: Фонд R для статистических вычислений.

      Google Scholar

      Рамос, Х., Перейра, М., Силва, Ф., Гонсалвес, Л., Пинто, Ф., де Соуза Филью, Г. и др. (2011). Генетическая характеристика растений папайи ( Carica papaya L.), полученных от первого поколения обратного скрещивания. Genet. Мол. Res. 10, 393–403.

      Google Scholar

      Рен, Ю., Йоби, А., Маршал, Л., Ангеловичи, Р., Родригес, О., и Холдинг, Д. (2018). Создание и оценка модифицированного попкорна Opaque-2 предлагает путь к качественному белку попкорна. Фронт.Plant Sci. 9: 1803. DOI: 10.3389 / fpls.2018.01803

      PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

      Роббинс, В. А., Эшман, Р. Б. (1984). Корреляция разрастания попкорна между родителями и потомством в потомстве скрещиваний зубчатой ​​кукурузы x попкорна и кремневой кукурузы x попкорна. Crop Sci. 24, 119–121. DOI: 10.2135 / cropci1984.0011183X002400010027x

      CrossRef Полный текст | Google Scholar

      Семагн К., Бьёрнстад А. и Нджионджоп М. (2006).Обзор методов молекулярных маркеров для растений. Afr. J. Biotech. 5, 2540–2568.

      Google Scholar

      Сеньориньо, Х. Дж. С., Коан, М. М. Д., Марино, Т. П., Куки, М. К., Пинто, Р. Дж. Б., Скапим, К. А. и др. (2019). Общегеномное исследование ассоциации распространения попкорна в зародышевой плазме тропического попкорна и полевой кукурузы. Crop Sci. 59, 2007–2019. DOI: 10.2135 / cropci2019.02.0101

      CrossRef Полный текст | Google Scholar

      Силва, Ф., Pereira, M., Campos, W., Damasceno-Juìnior, P., Daher, R., Pereira, T., et al. (2007). Мониторинг генетической изменчивости родительской папайи Formosa гибрида UENF / CALIMAN 01 с помощью RAPD. Урожайная порода. Прил. Biotechnol. 7, 36–42.

      Google Scholar

      Смит К., Уэйн Дж. Б. и Рунге Е. С. А. (2004). Кукуруза. Хобокен, Нью-Джерси: Джон Вили.

      Google Scholar

      Спраг, Г. Ф., и Дадли, Дж. У. (1988). Кукуруза и улучшение кукурузы. Мэдисон, Висконсин: Американское агрономическое общество.

      Google Scholar

      Свели, Дж., Мейер, М., Роуз, Д., и Джексон, Д. (2012). Влияние гибрида, окружающей среды, добавления масла и мощности микроволн на морфологию взбитого попкорна. J. Cereal Sci. 56, 276–281. DOI: 10.1016 / j.jcs.2012.05.009

      CrossRef Полный текст | Google Scholar

      Тан Ю., Хорикоши М. и Ли В. (2016). ggfortify: Единый интерфейс для визуализации статистических результатов популярных пакетов R. Р. Дж. 8: 2, 478–489.

      Google Scholar

      Такур В., Тивари С. и Трипати Н. (2014). Исследования процента восстановления генома для Opaque2, интрогрессированного в популяции обратного скрещивания, для селекции качественной белковой кукурузы с помощью маркеров. Trends Biosci. 7, 1897–1901.

      Google Scholar

      Топпинг Р. (2011). Просто зовите меня Орвилл: История Орвилла Реденбахера. West Lafayette, IN: Purdue University Press.

      Google Scholar

      Аптмур, Р., Wenzel, W., Ayisi, K., Donaldson, G., Gehringer, A., Friedt, W., et al. (2006). Вариация доли генома рекуррентного родителя в BC1 и ее связь с показателями урожайности при разведении сорго (Sorghum bicolor) в условиях с низким потреблением. Растение Порода. 125, 532–534. DOI: 10.1111 / j.1439-0523.2006.01270.x

      CrossRef Полный текст | Google Scholar

      Уоллес, Дж. К., Лопес, М. А., Пайва, Э. и Ларкинс, Б. А. (1990). Новые методы экстракции и количественного определения зеинов показывают высокое содержание гамма-зеина в модифицированной кукурузе непрозрачной-2. Plant Physiol. 92, 191–196. DOI: 10.1104 / стр.92.1.191

      PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

      Ву Ю., Холдинг Д. Р. и Мессинг Дж. (2010). γ-зеины необходимы для модификации эндосперма качественной белковой кукурузы. Proc. Natl. Акад. Sci. США 107, 12810–12815. DOI: 10.1073 / pnas.1004721107

      PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

      Циглер, К. Э. (2001). «Попкорн», в Speciality Corn , 2nd Edn, ed.А. Р. Халлауэр (Бока-Ратон, Флорида: CRC Press), 199–234.

      Google Scholar

      Циглер К. Э. и Эшман Б. (1994). «Попкорн», в Speciality Corns , ed. А. Р. Халлауэр (Нью-Йорк, Нью-Йорк: CRC Press), 189–223.

      Google Scholar

      .

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.

*
*